4-1. LPS 誘發 ALI/ARDS 大鼠之 Time course 研究 4-1-1. 實驗設計與流程設計
為了決定治療介入後最佳的觀察時間點，我們進行了以 LPS 誘發大 鼠ALI 之時序性病理生理變化相關實驗。依照時序，分成未經誘發組(0 hr)、誘發後 8 小時(8 hr)、誘發後 16 小時(16 hr)、誘發後 24 小時(24 hr) 以及誘發後48 小時(48 hr)等共 5 組，每組 N=6。實驗流程如圖 4-1 所示。
圖4-1. 以 LPS 誘發 ALI 之時序性研究
0 hr 組：未經 LPS 誘發即予以犧牲；8 hr 組：在 LPS 誘發後 8 小時予以 犧牲；16 hr 組：在 LPS 誘發後 16 小時予以犧牲；24 hr 組：在 LPS 誘 發後 24 小時予以犧牲；48 hr 組：在 LPS 誘發後 48 小時予以犧牲。符 號▲：代表予以 LPS 經氣管內投藥；符號△：代表未施行 LPS 經氣管內 投藥；符號○：代表將大鼠犧牲的時間點。
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4-1-2. 大鼠肛溫變化
如圖4-2 所示，大鼠在經 LPS 誘發後，依時序呈現體溫逐漸下降，至第 16 小時達到最低點，然後逐步回升，至第 48 小時後又會回到接近術前 的溫度。各組肛溫依序如下：0 hr：37.1 ± 0.2℃、8 hr：35.8 ± 0.5℃、16 hr：34.7 ± 0.3℃、24 hr：35.8 ± 0.4℃、48 hr：36.4 ± 0.3℃。這種情形，
與人類在嚴重感染所致敗血症，所呈現的體溫低下症狀相似。
圖4-2. 大鼠在經 LPS 誘發 ALI 後之時序性肛溫變化。
0 hr 組：未經 LPS 誘發即予以犧牲；8 hr 組：在 LPS 誘發後 8 小時予以 犧牲；16 hr 組：在 LPS 誘發後 16 小時予以犧牲；24 hr 組：在 LPS 誘
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發後 24 小時予以犧牲；48 hr 組：在 LPS 誘發後 48 小時予以犧牲。各 組N=6。#代表與 0hr 相比，呈現統計顯著差異，p < 0.05。*代表 8 hr、
16 hr、24 hr 以及 48 hr 各組之間互相比較，呈現統計顯著差異，p<0.05。
4-1-3. 大鼠病理切片之肺損傷程度變化
以 LPS 誘發大鼠 ALI 之時序性肺損傷程度變化如表 4-1 以及圖 4-3 以及圖4-4 所示。 肺損傷程度之總分係由 3 個分數加總而得，依次為肺 泡內細胞浸潤程度(cellularity)、肺泡內蛋白質滲出程度(protein exudation) 以及肺泡內出血程度(hemorrhage)。
在肺損傷總分方面：與 0 hr 相比，各組之肺損傷程度、肺泡內細胞 浸潤程度均呈現顯著上升。隨時序之進展，24 hr 後肺損傷程度逐漸下 降，至48 hr 時肺損傷程度總分已降至 28.6 ± 1.8，顯示本實驗結果與過 去文獻所報導之24 小時內為急性期有較高之肺損傷程度相符合。
在肺泡內細胞浸潤程度方面：以第 16 小時為最高，但 8 hr、16 hr 以及24hr 三組之間無顯著統計差異。至 48 hr 持續下降，且與 16 hr 相 比，呈現顯著統計差異。
在肺泡內蛋白質滲出程度方面：以第 8 小時為最高，但 8 hr、16 hr 以及24 hr 三組之間無顯著統計差異。至 48 hr 持續下降，且與 8 hr 相 比，呈現顯著統計差異。
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在肺泡內出血程度方面：以第 16 小時為最高，但 8 hr 與 16 hr 兩組 之間無顯著統計差異。至24 hr 及 48 hr 持續下降，且與 8 hr、16 hr 相 比，均呈現顯著統計差異。
表4-1. 大鼠在經 LPS 誘發 ALI 之各組肺損傷程度比較表
Cellularity Protein exudation Hemorrhage Scores
0hr 2.3± 0.6 4.5±0.5 5.0±1.2 11.8±1.4
