本 研 究 使 用 的 動 物 為Spraque-Dawley (SD) 品 系 、 無 感 染 性 (pathogen-free)大鼠，體重約為250到300 g。在實驗進行前，本研究之 動物實驗設計，皆經過台中榮民總醫院‧研究部‧動物實驗管理委員 會之審查通過後，才開始進行。動物實驗皆依照台中榮民總醫院實驗 動 物 管 理 委 員 會(Animal Stusy Protocol Review Board of Taichung Veterans Gerneal Hospital)的指導規則執行，以減少實驗動物之痛苦及不 適。SD大鼠購買自「樂斯科生物科技股份有限公司」(BioLASCO Taiwan Co., Ltd)，飼養於台中榮民總醫院研究大樓之動物房，飼養環境為12小 時光/暗周期，恆溫恆濕的環境，給與實驗鼠充足之飲水及飼料。
3-2. 實驗藥品及試劑 3-2-1. 實驗藥品
(1)牡丹皮：牡丹皮的來源是購買自科達製藥股份有限公司(KO DA Pharmaceutical CO., LTD, Taoyuan County 32459, Taiwan , R.O.C)，藥品為 具有衛生署核可藥證字號(衛署藥製 040314)的牡丹皮濃縮科學中藥(MU DAN PI; KO DA; Product number: 420701903)。在製備的過程中，以生藥 濃縮而成浸膏，最後4.34 g 的牡丹皮生藥被濃縮成 0.67 g 的浸膏（生藥
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與浸膏比例4.34：0.67＝6.5：1），然後再添加入0.33g 的澱粉為賦型劑，
乾燥後製成牡丹皮濃縮顆粒。
(2)丹皮酚：丹皮酚之純化物結晶顆粒末由國立陽明大學傳統醫學研究所 蔡東湖教授(陽明大學，台北，台灣)所提供，其製備過程如下：牡丹皮 生藥購自台北中藥市場，經過國立中國醫藥研究所周正仁(Cheng-Jen Chou)研究員進行基源鑑定後，將牡丹皮進行萃取。萃取過程由蔡東湖 教授提供，以 95%乙醇，在 50℃ 的條件下，體積比採 1:10，共進行 3 次萃取。所得到的乙醇萃取物再予以濃縮，然後以正己烷 4× 1.5 L)、乙 酸乙酯(ethyl acetate, EtOAc, 4×1.5 L).進行分餾，最後在正己烷(n-Hexane) 的那一層得到最大量的丹皮酚，然後以甲醇(methanol, MeOH)製備而形 成細針狀的結晶體。經過質譜儀(NMR spectral properties)的鑑定後，證 實所製備的結晶體微分子量 166.17 的丹皮酚，其結構為 2-hydroxy-4 methoxyacetophenone (Fig. 1). 1HNMR(CDCl3) d: 2.51 (3H, s, H-8), 3.80 (3H, s, 5-OCH3),6.37 (2H, m, H-4, 6), 7.57 (1H, br s, H-3), 12.71 (–OH);
13CNMR (CDCl3) d: 25.9 (q, C-8), 55.3 (q, 5-OCH3), 100.7 (d, C-6), 107.3 (d, C-4), 113.7 (s, C-2), 132.1 (d, C-3), 165.0 (s, C-1),165.9 (s, C-5), 202.4 (s, C-7)。
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3-2-2. 實驗試劑
本 實 驗 大 部 分 的 試 劑 以 及 進 行 分 子 生 物 檢 測 所 需 要 的 溶 劑 皆 購 自 Sigma Chemical (Deisenhofen, Germany)。誘發大鼠 ALI 所使用的內毒素 (Lipopolysaccharide, LPS; Escherichia coli 0055:B5, Sigma Chemical) 是 購 自 Sigma 公 司 (St. Louis, MO, USA). 發 炎 反 應 相 關 細 胞 激 素 (Pro-inflammatory cytokines) 的 來 源 如 下 ： TNF-α (BMS622MST, BenderMedsytem) 、 IL-1β (BMS630, BenderMedsystem) 以 及 IL-6 (BMS625MST, BenderMedsystem)是購自 Bender MedSystems (Vienna, Austria). IL-10 (14-8101-62, eBioscience)是購自 eBioscience Systems (San Diego, CA, USA). MIP-2 (#KRC1022)是購自 BioSource International, Inc (CA, USA). 凝血相關細胞激素：TATC (ET1020-1 Lot No. 1259916R1) 以及 PAI-1 (Catalog # RPAIKT-TOT)是購自 Molecular Innovations, Inc (Novi, MI, USA)。
3-3. 利用 HPLC 進行牡丹皮指標成分以及馬兜鈴酸含量之分析 3-3-1. 牡丹皮指標成分分析
目前用來鑑定牡丹皮的主要指標成分為丹皮酚(Paeonol)以及芍藥苷 (paeoniflorin)，將牡丹皮浸膏以 HPLC 系統(HPLC, interface D-7000, Pump L-7100, UV-Vis Detector L-7455, Autosampler L-7200, Hitachi Instruments
