取 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖並混合 (0、20、40、60、80、100、
120 mM) 葡萄糖或果糖 (SIGMA，Cat#F3510) (在 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 中) 在 20℃ 和 40℃ 反應 24 小時，並以聚合
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3. GI-coupled TS
取 20 μg GI 與 5 μg DrTS 於 125 mM 麥芽糖 (在 20 mM sodium [validoxylamine A (VAA) (自製) (0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mM)、validamycin A (VA) (Duchefa，Cat#V0170) (0、0.02、0.04、0.06、
0.08、0.1、0.12 mM)、kanamycin A (Acroscat，Cat #BP906-5) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、acarbose (SIGMA，Cat #A8980) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)、azactidine (Acros，Cat#22662) (0、20、
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40、60、80、100、120 mM)、lactose (Acros，Cat#36889) (0、20、40、
60、80、100、120 mM)、lactulose (Fluka，Cat#61360) (0、20、40、
60、80、100、120 mM) 或 isomaltulose (SIGMA，Cat #P2007) (0、20、
40、60、80、100、120 mM)] 反應於 20℃、24 小時，並以聚合酶連 鎖反應器於 95℃、10 分鐘以中止酵素反應，產物分析以 HPLC 定 量。
十、 利用酵素水解或酸水解生產 validoxylamine A (VAA) 1. 酵素水解
(a) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解
於 100 μL 的總反應體積中，取 80 μL 的 β-glucosidase (medium)
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將水解樣品以 13 mm NYLON 0.22 μm syringe filter (membrane solutions) 過濾，取 10 μL 的樣品以 HPLC；管柱：分析級逆相層析管 柱 (Syncronis aQ)；管柱恆溫箱：30℃；流速：1 mL/min；偵測器：
光二極體陣列式偵測器 (L-2455)；幫浦：SFD 2100 Quaternary gradient pump；溶劑為 methanol：ddH2O：disodium hydrogen phosphate = 2.5 : 96.5 : 1；分析時間：15 min；波長：210 nm，進行水解反應後的產物 分析。依時間順序分別為 VAA (約 5:10 出現) 與 VA (約 7:00 出現)。
在酸水解時由於 pH 值的減少，因此反應物及產物出現的訊號鋒時間 提早，依時間順序分別為 VAA (約 3:50 出現) 與 VA (約 4:50 出現)。
4. VAA 純化
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將分析後的 10 mL 酸水解樣品以 7 g Ba(OH)2 中和至 pH 5-6 並 離心去沉澱物後過濾，之後將 10 mL 樣品以低流速通過 2 mL 陽離子 樹脂管柱 (Aberlite ® IR-120 [H+])，並以 10 mL、1M NH4OH 沖洗下來。
將沖洗的樣品濃縮成 1 mL 後，以低流速通過 2mL 陰離子樹脂管柱 (Dowex® 1X2 [OH–])，並以 10 mL 二次去離子水沖洗下來，以進一步 的得到純化的 VAA，並利用冷凍乾燥濃縮機進行乾燥濃縮，可得到 白色結晶狀的 VAA。
5. 管柱再生與離子交換
原買入的陽離子樹脂 (Aberlite® IR-120) 帶著 Na+ 離子，利用樹 脂三倍體積的 1M HCl 以低流速通過樹脂，讓 H+ 離子競爭 Na+ 離子，
使得樹脂帶 H+ 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。
原買入的陰離子樹脂 (Dowex® 1X2) 帶著 Cl- 離子，利用樹脂三 倍體積的 1M NaOH 以低流速通過樹脂，讓 OH– 離子競爭 Cl- 離子，
使得樹脂帶 OH– 離子，之後以二次去離子水平衡及保存樹脂。
38 有水解活性的水解酶 (hydrolase)，如：Halothermothrix Orenii
α-amylase、Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase 或 Deepest Sea
Bacteria α-glucosidase；另一類是具有異構化 (isomerizaton) 活性的蔗 糖異構酶 (sucrose isomerase，SI)，如：MutB (PDB entry: 1ZJA，
Pseudomonas mesoacidophila MX-45 trehalulose synthase)、SmuA (PDB entry: 3GBD，Protaminobacter isomaltulose synthase) 或 PalI (PDB entry: 1M53，Klebsiella sp LX3 isomaltulose synthase)。與 DrTS 胺基酸序列最相似的蛋白質為 SI 的 MutB，其胺基酸序列與 DrTS
