前言 - 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/50188

第一章前言

1-1. 選擇急性肺損傷/急性呼吸窘迫症(ALI/ARDS)為研究主題的原因急性肺損傷(Acute lung injury, ALI)以及急性呼吸窘迫症(Acute respiratory distress syndrome, ARDS) 屬於嚴重的肺部發炎反應，往往是造成急重症患者的多器官衰竭甚至死亡的主要原因。根據統計，即便在美國等醫療先進國家，急性肺損傷的年發生率大約有 190,000 個病案/

年，造成的死亡人數為 74,500 人/年⁽¹⁾。ALI 的住院病患死亡率大約為 38.5%，ARDS 則是更為嚴重的肺部發炎反應，其死亡率可以高達 41.1%⁽¹⁾。造成罹患ALI/ARDS 病患死亡的主要原因，通常不只是源於單純的呼吸衰竭，而是與敗血症(sepsis)所產生的瀰漫性溶血(Disseminated intravascular coagulation; DIC)及多重器官衰竭(Multiple organ dysfunction syndrome; MODS)有關^(2-4)。對於 ALI 的歸納及描述，最先是由 Ashbaugh 等(1967 年)根據 12 位病患的臨床表現、血氧狀況及 X 光片的變化而來

(5)，但醫學界直到 1994 年才對這個疾病開始有了臨床定義及診斷標準

(6)。經過近20 年的發展與研究，學界對於 ALI/ARDS 的發生原因、病理

變化日益瞭解，然而，在治療上，除了呼吸器的設定採取較小的潮氣容積進行保護性肺臟通氣策略(Lung-protective ventilator strategy) ^(7-9)、輸液及支持性的治療外^(10-12)，其他有效藥物的進展，仍十分有限。因此，我們選擇這個疾病來作為研究主題，建立實驗動物平台，並探討中醫藥在

急性肺損傷的治療上是否具有療效及發展潛力。

1-2. 使用活血化瘀藥治療 ALI/ARDS 的理論基礎

造成ALI/ARDS 的原因，可以是肺部的直接損傷，如肺炎、嗆入胃酸物質、溺水、肺挫傷等；或是間接產生的肺部傷害，如敗血症引起的全身性發炎反應、嚴重外傷引起的休克、急性胰臟炎等^{(3, 4, 13)}。在病理生理學方面，ALI/ARDS 主要發生於肺泡上皮以及微血管內皮 (alveolar-capillary membrane)，呈現如瀑布效應的發炎反應(inflammatory cascades)，依時序之進展如下：在細菌所釋放的內毒素攻擊肺泡後的數小時至數天內，肺泡內的巨噬細胞會分泌大量的發炎物質，驅使中性球 (polymorphonuclear neutrophils; PMN)從周邊血液聚集至肺部^(14-17)，造成肺間質水腫、肺泡上皮細胞屏障破壞以及大量蛋白質滲漏(protein leakage)至肺泡內、透明膜形成，最後產生嚴重的肺損傷(13, 18, 19)；在第 7-14 天後，會進入增生期，第二型肺泡上皮細胞增生，肺泡內的水分及蛋白質開始吸收^{(20, 21)}；在第 14 天以後，會進展到纖維化期，肺泡內纖維組織開始增生，肺部纖維化形成^(22-24)。除了肺部的發炎反應外，在 ALI/ARDS 中所產生的凝血功能障礙或者纖維溶解功能紊亂，也是研究人員逐漸重視的區塊，甚至認為改善肺部凝血功能障礙(pulmonary coagulopathy)是一個治療 ALI/ARDS 的新契機^{(2, 25-27)}。因此，能夠同時抑

制肺部的發炎反應以及改善凝血功能紊亂的藥物，將具有發展潛力成為治療ALI/ARDS 的新藥物。

1-3. 過去文獻在探討使用中草藥治療 ALI/ARDS 之實驗設計侷限

文獻報導，許多中草藥及方劑甚至中成藥，已在動物實驗中證實具有急性肺損傷的保護效用。例如：Xu 等(2005 年)的研究顯示，活血化瘀藥槐花(Oxymatrine)可以抑制 p38 絲裂原活化蛋白基脢(mitogen-activated protein kinas; MAPK)的磷酸化，從而降低小鼠急性肺損傷(ALI)⁽²⁸⁾； Tajima 等 (2006 年 ) 發現，將小鼠餵食補中益氣湯 (Hochu-ekki-to) 1g/Kg/day 連續八周，可以對內毒素(lipopolysaccharide; LPS)所致急性肺損傷(ALI)產生保護效用⁽²⁹⁾；Yeh 等(2006 年)發現使用瀉白散(Xia-Bai-San) 1 mg/kg 術前餵食小鼠，具有降低肺部發炎反應，對急性肺損傷具有保護作用⁽³⁰⁾；Yeh 等(2007 年)發現給予小鼠口服餵食銀翹散(Gingyo-san)，

