本研究包含四大部分，首先是實驗動物模型的建立，以模擬人類在肺 炎所致ALI之病理生理反應。我們進行動物模型時序性的研究，包括肺泡液 細胞計數、細胞激素的分析及肺部病理組織切片肺損傷程度的判定等，以 作為選擇LPS誘發肺損傷後第16小時為治療效果觀測時間點之依據；其次，
以本動物模型來進行傳統中藥~MCR之療效評估。我們發現在術前給予 MCR口服餵食實驗大鼠，對於急性肺損傷具有保護作用，其作用為可能與 抑制肺部發炎反應細胞激素如IL-6、IL-1β以及MIP-2的表現量有關。不論是 術前給藥或者術後給藥組，MCR均有調節體溫、抑制MPO表現量的作用。
第三：MCR的主要有效化學物質為丹皮酚，過去的文獻顯示其具有良好的 抗發炎作用。雖然術前口服MCR具有保護作用，然而，口服劑型對於處於 肺炎所致呼吸窘迫症的臨床病患，並非理想給藥模式，主要是因為發生呼 吸窘迫之病患多合併有嚴重敗血症所致消化不良，使口服吸收效果更差。
此外，急性呼吸窘迫症的發生並無法事前被預測而給予預防性投藥，加上 口服中藥的個體代謝差異率無法被精確掌控，更無法預測其血中有效濃 度。因此，基於上述理由，我們使用丹皮酚注射至LPS誘發急性肺損傷之大 鼠，來評估其是否具有治療效用。結果發現，給予丹皮酚在誘發肺損傷後 注射，具有顯著療效，其機轉可能與抑制肺部發炎反應，如抑制TNF-α、
IL-1β、IL-6以及MPO和iNOS的表現量，同時，丹皮酚注射也可以抑制大鼠
121
肺泡內PAI-1的表現量，以降低凝血功能紊亂。這個實驗顯示，丹皮酚具有 抗發炎以及抗凝血的作用。作為活血化瘀藥-牡MCR的主要指標純化物，我 們可以推測，MCR的活血化瘀功效，可能與丹皮酚有關。第四個部分，由 於注射丹皮酚的療效遠勝於口服MCR，且肺泡內的中性球在丹皮酚注射組 顯著下降，所以我們推測丹皮酚可以直接調控血液中的中性球功能。我們 將大鼠中性球自血液分離出來，使用不同濃度的丹皮酚與之作用，進行相 關中性球功能的體外實驗。結果顯示，丹皮酚具有顯著抑制中性球移行能 力的作用，同時促進中性球的吞噬能力。本研究為選擇一目前現代醫學治 療上有瓶頸之臨床疾病，經由實驗動物模型的建立，來進行篩選及驗證潛 在具有治療效果之中草藥，並探討其可能之作用機轉。本研究在後續更可 以深入探討同類中草藥之可能治療靶點，以做為臨床使用的理論依據，以 及新藥開發臨床試驗的起始點。以下就實驗的細部進行討論。
在疾病動物模式的討論：過去有許多動物模式被開發及應用來模擬內 毒素所致急性肺損傷(38, 50, 51)，其中，以LPS誘發所致的ALI/ARDS與應臨床 因肺炎所致肺損傷的病理生理較為接近。這個模型的特色，在於用LPS直接 氣管內給藥後，可以產生Neutrophil-dependent ALI/ARDS，使周邊血液的中 性 球 受 到 發 炎 反 應 細 胞 激 素 或 者 趨 化 激 素 的 作 用 ， 經 由adhesion以及 migration而聚集至肺泡內，可反映出臨床ALI/ARDS在急性期以中性球浸潤 為主的病理反應(4, 14, 15)。至於LPS的誘發，本研究使用的16 mg/kg較過去文
122