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Service Co. Ltd., Ibaraki-ken, Japan) 來進行此兩種指標成分的比對，以做 為鑑定牡丹皮的身分驗證(authenticator)以及品質保證(quality proof)的色 譜指紋圖譜(chromatographic fingerprint)。所使用的層析管柱為: Mightysil RP-18 reversed-phase column (5 m, 250 mm x 4.6 mm) with 20 μL injection valve (Rheodyne)。
(1)指標成分丹皮酚(paeonol)的分析條件設定：丹皮酚的標準品由陽明大 學蔡東湖教授所提供。移動相(the mobile phase)之起始條件為 38%
acetonitrile (mixed with 62% of 0.03% H3PO4) 、流速 (flow rate) 為 1 ml/min、管柱溫度為 30℃以及偵測波長為 274 nm。詳細條件參考如下
(2)指標成分芍藥苷(paeoniflorin)的分析條件設定：芍藥苷的標準品購買 自China National Institutes for Food and Drug control。移動相( the mobile phase)之起始條件為 16% acetonitrile (mixed with 62% of 0.03% H3PO4)持 續至25 分鐘，流速為 1 ml/min，管柱溫度為 30℃，偵測波長(the detection wave-length)設定為 230 nm。管柱內 acetonitrile 的比重隨時間而調整為
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30% (25~30 分)、50% (30~45 分)，最後 acetonitrile 的濃度為 16% (45~50 分)。詳細條件參考如下
3-3-2. 牡丹皮內馬兜鈴酸含量之分析
由於在投稿「Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology」的時候，期刊編審委員要求對本研究所使用的牡丹 皮進行安全性分析，以確認牡丹皮內並不含馬兜鈴酸等會引起腎病變的 有毒成分，因此進行以下分析：
馬兜鈴酸(aristolochic acid)的標準品購買自 Sigma 公司(SIGMA, USA)，其含有 40%的 aristolochic acid I (AA-I). 使用的鑑定系統是 HITACHI L-7000 liquid chromatographic system，包含了 pump (L-7100)、
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column thermostat、a model 7725i injection value (sample loop 20 μL) 以及 紫外光偵測器(UV detector, L-7455). 使用的層析管柱為 Mightysil RP-18 (GP 250 mm×4.6 mm, 5 μm)、管柱溫度為 30ºC、移動相(the mobile phase) 條件為acetonitrile (45%)以及 NaH2PO4 (55%, add 6.9 g of NaH2PO4 into 2 ml of 85% H3PO4 to a total volume of 1000 ml) 的混合液、流速設定為 1.0 mL/min、偵測波長為 400 nm。
3-4. LPS 誘發 ALI/ARDS 動物模型
本研究所採用的ALI/ARDS 動物模型，係屬「LPS 直接經氣管內給 藥」模式。簡言之，進行實驗前先檢視大鼠狀況，若大鼠呈現活動力或 飲食量下降的情況，則不予以進入實驗。適合進行實驗的大鼠先與秤重 以及測量肛溫(rectal temperature, RT)並記錄之。實驗動物使用的麻醉劑 為氣體麻醉機，使用的麻醉藥物為2% isoflurane (Halocarbon Laboratories Div Halocarbon Products Crop, River Edge, NJ)，與流速為 0.5 l/min 的氧 氣混合。大鼠在被麻醉後，將其仰臥靜置於動物手術台。LPS (Escherichia coli 0055:B5, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)的劑量為 16mg/Kg 溶於0.5 ml 的 Phosphate Buffer Saline (PBS)內，以 1cc 的空針管抽取，
將針頭置換為霧化專用的 (Model IA-1B, Penn-Century, Inc., Wyndmoor, PA, USA)。使用小動物專用的喉鏡(Small Animal Laryngoscope, Model