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40 Thr154、Phe174 與 Gln254。
在 SI 中，只有一個催化的水分子 Wat4248 (MutB 編號) 會直接參 與水解反應 (Ravaud et al., 2007, 2009)，在 MutB 的結構中，有個親 水性的 Asn325 (MutB 編號，圖七) 會去結合這個催化的水分子。疊 合 DrTS 與 SI 的立體結構後，在 DrTS 的相同的位置上也有個親水
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N317A (AAC→GCG)、N317F (AAC→TTC)、N317L (AAC→CTG)、
R316G (CGC→GGC) 與 N253F (AAC→TTC)。
依據方法三.5. 進行點突變，並以自動核苷酸定序圖譜分析 (圖十 一)，定序結果與野生型 DrTS 基因比對，確認突變皆已完成，且並
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的量則是逐漸減少，取而代之的是果糖的生成量則是逐漸增加，反應 至 24 小時於 20℃ 與 40℃ 皆約 50% 的果糖生成 (圖二十五)。
4. GI-coupled DrTS
依據方法八.3. 進行 GI-coupled DrTS。隨著反應時間的增加，加 入有活性的 GI 會比加入已失活性的 GI 的其 DrTS 海藻糖生成量要
47 acarbose 的濃度增加，正逆反應的活性會逐漸減少。當 acarbose 增加 至 120 mM 時，正反應海藻糖轉化率會減少 16.2%，逆反應麥芽糖轉
melibiose 或 isomaltulose) 對 DrTS 的正逆反應活性影響
依據方法九進行海藻糖類似物對 DrTS 的正逆反應活性影響。隨
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著 azactidine、lactulose、lactose、sucrose、thiodiglucoside、melibiose 或 isomaltulose 的濃度增加，正逆反應的活性不受影響。
六、 利用酵素水解或酸水解生產 VAA 1. 水解實驗
(1) Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解反應
依據方法十.1. 進行 Pichia pastoris β-glucosidase (medium) 水解 反應。隨著反應時間的增加，VA 訊號峰面積約 16%，並沒有隨著
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積的生成 (圖三十二 D)。
(5) H2SO4 水解反應
依據方法十.2. 進行 H2SO4 水解反應。反應至 20 分鐘，VA 被完 全作用，且約有 45% VAA 訊號峰面積的生成。
2. VAA 的純化
此後加入 Ba(OH)2 中和至 pH 5 後離心過濾，VAA 訊號峰面積並 沒有減少，此後將樣品通入 Aberlite ® IR-120 [H+] 管柱，發現所流出 的 flowthrough 其 VAA 只剩約 1/3 訊號峰面積，表示有約 2/3 訊號 峰面積的 VAA 被管柱抓住，此後利用 NH4OH 進行沖洗並濃縮後，
通入 Dowex ® 1X2 [OH–] 管柱並以二次去離子水進行沖洗能得到高 純度的 VAA (圖三十三)，此後利用冷凍乾燥濃縮機進行凍乾，可得 到約 0.1 g 的 VAA 白色粉末。
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isomaltulose) 及 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (α-D-glucopyranoside-1,1-D- fructofuranosyl，trehalulose)，會有微弱的水解活性產生副產物葡萄糖 與果糖 (D-fructose)。SI 的酵素結構之間是十分相似 (高達 80% 結構 疊合的一致性)，不同的菌種的 SI 其異麥芽酮糖與海藻酮糖的產物比 率也不相同。SmuA 與 PalI 主要催化生成 α-1,6-鍵結的異麥芽酮糖，
而 MutB 則主要催化生成 α-1,1-鍵結的海藻酮糖 (Ravaud et al., 2007, 2009; Zhang et al., 2003a)。
目前 MutB、SmuA 與 PalI 的酵素結構已經被發表了 (附錄十)。
這些酵素包含了三個區域 (domain) ，A 區域為主要負責催化功能的 區域，由 (β/α)8 的桶狀結構 (TIM barrel) 所組成，以及一個富有環狀 結構 (loop) 的 B 區域和幾個反向平行的 β-折疊 (β-sheet) 的 C 區域。
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三個催化性胺基酸 Asp200、Glu254 與 Asp327(MutB 編號)，被證明 主要負責催化異麥芽酮糖與海藻酮糖的異構化。Asp200 為親核體 (nucleophile) 會去攻擊糖苷鍵，之後形成 β 鍵結共價結合的中間產物 (intermediate)，這反應並由 Glu254 酸/鹼催化劑 (acid/base catalyst) 與 Asp327 過度狀態的穩定者 (transition-state stabilizer) 所促成
(Aroonnual et al., 2007; Lee et al., 2008; Zhang et al., 2003a)。在 SI 中，