8hr 18.8±1.9 # 13.6±1.3 #δ 12.1±0.6 #γδ 44.5±2.4 #γδ 16hr 20.9±1.0 #δ 12.4±0.9 # 13.4±1.0 #γδ 46.7±1.3 #γδ 24hr 18.9±1.5 # 10.5±1.7 # 7.5±1.2 αβ 36.9±2.1 #αβδ 48hr 15.8±0.5 #β 8.1±1.0α 4.7±1.0 αβ 28.6±1.8 #αβγ Data are presented as mean ± SEM. #: p < 0.05, compared with 0hr, α: p < 0.05, compared with 8 hr; β: p < 0.05, compared with 16 hr; γ: p < 0.05, compared with 24 hr;
δ: p < 0.05, compared with 48 hr. N=6
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圖4-3. 大鼠在經 LPS 誘發 ALI 後病理切片之肺損傷程度變化
肺損傷程度之總分係由3 個分數加總而得，依次為肺泡內細胞浸潤程度 (cellularity)、肺泡內蛋白質滲出程度(protein exudation)以及肺泡內出血程 度(hemorrhage)。#：代表與 0 hr 相比具有統計學顯著差異, p < 0.05；*：
代表標示之兩組相比較，呈現統計顯著差異，p < 0.05。
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圖4-4. 大鼠在經 LPS 誘發 ALI 後之時序性肺病理切片
本圖之放大倍數為200 倍之病理切片。依時序性依次為(a) 0 hr、(b) 8 hr、
(c) 16 hr、(d) 24 hr 以及(e) 48 hr。大鼠在犧牲後取其右肺進行病理切片，
以H&E stain 染色後進行肺損傷程度之判定。圖(a) 0 hr 時肺泡內幾乎無 中性球、紅血球或蛋白質滲出液存在。肺泡內沉積細胞越多，反應出越 嚴重的肺損傷程度。
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4-1-4. 大鼠肺泡沖洗液細胞計數之變化
以LPS 誘發大鼠急性肺損傷之時序性肺泡細胞計數變化如圖 4-5 所 示。肺泡液之細胞總數(total cell counts)如圖 4-5 (a)所示，以第 16 小時為 最高，但 8 hr、16 hr 以及 24 hr 三組之間無顯著統計差異。至 48 hr 持續 下降，且與8 hr、16 hr 及 24 hr 相比，均呈現顯著統計差異。肺泡液之 中性球(neutrophil counts)如圖 4-5 (b)所示，以第 16 小時為最高，但 8 hr、
16 hr 以及 24 hr 三組之間無顯著統計差異。至 48 hr 持續下降，且與 8 hr、
16 hr 及 24 hr 相比，均呈現顯著統計差異。
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圖4-5. LPS 誘發 ALI 後大鼠肺泡液細胞計數之變化
(a)肺泡內各組細胞總數變化(total cell counts)。(b)肺泡內各組中性球 (neutrophil counts)變化。#：代表與 0 hr 相比具有統計學顯著差異, p <
0.05；*：代表標示之兩組間比較，呈現統計顯著差異，p < 0.05。
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4-1-5. 大鼠肺泡沖洗液蛋白濃度之變化
以 LPS 誘發大鼠急性肺損傷之時序性肺泡沖洗液蛋白濃度變化如 圖4-6 所示。肺泡液之蛋白濃度(protein concentration mg/ml)，以第 8 小 時為最高，但8 hr、16 hr 以及 24 hr 三組之間無顯著統計差異。至 48 hr 持續下降，且與8 hr、16 hr 及 24 hr 相比，均呈現顯著統計差異。
圖4-6. LPS 誘發 ALI 後大鼠肺泡液蛋白濃度之變化
#：代表與 0 hr 相比具有統計學顯著差異, p < 0.05；*：代表標示之兩組 間比較，呈現統計顯著差異，p < 0.05。
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4-1-6. 大鼠肺泡沖洗液發炎相關細胞激素之變化