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LS-2) 將 大 鼠 喉 頭 挑 開 ， 在 目 視 大 鼠 vocal cord 的 情 況 下 ， 將 MicroSprayer® Aerosolizer 直接伸入氣管內予以投藥，投藥後需要將大 鼠均勻搖動 30 秒，使投入的 LPS 能夠均勻地分部在兩側肺葉，然後再 使大鼠俯臥，將舌頭稍微拉到旁邊，並保持大鼠氣道的通暢，上述誘發 大鼠ALI/ARDS 之實驗方法，係根據以往之文獻及本實驗室之前所發表 的論文所述(51, 191, 192, 232)。
3-5. 支氣管肺泡沖洗液之細胞學檢測
大鼠在犧牲前先測量肛溫，然後置入密閉透明之壓克力盒內，給予高濃 度的 CO2 使其安樂死，帶大鼠死亡後，立即進行支氣管肺泡液沖洗術 (Bronchoalveolar lavage, BAL)，取出肺泡灌洗液(BALF)以進行後續分 析，實驗步驟簡述如下：將大鼠經頸部行正中切開術，游離出支氣管後，
打開胸腔，連同心臟以及左右肺葉一同取出。以止血鉗夾住右主支氣 管，然後自氣管內將8 cc 的滅菌生理食鹽水注入左肺內，沖洗後再行回 收，共3 次，最後共注入約 24 ml 的生理食鹽水，回收約 20 ml 的肺泡 灌流液(BALF)，經過 200 μm 的 mesh 過濾掉黏液後，再離心 (1500 x g , 4℃) 15 分鐘，分離細胞沉澱物以及上清液。將上清液分裝成 5 管，凍於 -80℃冰箱中，待之後進行細胞激素檢測；細胞沉澱物以 2 ml 的 PBS 進 行resuspension，以冷水及高張溶液(10X HBSS) 破壞掉紅血球後，再以
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1 倍的 PBS 進行 wash，然後取得至少 2 x 105來自BALF 的細胞，使用 cytospin 將細胞固定於玻片上，然後進行劉氏染色(Liu`s stain)，以進行 後續在顯微鏡下進行白血球種類之判斷及計數(232)。
3-6. 支氣管肺泡沖洗液之蛋白質濃度測定
使用Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)，將其他剩餘含 細胞及蛋白質的肺泡液自- 80℃冰箱中取出，使用 ELISA reader 測量 595 nm 吸光值，並依據 BSA 標準濃度及其吸光值繪製標準曲線圖，以標準 曲線圖估計樣品之蛋白質濃度（μg/ml）(233-235)。
3-7. 肺組織病理切片之 ALI 判定及量化
大 鼠 在 犧 牲 後 ， 取 出 肺 臟 ， 將 右 肺 取 下 ， 自 氣 管 內 灌 入 10%
paraformaldehyde 以進行固定，然後包埋於 paraffin 內，待之後進行病理
切片。將包埋後的肺臟組織進行脫蠟及脫水後，切成 4 μm 公分厚的切 片，固定後進行H&E stain 染色。兩位研究人員分別對所有實驗組肺切 片進行肺損傷程度判讀，在判讀時，大鼠之組別及編號均予以密封，且 呈亂數擺片，以使判讀人員能夠在不知道組別的情況下進行客觀評估。
肺損傷的判讀方式以及損傷程度判定評分標準，係依照 Kristof 等(1998 年)的方法進行修正(236)。簡言之，判讀人員在進行肺損傷程度評分時必 須對評分標準有共識，每一隻實驗動物之肺切片皆有3 個 lobes，以支氣
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管為中心，上、中肺葉各選 3 個 fields，下肺葉選 4 個 fields，總共 10 個fields 進行評分。評分項目分別為：1) alveolar and interstitial cellular infiltration (肺泡及間質發炎細胞浸潤程度)、2) alveolar protein exudation (肺泡內蛋白滲出程度)、以及 3) alveolar hemorrhage (肺泡內出血程度) 等。每一項指標最嚴重的程度給予 3 分，完全沒有給予 0 分，佔 1/3 以 下肺泡浸潤給予 1 分，有 1/2 以上肺泡浸潤給予 2 分。每一隻大鼠共有 十個lung fileds 需要給予評分，每一個獨立指標在加總 10 個 fileds 的分 數後，予以紀錄為該項之總分。每一隻大鼠的肺損傷程度總分為3 項指 標分數之加總，紀錄為totoal lung injury scores。如果兩位判斷人員之分 數差距過大，將請病理科醫師進行最後判斷(232)。
3-8. 肺組織 MPO 活性之測定
在ALI/ARDS中，肺組織內MPO的表現量可以作為中性球浸潤的指標(16,
79)， 進 行 方 法 如 下(237)： 取 部 分 的 右 肺 約1 g ， 在 冰 上 使 用 1.5~4.0 N-ethymaleimide (Sigma)進行均質(homogenized) 約30秒，然後在4 ºC中 進行離心12,000 g，共30分鐘。離心後將pellet以4 ml的potassium phosphate buffer (50 mM PH 6.0)和hexadecyl-trimethyl- ammonium bromide (HTAB) 混合溶液進行resuspension。Buffer volume (ml)：Tissue weight (g) = 10：
1。將resuspension的樣品在冰上進行超音波震盪60~90秒後，在4 ºC中進
