1.1. 大腸桿菌 (Escherichia coli) 外泌系統
細菌常主動分泌消化酵素、毒性蛋白質或其它致病物質至胞外，藉以從周 遭環境攝取營養素或對抗其它生物以利生存，此類外泌蛋白質常帶有特殊序 列的胺基酸片段，稱作訊號序列 (signal peptide)，可供胞內特定蛋白質辨認，
並協助運送至細胞膜上對應的通道蛋白質，主動運輸目標蛋白質至胞外。
革蘭氏陰性菌因具有包含內膜 (inner or cytoplasmic membrane)、胞膜間區 (periplasmic space) 及外膜 (outer membrane) 等膜結構，胞內物質向外運輸的 調控亦較革蘭氏陽性菌複雜，革蘭氏陰性菌的外泌系統主要分為第一至第五 型外泌系統 (Type I~V secretion system) [1] ，而其中又以常應用於外源基因 表現的大腸桿菌 (Escherichia coli) 第一型及第二型外泌系統相關研究為多，
故以下分別針對此二型外泌系統進一步介紹。
1.1.1. 第一型外泌系統 (Type I secretion system)
第一型外泌系統是藉由一系列橫跨內、外膜的通道蛋白質，於細胞質側辨
認C 端帶有特定訊號序列的蛋白質後，經過胞膜間區，直接主動運輸至胞外，
蛋白質運送到胞外後仍保留其C 端訊號序列。該種外泌途徑最常見於部分致
病型大腸桿菌，如J96、CFT073 等泌尿道感染型大腸桿菌品系(uropathogenic E. coli , UPEC) 於分泌-hemolysin 等 repeats-in-toxin (RTX) 毒素時使用，另 外在其它菌種亦有作為蛋白酶或脂肪酶的分泌途徑 [2]。
以大腸桿菌外泌毒性蛋白-hemolysin (HlyA) 途徑為例，HlyA 蛋白質 C 端帶有glycine 及 aspartate 密集且重複的訊號序列 (G-G-X-G-X-D-X，字母為 胺基酸縮寫，X 為任一胺基酸)，該段序列可被細胞內膜上的穿膜蛋白質 HlyB 辨認，於分解ATP 提供能源後，結合 HlyD 及外膜上 TolC 通道蛋白質，形成
橫跨內、外膜的運輸通道，直接將HlyA 連同訊號序列一併運送至胞外。
1.1.2. 第二型外泌系統 (Type II secretion system)
第二型外泌系統係兩階段分泌，即目標蛋白質先由內膜運輸系統運送至 胞膜間區後，進一步穿越外膜分泌至胞外。經由第二型外泌系統運輸的目標
蛋白質，其 N 端帶有特殊訊號序列，可被細胞質中不同的伴護蛋白質
(chaperone) 辨認，協助目標蛋白質折疊 (folding) 並攜帶至內膜附近以利運 輸 [3]，目標蛋白質所帶的訊號序列則於穿過內膜時被切除。
前述N 端訊號序列一般約由 18 至 30 個胺基酸組成，該序列通常包含 n-region、h-region 及 c-region 等三部分，n-region 為帶正電的胺基端 (amino terminus)，h-region 為疏水性核心 (hydrophobic core)，而 c-region 則為具極性 的切割端 (cleavage region) [1]，當目標蛋白質穿過內膜，被運送至胞膜間區 時，即由c-region 切除訊號序列。
依據訊號序列特徵、伴護蛋白質及內膜運輸蛋白質種類的不同，第二型外 泌系統可細分為Sec-dependent (Sec) pathway 及 Twin-arginine translocation (Tat) pathway。經由 Sec pathway 運送的蛋白質，在細胞質內多尚未完成折疊，需 由 SecB 伴護蛋白質或其它由蛋白質及 RNA 組成的信號識別顆粒 (signal recognition particle , SRP) 辨認結合及協助運送至胞膜間區方能完成折疊並分
泌出胞外；而在細胞質內已正確結合相關輔酶，且完成折疊者，多經由 Tat
pathway 運輸。此外，經由 Tat pathway 運輸的蛋白質，其訊號序列的 n-region 通常含有S/T-R-R-X-F-L-K 的序列特徵 [4, 5]。