只有一個催化的水分子 Wat4248 (MutB 編號) 會直接參與水解反應 (Ravaud et al., 2007, 2009)。有一對 Phe 形成的芳香族夾子 (aromatic clamp)，Phe256 與 Phe280 (MutB 編號) 藉由阻礙活性中心的開口處 保護中間產物免於遭受水分子攻擊以避免水解 (Ravaud et al., 2007, 2009)。以及 SI 具有個獨特的果糖結合位 (fructosyl binding site，FBS) 圍繞在 SI 的 +1 subsite，會影響產物的專一性並預防水解 (Zhang et al., 2003b)。在過去的研究中，SI 只有少量的水解副產物產生
(Veronese and Perlot, 1998)，其中 MutB 只有 1% 的水解活性 (Hamerli and Birch, 2011) (附錄十一)。
因此本研究利用分子模擬以 SI 的 MutB 為模板模擬出 DrTS 的 蛋白質三級結構，雖然模擬的 DrTS 整體結構與 MutB 是相似的，然 而 DrTS 缺少了 MutB 的 FBS (fructose binding site)，導致 DrTS 有個 廣闊的開口通道，可能使得催化水分子更容易進入酵素之活性中心進
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行水解，可能因此造成 DrTS 的水解活性要比 MutB 的水解活性高出 許多。
2. DrTS 受質結合位的預測
根據模擬的麥芽糖與 DrTS 複合物立體結構，找出 DrTS 內有 21 個胺基酸與麥芽糖距離 5 Å 之內，分別為 Asp63、Tyr66、Val103、
His106、Asp153、Thr154、Phe173、Phe174、Gln177、Arg207、Asp209、
Ala210、Glu251、Asn253、Gln254、Phe277、Pro281、Asn317、His318、
Asp319、Glu320 與 Arg398，因此推測這些胺基酸與麥芽糖的結合可 能扮演著重要的角色。
將 DrTS 這 21 個胺基酸與 SI 的結構重疊後，有 14 個與 SI 一致 的胺基酸，主要分布在 -1 subsite 的周圍，分別為 Asp63、Tyr66、
Val103、His106、Phe173、Gln177、Arg207、Asp209、Glu251、Phe277、
Asn317、Asp319、His318 與 Arg398，推測這些保守性的胺基酸可能 對於 TS 與 SI 之間共同的催化反應和功能扮演著重要的角色，例如：
-1 subsite 的結合、催化反應時醣苷鍵的斷裂與再接合。此外有 7 個 與 SI 不一致的胺基酸，分別為 Asp153、Tyr154、Phe174、Ala210、
Asn253、Gln254 與 Glu320，主要分布在 +1 subsite 的周圍，因此推 測這些不一致的胺基酸可能對於 TS 與 SI 之間不同的酵素催化反應 扮演著重要的角色，例如：+1 subsite 的結合、催化反應時形成不同
53 Asn317 藉由定位突變取代成疏水性且側鏈大小不同的 Ala、Leu 或 Phe (圖八)，可能減少水解的副反應藉以提升海藻糖的轉化率。
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性中心的開口處保護中間產物免於遭受水分子攻擊以預防水解
(Ravaud et al., 2007, 2009)。疊合 DrTS 與 SI 的立體結構後，在 DrTS 的相同的位置上也有一個芳香族胺基酸 Phe277，然而另一個胺基酸 卻為親水性的 Asn253，因此若將 Asn253 藉由定位突變取代成也具 有芳香族的 Phe (圖十)，也可能減少水解的副反應以提升海藻糖的轉
從突變株 DrTS (N317A、N317F 與 N317L) 的轉化率中可發現，
55 酸序列所比對的 Arg316 周圍序列所缺失的 Phe (314-315)，使得 DrTS 在此部分的結構能更類似 SI，來減少水解的副反應。
4. 突變株 DrTS (N253F) 的轉化率分析
從突變株 DrTS (N253F) 的轉化率中可發現，反應於 20℃ 時幾乎
56 將 Asn253 突變成具有疏水性的小分子胺基酸，例如：Leu、Val 或Ile，
就有可能減少水解副反應並且提升海藻糖轉化率。
5. 突變株 DrTS (T154F)
DrTS 的胺基酸 Thr154 與 SI 胺基酸序列及結構比對分別為 Phe145 (MutB 編號)、Phe144 (SmuA 編號) 與 Phe186 (PalI 編號)，以 及在不同種 TS 的胺基酸序列比對中，具有耐熱性的 TS 分別為 Phe142 (TaTS 編號)、Phe144 (TtTS 編號) 與 Phe146 (MrTS 編號)，
也皆為 Phe。在突變株 DrTS (T154F) 的突變結構中，Phe 的芳香族 的環會與麥芽糖的 +1 subsite 葡萄糖苷的環在立體結構中平行 (圖二 十二)，推測可能因此產生堆疊力 (stacking forces)，對於 +1 subsite 葡 萄糖苷的結合能力因此增強，而提升 DrTS 的活性。
三、 利用 GI-coupled TS 提升 DrTS 的海藻糖轉化率
在過去的研究指出，將 TS 與麥芽糖反應時加入葡萄糖會造成 TS 活性被抑制，動力學分析發現 TS 的 Km 增加了 3.6 倍但 Vmax
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2. GI-coupled TS
從 GI-coupled DrTS 研究中發現，隨著反應時間的增加，加入有 活性的 GI 會比加入沒活性的 GI 的其 DrTS 海藻糖生成量要來的高。
在 20℃ 下，加入有活性的 GI 其 DrTS 海藻糖轉化率上升約 2%；在 40℃ 下，加入有活性的 GI 其 DrTS 海藻糖轉化率上升約 4%。雖然 利用 GI-coupled DrTS 的策略可以讓 DrTS 的轉化率增加，然而