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行離心12,000 g，共30分鐘，取上清液。取10 μl 的上清液與o-dianisidine dihydrochloride (o-DA) solution (167 mg/ml; Sigma-Aldrich, USA) 進行 incubation共30分鐘，最後以460 nm的波長進行吸光值的偵測，每30 sec 讀一次吸光值，以進行酵素活性測定，測量時間0 - 3.5 min。o-DA solution 的 泡 製 方 法 為: 取 10mg o-dianisidine dihydrochloride 溶 於 50 mM potassium phosphate buffer (KH2PO4, PH 6.0) 以及 12 μl 新鮮的H2O2 (1.5 M)。
3-9. 酵素免疫分析法(ELISA) 測定肺泡沖洗液之細胞激素
將大鼠肺泡灌流液取出後，進行發炎反應以及凝血相關細胞激素的測 定。使用的抗體包括TNF-α (BMS622MST, BenderMedsystem)、IL-1β (BMS630, BenderMedsystem)、MIP-2 (#KRC1022)、IL-6 (BMS625MST, BerderMedsystem)以及 IL-10 (14-8101-62, eBioscience)；TAT complex (TATc, ET1020-1 Lot No. 1259916R1)、PAI-1 (Catalog # RPAIKT-TOT, Molecular Innovations MI USA)。取 100 μL 的肺泡液與 ELISA 抗體 mix 均勻後，在37℃中靜置 60 分鐘，然後將 well 內的溶液吸出，使用 wash solution 將每個 well wash 3 次。加入 Horseradish peroxidase (100 μL)與抗 體結合，在37℃中靜置 30 分鐘後，在每個 well 加入 100 μL 的 subtrate solution RMB(tetramethylbenzidine)，靜置於室溫下 15 分鐘。加入 stop
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solution (100 μL, 1N solution of hydrochloric acid in water)，以 colorimetric determination (Microplate Reader BIO-RAD Laboratories CA, USA)設定在 450 nm 的吸光值下進行判讀。檢體所偵測到的吸光值，必須與 standard curve 進行比對，然後得到的數值單位為 pg/mL.
3-10. 西方點墨分析 iNOS 表現量
將取出來解凍的大鼠肺組織先以 lysis buffer (RIPA with protease inhibitor, with a ratio of lung tissue /lysis buffer equal to 100 mg /400 ml) 予以均質。將均質化的檢體 sonicated 並離心 30 分鐘 (12,000 x g, 4 ℃)，
然後測量蛋白質濃度(Bradford protein assay, Bio-Rad, Hercules, CA) 。每 次以 40 μg 蛋白質的樣品，以 7%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ；SDS-PAGE) 分 離 蛋 白 ， 接 著 將 蛋 白 質 轉 漬(transfer) 到 硝 化 纖 維 膜 (nitrocellulose membranes, Amersham. USA) ， 硝 化 纖 維 膜 以 阻 隔 緩 衝 液 (blocking buffer；20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 5% skim milk powder)來阻隔，然後以抗 polyclonal rabbit anti-mouse iNOS 抗體 (1:500 dilution, GTX213110-01, GeneTex, CA, USA)來結合 iNOS 蛋白 質 、 抗 Actin 抗 體 來 結 合 Actin 蛋 白 質 。 結 合 的 抗 體 以 二 次 抗 體 peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody 及 化 學 發 光 法 (chemiluminescence) ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK)系統來使底
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片顯像。
3-11. 肺部水腫程度分析
為了要評估大鼠肺部水腫程度，本研究另外進行了一組動物實驗，將大 鼠全肺取出後至於固定大小及重量的錫箔紙上秤重，登記為濕重(Wet weight, W)。然後將肺組織送入 60℃的烘箱內靜置 48 小時後取出，在予 以秤重，此重量為乾重 (Dry Weight, D)。將濕重 (W) 減去乾重(D)，所
為了要評估大鼠肺部水腫程度，本研究另外進行了一組動物實驗，將大 鼠全肺取出後至於固定大小及重量的錫箔紙上秤重，登記為濕重(Wet weight, W)。然後將肺組織送入 60℃的烘箱內靜置 48 小時後取出，在予 以秤重，此重量為乾重 (Dry Weight, D)。將濕重 (W) 減去乾重(D)，所