以 LPS 誘發大鼠急性肺損傷之時序性肺泡沖洗液發炎相關細胞激 素之變化如圖4-7 所示。(a) TNF-α之表現量以第 8 小時為最高，然後至 第16 hr 以後就顯著降低。第 8 小時之 TNF-α表現量與 16 hr、24 hr 以及 48 hr 相比，均呈現顯著統計之差異。(b) IL-1β之表現量自第 8 小時後開 始顯著上升，以第16 小時為最高，但 8 hr、16 hr 以及 24 hr 三組之間無 顯著統計差異。至48 hr 持續下降，且與 8 hr 及 16 hr 相比，均呈現顯 著統計差異。(c) IL-6 之表現量自第 8 小時後開始顯著上升，在第 16 小 時仍然維持在較高的表現量，8 hr 以及 16 hr 之間無顯著統計差異。至第 24 hr 以後開始顯著下降，至第 48 小時的表現量降至最低。8 hr 與 24 hr 及48 hr 組相比，均呈現顯著統計差異。16 hr 與 24 hr 及 48 hr 組相比，
亦呈現顯著統計差異。
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圖4-7. LPS 誘發 ALI 後大鼠肺泡液發炎相關細胞激素之變化
(a)肺泡液 TNF-α表現量。(b)肺泡液 IL-1β表現量。(c) 肺泡液 IL-6 表現
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量。(d) 肺泡液 MIP-2 表現量。#：代表與 0 hr 相比 p < 0.05；*代表標示 之兩組間比較，呈現統計顯著差異，p < 0.05
4-1-7. 大鼠肺泡沖洗液凝血相關細胞激素之變化
以 LPS 誘發大鼠急性肺損傷之時序性肺泡沖洗液凝血相關細胞激 素之變化如圖4-8 所示。(a) 各組在 TATC 之表現量無顯著統計學差異；
(b) 肺泡液內之 PAI-1 表現量自第 8 小時後開始顯著上升，以第 16 小時 為最高，但 8 hr 以及 16 hr 兩組之間無顯著統計差異。自 24 小時至 48 hr 持續下降，且與8 hr 及 16 hr 相比，均呈現顯著統計差異。
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圖4-8. LPS 誘發 ALI 後大鼠肺泡液凝血相關細胞激素之變化
(a) 肺泡液 TATC 表現量。(b) 肺泡液 PAI-1 表現量。#：代表與 0 hr 相 比具有統計學顯著差異, p < 0.05；*代表標示之兩組間比較，呈現統計顯 著差異，p < 0.05。
4-1-8. 大鼠肺組織 MPO 表現量之變化
以LPS 誘發大鼠急性肺損傷之時序性肺組織 MPO 表現量變化如圖 4-9 所示。肺組織的 MPO 表現量：經誘發後各時間點與 0 小時組相比，
均達統計學顯著意義，顯示本實驗模型穩定。MPO 表現量以第 8 小時為 最高。與第8 小時相比，第 24 小時與第 48 小時顯著下降。第 8 小時與
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第16 小時相比，則無統計學差異。與第 16 小時相比，第 48 小時顯著 下降，但第24 小時與第 16 小時相比，則未達統計顯著差異。顯示，給 予LPS 經氣管內誘發後，肺部會產生以中性球為主之急性發炎反應，其 MPO 在第 8 小時達到最高點，然後依時序進展而遞減。
圖4-9. LPS 誘發 ALI 後大鼠肺組織 MPO 表現量之變化
#：代表與 0 hr 相比具有統計學顯著差異, p < 0.05；*代表標示之兩組相 比較，呈現統計顯著差異，p < 0.05。
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4-2. 牡丹皮對 LPS 誘發 ALI/ARDS 大鼠之肺部保護作用及機轉探討 4-2-1. 實驗設計與流程設計
牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的作用，對於急性肺損傷之發炎反 應以及凝血功能紊亂是否具有保護效用或者治療效用，是本實驗所欲探 討的問題。在決定治療介入後最佳的觀察時間點後，我們以 LPS-induced ALI 為動物模型，分別在誘發前以及誘發後給予大鼠餵食連續三個劑量 口服之牡丹皮，以評估其是否具有治療潛力。大鼠誘發與否、給藥之時 間，分成(A) PBS 組；(B) LPS 組；(C) Pre-treatment 組 (MCR-LPS)；(D) Post-treatment 組 (LPS-MCR)。各組於第 16 小時後予以犧牲，並進行後 續評估。每組N=6，實驗流程如圖 4-10 所示。