可以降低肺泡中性球數目及肺部發炎反應，進而達到急性肺損傷之保護作用⁽³¹⁾。從中藥萃取出來具有抗氧化效用的純化物，也被用來進行評估是否對 ALI/ARDS 具有保護效果。例如：Yeh 等(2007 年)使用自陳皮萃取出的橙皮苷(hesperidin)200 mg/kg，在術前餵食小鼠，結果發現，橙皮苷(hesperidin)對急性肺損傷具有保護作用，可以降低肺部發炎反應⁽³²⁾； Luo 等(2011 年)使用自五味子萃取出的活性化學物質-雙環醇(bicyclol)，

在誘發ALI 之前給予小鼠餵食，結果也發現具有抗氧化及肺部保護作用

(33)。近年來，中成藥製劑—血必淨(Xuebijing)，由於含有赤芍藥、紅花、

川芎以及丹蔘和當歸等成分，所以具有活血化瘀、抗發炎及抗氧化的作用。Sun 等(2010 年)研究顯示，使用血必淨(Xuebijing)注射至實驗用兔，

對LPS 注射所引發之 ALI 具有保護作用⁽³⁴⁾。這些利用中醫藥單方或方劑來進行ALI 效用之相關研究，雖然為這個具有高度死亡率的疾病開啟治療的新契機，但分析這些文獻的實驗設計、給藥模式，卻發現當中存在許多與臨床狀況差距甚大的情況。首先，所有的文獻都採取“術前給藥”，所以得到的結果是“具有保護效果”。然而，ALI/ARDS 既不能事先知道而給予預防性投藥，也不像糖尿病及高血壓等慢性病需要長期服藥，所以這些實驗結果顯示的“保護效用”事實上在臨床診治病患是不可行的。其次，許多實驗設計採取的 ALI 為靜脈注射 LPS，這樣的 ALI 在分類上屬於間接性損傷(indirect injury)，與臨床病患大多是肺炎所致直接性(direct injury)ALI 大相徑庭，所以實驗結果亦無法反應臨床狀況。再者，大多使用純化物的文獻報告，均未探討原中藥藥物粗萃取物是否仍具有療效。基於上述理由，我們將實驗主軸設定在探討“LPS 直接誘發所致ALI”，希望建立一個由高劑量 LPS 所誘發直接 ALI 大鼠模型，並使用活血化瘀藥-牡丹皮(Moutan Cortex Radicis, MCR)以及其主要的成分-丹皮酚(Paeonol)來驗證其是否具有治療效果，並探討其治療效果

與發炎反應以及凝血功能紊亂之間的關聯性。

1-4. 使用 LPS 經氣道直接誘發大鼠 ALI 動物模型的原因

目前已被廣為使用的ALI 動物模式有 oleic acid injection^{(35, 36)}、LPS injection^(37-39)、Acid aspiration^{(40, 41)}、hyperoxia⁽⁴²⁾、bleomycin injection^(43,

44)、saline lavage^{(45, 46)}以及cecal ligation^{(47, 48)} 等。其中，較常被廣為使用，

且可用於大型動物的有以下三類，分別是：肺表面張力素缺損 (LAV) 疾病動物模式；肺部注射Oleic acid (OA) 疾病動物模式；以及肺部注射 LPS 疾病動物模式(39, 49-51)。LAV 的主要病理生理變化為肺微血管網及支氣管周邊水腫、淋巴管水腫合併第一型肺泡上皮細胞的死亡等，但這個模型的中性球浸潤並不明顯，且肺泡上皮及血管內皮細胞損傷的程度也不嚴重。因此，LAV 不能用來類比人類因肺炎所致的 ALI/ARDS，其病理表現與肺表面張力素缺失所引起的肺損傷較為相似；OA 注射模型的特色是可以看見典型ALI/ARDS 的各個階段病理變化如急性期、增生期以及纖維期。然而，其病理生理原因與不飽和脂肪酸有關，與人類因肺炎所致肺泡內上皮細胞受損進而產生ALI/ARDS 之臨床情況不盡相同。

在這些模型當中，經氣管內注射 LPS 以誘發急性肺損的動物模型比較接近人類肺炎所致的ALI/ARDS。且在誘發後的 24 小時內屬於急性期，是以中性球為主的發炎反應，會產生大量類似人類敗血性休克的發炎細胞

激素、氧化自由基以及細胞黏附因子。因此，我們決定採取高濃度的 LPS(16 mg/kg)，直接將源自大腸桿菌的 LPS 以氣霧方式投到大鼠肺部來誘發ALI/ARDS。然後進行投藥後時間序分析(time course analysis)，包括肺部病理解剖變化、肺泡液中細胞含量、肺泡液中蛋白濃度、肺組織骨髓過氧化脢(Myeloperoxidas; MPO)、肛溫變化等，以做為判定藥物療效最佳時間點之依據。