獻為高，所致的肺部損傷程度亦較嚴重，在病理切片上可以看出肺泡內大 量的發炎細胞、蛋白質滲出液以及紅血球浸潤，這樣的嚴重肺損傷，更能 作為藥物有效與否之驗證。在時間點的選擇上，過去文獻以誘發後24小時 作為分類，在24小時內的觀察點為急性期，超過24小時以後的觀察點定義 為慢性期。本研究進行了LPS誘發急性肺損傷後的時序性研究，我們選擇了 0、8、16、24以及48小時為觀察時間點，在肺泡液的分析方面，進行了血 球計數、蛋白質濃度、細胞激素表現量等；在肺組織分析方面，進行了組 織病理切片以及MPO的分析；在生理指標分析方面，進行了大鼠肛溫的監 測。結果顯示，本實驗可以穩定的誘發建置LPS所致急性肺損傷大鼠模型，
與文獻所述之肺部表現一致：大量的中性球浸潤、肺泡上皮細胞損傷、肺 間質浸潤以及大量的蛋白滲漏至肺泡內(4, 13, 16, 130)。在時間點的選擇上，誘 發後第8小時的細胞激素表現量達到最高，但肺損傷程度則以第16小時較為 嚴重，但與第8小時相比，並無顯著統計差異。所以，在誘發後第8-16小時 皆為適合觀測的時間點，而本實驗的時間點選擇上以之前同實驗室所選擇 的第16小時為觀測時間點。
抑制LPS-induced ALI相關發炎反應討論：以LPS誘發之急性肺損傷模 型中，發炎前趨細胞激素的大量表現，如TNF-α、IL-1β以及IL-6等扮演了 促進發炎反應以及形成inflammatory cascas的核心角色(2, 51)。這些細胞激 素，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8以及IL-10等是由於肺泡內的巨噬細胞受
123
到刺激後所分泌的產物，目的是能吸引以及趨化更多的中性球至肺泡內，
以對抗內毒素的攻擊(4, 137, 141, 242, 243)。除上述之細胞激素外，MIP-2(CXCL-2) 被認為是趨化中性球至肺泡內最重要細胞激素(14, 142)；MPO的表現量則可以 做為肺組織內中性球濃度的標誌(16, 79)；而iNO的表現量增加，會使肺組織 內的NO上升，進而產生更多的peroxynitrite(243-246)，因而產生氧化傷害(236, 243,
246, 247)。在以牡丹皮進行的研究方面：術前給予牡丹皮可以抑制肺泡液內發
炎反應細胞激素IL-1β以及IL-6的濃度、抑制細胞趨化激素MIP-2的濃度、降 低 肺 泡 液 內 中 性 球 數 目 以 及 蛋 白 質 滲 出 的 濃 度 。 然 而 ， 術 後 給 藥 組 (LPS-MCR)，除了可以降低肺泡內IL-6的表現量外，與其餘之細胞激素表現 量的下降程度與LPS組相比均未有顯著統計差異。此外，給予大鼠餵食MCR 後，肺組織中的MPO的表現量也呈現顯著下降。因此，我們可以推論，口 服牡丹皮在LPS誘發前給藥，可以透過抗發炎反應，來降低大鼠肺部之急性 肺損傷；術後給藥組由於抑制發炎反應的效果未若術前組顯著，所以無法 顯著的抑制中性球趨化所致的肺損傷。在以丹皮酚注射禁行的研究方面：
給予丹皮酚經腹腔內注射可以抑制肺泡液內發炎反應細胞激素TNF-α、
IL-1β以及IL-6的濃度、降低肺泡液內中性球數目及蛋白質滲出的濃度，同 時，也使肺組織中的MPO的表現量呈現顯著下降。因此，我們可以推論，
在LPS誘發後給予注射丹皮酚，可以透過抑制發炎反應，來降低大鼠肺部之 急性肺損傷。綜上，本研究結果顯示，給予術前口服MCR以及術後注射丹
124