圖4-10. 牡丹皮治療 LPS 誘發 ALI 效用評估實驗設計
(A) PBS 組：給予氣管內注射 PBS，在第 16 小時後予以犧牲；(B) LPS
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組：經氣管給予 LPS 誘發 ALI，在第 16 小時後予以犧牲；C) Pre-treatment 組 (MCR-LPS 組)：在以 LPS 誘發 ALI 前 24 小時，開始給予口服餵食 牡丹皮 2 g/Kg 共 3 次，在誘發 ALI 後第 16 小時予以犧牲；(D) Post-treatment 組 (LPS-MCR 組)：在以 LPS 誘發大鼠 ALI 後 1 小時開始，
給予口服餵食牡丹皮2 g/Kg 共 3 次，然後在誘發肺損傷後第 16 小時予 以犧牲；符號▲：代表予以 LPS 經氣管內投藥；符號△：代表未施行 LPS 經氣管內投藥；符號○：代表將大鼠犧牲的時間點。
4-2-2. 牡丹皮之 HPLC 指標成分鑑定及不含馬兜鈴酸之確定
牡丹皮中最主要的指標成分為 Paeonol 以及 Paeoniflorin。本實驗以 這兩個純化物作為牡丹皮濃縮中藥之比對 (圖 4-11)。使用 Paeonol 作為 standard，在 retention time 為 14.68 分鐘時有一個 peak 值出現 (圖 4-11a)，
而本實驗所使用之濃縮牡丹皮中藥粉，與標準品(paeonol) 相比，同樣在 retention time 為 14.68 分鐘時也有一個 peak 值(#)出現 (圖 4-11b)，代表 含有指標成分 paeonol。圖 4-11c 為使用 Paeoniflorin 作為 standard，在 retention time 為 8.46 分鐘時有一個 peak 值(**)出現，而本實驗所使用之 濃縮牡丹皮中藥粉，與標準品 (paeoniflorin) 相比，同樣在 retention time 為8.46 分鐘時也有一個 peak 值出現，代表含有指標成分 Paeoniflorin (圖 4-12d)。在投稿的時候，期刊編審委員要求證實本實驗所用之 MCR 中藥
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不含馬兜鈴酸，遂進行 HPLC 比對。圖 4-12e 為使用馬兜鈴酸之指標成 分Aristolochic Acid-1(AA-1)作為 standard，在 retention time 為 15.89 分 鐘時有一個peak 值出現，而本實驗所使用之濃縮 MCR 中藥粉，與 AA-1 標準品相比，同樣在retention time 為 15.89 分鐘時並未出現 peak 值 (圖 4-12f)，代表本實驗所使用的濃縮 MCR 中藥不含有 AA-1。
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圖4-11. 牡丹皮濃縮藥之HPLC指標成分分析。
(a)使用 Paeonol 作為標準品，於 retention time 為 14.68 分鐘之 HPLC 分析；(b)濃縮牡丹皮中藥粉於 retention time 為
14.68 分鐘之 HPLC 分析；(c)使用 Paeoniflorin 為標準品，於 retention time 為 8.46 分鐘之 HPLC 分析；(d)濃縮牡丹
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皮中藥粉於retention time 為 8.46 分鐘之 HPLC 分析；(e)為使用馬兜鈴 酸之指標成分Aristolochic Acid-1(AA-1)為標準品於 retention time 為 15.89 分鐘之 HPLC 分析；(f) 濃縮牡丹皮中藥粉於 retention time 為 15.89 分鐘之HPLC 分析。
皮中藥粉於retention time 為 8.46 分鐘之 HPLC 分析；(e)為使用馬兜鈴 酸之指標成分Aristolochic Acid-1(AA-1)為標準品於 retention time 為 15.89 分鐘之 HPLC 分析；(f) 濃縮牡丹皮中藥粉於 retention time 為 15.89 分鐘之HPLC 分析。