1-5. 使用活血化瘀藥-牡丹皮及其主要成分-丹皮酚之原因

牡丹皮(MCR)在過去中醫藥文獻當中記載，具有活血化瘀及清熱涼

血的作用^(52-60)。MCR 的現代藥理學研究顯示，其具有解熱陣痛、抗發炎

以及抑制血液凝集的作用^{(61, 62)}。Yoshikawa 等(2000 年)發現 MCR 具有清除自由基(free radicals)以及清除超氧陰離子(superoxide anion radicals)的作用⁽⁶³⁾。近年來的研究也證實，MCR 可以有效的抑制氧化傷害進而對 DNA 具有保護作用^{(64, 65)}。在細胞免疫調控方面，Kim 等(2007 年)的研究顯示，MCR 不僅對於噬伊紅性血球的移行(eosinophil migration)具有抑制效果，也能抑制細胞趨化激素(chemokine)如：細胞間質激素(interleukin, IL)-8 以及中性球趨化蛋白(monocyte chemotactic protein, MCP)-1 的分泌

(66)。Kim 等 (2012 年 ) 用 MCR 來治療關節炎的動物模型 -type II collagen-induced arthritis (CIA)，結果發現 MCR 可以透過抑制 nuclear factor kappa B (NF-κB)以及 activator protein(AP)-1 的表現量，進而抑制

發炎反應細胞激素的釋放以及蝕骨細胞(osteoclast)的活化，達到抑制關節炎的效果⁽⁶⁷⁾。基於傳統文獻以及現代藥理學的研究，MCR 的清熱涼血作用，可能對於 ALI 的肺部發炎反應具有治療效果；MCR 的活血化瘀作用，對於ALI 病理機轉中日益受到重視的凝血功能紊亂及微小血栓形成等病理反應，可能具有治療潛力。綜上，我們認為 MCR 在改善以發炎反應以及凝血紊亂為主要病機的LPS 誘發之大鼠 ALI 具有進一步研究的價值。由於 MCR 是固有藥材，本實驗採取口服餵食的方式，比較在LPS 誘發 ALI 前及誘發 ALI 後給予口服餵食藥物，以評估 MCR 是否具有治療或者保護效果。

牡丹皮在化學上具有許多萃取物，主要有丹皮酚(paeonol)、芍藥苷 (paeoniflorin)、丹皮酚苷(paeonoside)以及丹皮酚原苷(paeonolide)等多種

化學成分^(68-70)，其中，丹皮酚(paeonol)是MCR的主要成分。過去對於丹

皮酚(paeonol)的文獻研究十分豐富，Hirai等(1983年)對丹皮酚進行凝血功能相關的研究，發現給與動物口服MCR每天3g，可以抑制血小板凝集以及thromboxane B2 (TXB2) 的形成⁽⁷¹⁾。細胞實驗也發現丹皮酚對 Adenosine diphosphate (ADP) 以及collagen induced platelet aggregation具有抑制作用且呈現劑量效應^{(71, 72)}。近年來關於丹皮酚的研究也有進展，

由其是關於抗氧化及抗發炎反應相關的研究，如：Nizamutdinova等(2007 年) 研究顯示丹皮酚可以透過抑制 p38 、 extracellular-signal-regulated

kinases (ERK) 以及NF-κB等分子訊號傳遞路徑，進而抑制細胞表面黏附因子(cell-surface adhesion molecules)的表現⁽⁷³⁾；抑制發炎反應相關細胞激素如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α⁽⁷⁴⁾、Interleukin (IL)-1β 的表現量⁽⁷⁵⁾；透過抑制絲裂原活化蛋白基脢(mitogen-activated protein kinas, MAPK)的磷酸化進而抑制inducible NO synthase (iNOS)的表現量

(76)，以降低發炎反應後氧化自由基的形成以及氧化傷害的程度^(74-76)。綜上，我們認為丹皮酚對於LPS-induced ALI的發炎反應以及凝血紊亂，具有保護效用。本研究將以腹腔注射藥物的模式，採取以LPS誘發大鼠ALI 後給藥，來模擬全身性給藥是否具有治療效果。

1-6. 體外實驗探討中性球角色的原因

在LPS-induced ALI，中性球(Neutrophil)由周邊血液被趨化至肺部扮演病理生理學上的主要角色(14, 15, 77, 78)。過去的研究顯示，給予LPS後會造成中性球的變形使其能夠穿過肺部微血循環、改變微血管及肺部上皮細胞的通透性，進而造成大量滲液及蛋白質滲漏至肺泡中(15, 79, 80)。這些來自周邊血液且被活化的中性球會趨使蛋白脢(protease)的活化、產生大

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