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、sucrose、thiodiglucoside 或 melibiose) 對於 DrTS 則不會有抑制作 用，表示 DrTS 對於雙糖有很高的受質專一性，因此海藻糖的類似物
以 Pichia pastoris β-glucosidase、cellulase、pentinase 或 agarase 來 水解 VA 的反應並不顯著，對於生產 VAA 的產率不高，因此以上酵
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添加 VA，發現在約 4:50 時有訊號峰面積新增，這與所預估的 VA 出 現的時間相同，也能推估反應後新生的訊號峰面積為 VAA。
在過去酸水解的研究中，認為利用 1M 的 H2SO4 於 30% VA 反 應於 100℃、1 小時，能得到較多的 VAA (Jin et al., 2006)。在本研究 中，利用相同反應情況也能得到較多的 VAA 的生成，因此較適合應 用在 VAA 的生產。
綜合本研究的結果，可以提供從事 TS 之蛋白質工程的參考。
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陸、 參考文獻
Adams, R.P., Kendall, E., Kartha, K.K., 1990. Comparison of free sugars in growing desiccated plants of Selaginella-Lepidophylla. Biochem Syst Ecol 18, 107-110.
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J.H., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-3402.
Altschul, S.F., Wootton, J.C., Gertz, E.M., Agarwala, R., Morgulis, A., Schaffer, A.A., Yu, Y.K., 2005. Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices. Febs J 272, 5101-5109.
Aroonnual, A., Nihira, T., Seki, T., Panbangred, W., 2007. Role of several key
residues in the catalytic activity of sucrose isomerase from Klebsiella pneumoniae NK33-98-8. Enzyme Microb Tech 40, 1221-1227.
Avonce, N., Leyman, B., Mascorro-Gallardo, J.O., Van Dijck, P., Thevelein, J.M., Iturriaga, G., 2004. The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose, abscisic acid, and stress signaling. Plant Physiol 136, 3649-3659.
Chen, Y.S., Lee, G.C., Shaw, J.F., 2006. Gene cloning, expression, and biochemical characterization of a recombinant trehalose synthase from Picrophilus torridus in Escherichia coli. J Agr Food Chem 54, 7098-7104.
Chou, H.H., Chang, S.W., Lee, G.C., Chen, Y.S., Yeh, T.N., Akoh, C.C., Shaw, J.F., 2010. Site-directed mutagenesis improves the thermostability of a recombinant Picrophilus torridus trehalose synthase and efficiency for the production of trehalose from sweet potato starch. Food Chem 119, 1017-1022.
Colaco, C., Sen, S., Thangavelu, M., Pinder, S., Roser, B., 1992. Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose - simplified molecular-biology.
Bio-Technol 10, 1007-1011.
Connell, L.W., Sexton, F.W., McDaniel, P.J., Prinja, A.K., 1996. Modeling the heavy ion cross-section for single event upset with track structure effects: The
HIC-UP-TS model. Ieee T Nucl Sci 43, 2814-2819.
Crowe, J.H., Crowe, L.M., 2000. Preservation of mammalian cells - learning nature's
Crowe, J.H., Crowe, L.M., 2000. Preservation of mammalian cells - learning nature's