皮酚，皆能抑制肺泡液發炎細胞激素的表現量。注射丹皮酚，雖然是術後 給藥，但其抑制的效果更顯著於術前口服牡丹皮濃縮藥物。推論其中的差 距，可能與口服藥物尚需要生物體代謝才能進入血中，以及丹皮酚是MCR 中重要的抑制發炎反應的化學結構有關。過去的文獻曾經報導丹皮酚在細 胞 實 驗 中 ， 可 以 透 過 抑 制MAPK 訊 號 傳 遞 路 徑 ， 使 得 RAW 264.7 macrophage-like cells在經LPS刺激後所產生的iNOS下降(76)，然而，關於丹 皮酚是否在動物實驗具有調控iNOS表現量的研究，特別是LPS-induced ALI model，並未有相關的報導。本研究結果同時也證實了丹皮酚在動物實驗 中，對於iNOS的表現量也具有顯著的抑制效果(232)。
抑制LPS-induced ALI相關凝血功能紊亂討論：急性肺損傷的另外一個 重要的病理變化為：「肺泡內fibrin以及platelet plugs沉積，造成肺泡及肺微 血管的栓塞」，當肺泡內的fibrin過度沉積後，也會使中性球以及fibroblasts 更進一步的被活化與趨化，使得肺損傷加重(4)。這個由發炎反應以及凝血 功能紊亂所錯縱而成的病理變化，就是產生肺部氣體交換受限、肺泡內大 量滲液堆積以及形成肺微血管障礙及血栓所致多器官衰竭甚至致死的主因
(18)。事實上，凝血功能紊亂的產生，與發炎反應細胞激素的過度表現有關，
如TNF-α、IL-1β以及IL-6等，這些細胞激素的過度表現，不但會刺激Tissue factor (TF)的活化，同時也會透過釋放出PAI-1而抑制內生性纖維溶解作 用，最後的結果就是大量的血栓形成(2, 25, 146, 152, 153)。在MCR口服給藥的動
125
物實驗中，我們發現，各組之肺泡液TATC表現量均無顯著之差異。然而，
在PAI-1的表現量上，雖然誘發前口服給藥以及誘發後口服給藥均可使PAI-1 表現量下降，但均未達顯著統計學差異。然而，在以丹皮酚腹腔內注射的 實驗中發現，丹皮酚的注射治療，雖然對於大鼠肺泡液內TATC表現量影響 不大，但是對於PAI-1的表現量卻有顯著的抑制作用，且呈現劑量效應。因 此，可以推論，MCR中的丹皮酚具有透過抑制PAI-1的表現量來對抗「抑制 纖維溶解作用」，這與傳統中醫藥典及所記載的「活血化瘀」作用，有一定 程度的呼應。至於這樣的作用是直接透過抑制PAI-1的表現量，還是因為抑 制了IL-6的表現量使得PAI-1的表現也被間接抑制而產生作用，仍然需要進 一步的研究。其他中醫藥典籍所記載之活血化瘀類藥物，是否都同樣具有 抑制PAI-1的作用，也還需要進一步研究。
在丹皮酚調控中性球功能相關之研究方面：過去的文獻顯示，中性球 是人體肺部遭受感染後，首先由周邊血液被趨化及召集至肺組織內的周邊
血液細胞(248, 249)。中性球的主要生理功能，就是對於入侵人體的細菌或黴菌
具有吞噬調理作用(248, 250, 251)。經由吞噬調理作用的進行，外來的病原體會 被吞入phagosome內，然後被大量的氧化自由基、NO以及對抗細菌的蛋白 或peptide攻擊，以進行人體免疫反擊(250-252)。在丹皮酚的動物實驗可以發
具有吞噬調理作用(248, 250, 251)。經由吞噬調理作用的進行，外來的病原體會 被吞入phagosome內，然後被大量的氧化自由基、NO以及對抗細菌的蛋白 或peptide攻擊，以進行人體免疫反擊(250-252)。在丹皮酚的動物實驗可以發