1.2. 異源蛋白質的表現與外泌
大腸桿菌因具有生長快速、易於高密度培養且外源蛋白質負載量高等特 性，且其基因轉殖、表現、調控及培養策略的相關研究皆較完整，故在重組 DNA 技術生產工業、食用酵素或醫療用蛋白質等應用方面已被廣泛利用 [3,
6]。為提升異源蛋白質產量，一般藉由強效啟動子、轉形多倍數量基因或細 胞高密度培養等方式，提高目標基因表現量或總菌量達成目的。但大腸桿菌 大量表現外源基因時，常發生蛋白質折疊不完全而無活性的異源蛋白於細胞 內聚集，又無法外泌而形成包涵體 (inclusion bodies)，實務上易增加後續蛋白 質純化與復性 (renaturation) 等處理程序的複雜性及生產成本 [7]。
為了改善異源蛋白於胞內累積的問題，許多研究傾向利用大腸桿菌既有 的外泌系統，於目標蛋白質上修飾特定訊號序列，誘使宿主細胞主動外泌目 標蛋白質至胞外，即可在培養基中回收。例如，Su 等人利用第一型外泌系統 的-hemolysin (HlyA) secretion pathway ， 於 目 標 蛋 白 質 修 飾 HlyA signal peptide，成功以大腸桿菌外泌表現嗜高溫放線菌 Thermobifida fusca 的角質酶 (cutinase) [8]。
此外，亦有研究利用第二型外泌系統，誘使宿主細胞將目標蛋白質運送至 胞膜間區，再將目標蛋白質釋放至培養基；釋放的方式包含物理法如冷滲透 休克法 (cold osmotic shock)，化學法如添加 lysozyme、glycine、Triton X-100
或EDTA 等，抑或直接使用膜狀結構較為脆弱的突變菌株作為宿主細胞，以
利目標蛋白質直接釋出 [9, 10]。例如，Gerard 等人利用 E. coli Twin-arginine translocation (Tat) pathway TorA 訊號序列 (torAsp)，將耐熱溫泉菌 Thermus thermophilus 胞內表現的 -glycosidase 運送至 E. coli 宿主細胞的胞膜間區，
再藉由冷滲透休克法釋放至胞外 [11]。
然而，許多的研究顯示，宿主細胞的品系、訊號序列的種類，及目標蛋白 質本身的特性，都可能影響外泌生產的成功與否及其效率；而訊號序列的選 擇，也未有通用的規則可循。因此，對於不同的目標蛋白質，目前僅能藉由 不斷嘗試，找尋其最適的外泌途徑及生產方法 [3, 9]。
1.3. 漆酶 (laccase)
1.3.1. 起源與功能
漆酶 (EC 1.10.3.2, benzenediol: oxygen oxidoreductase) 係指一類以銅離子 作為輔因子 (cofactor) 的多酚氧化酶 (polyphenol oxidase, PPO)，最早於 1883 年由 Yoshida 氏發現漆樹 (lacquer, Toxicodendron vernicifluum, 異名 Rhus vernicifera) 樹液的硬化和其含有可氧化酚類化合物的酵素有關，並稱之為漆 酶 (laccase) [12]。
漆酶於自然界分佈甚廣，在植物、真菌、昆蟲及細菌中皆有類似功能的酵 素或序列之發現。由於漆酶的來源多，不同物種間的漆酶在序列、結構、催 化能力或特性方面差異很大，而在同一來源的漆酶，其反應基質、最適催化 條 件 亦 有 不 同 。 目 前 研 究 較 為 廣 泛 的 漆 酶 ， 以 真 菌 中 的 擔 子 菌 (Basidiomycetes) 及子囊菌 (Ascomycetes) 等來源為大宗，而其中白腐真菌 (white rot fungi) 可分別分泌纖維素 (cellulose) 及木質素 (lignin) 的分解酵 素，使木材顏色變淡或成白色，是真菌漆酶相關研究中最為詳細的 [13]。
不同於真菌漆酶，許多研究顯示漆酶在不同物種當中扮演多元的角色。例 如，Bao 及 Sato 等人在火炬松 (Pinus taeda) 木質部及細胞壁發現的漆酶可參 與木質素的生合成 [14, 15] ；另外，根據 Dittmer 等人的研究，菸草天蛾 (Manduca sexta) 及甘比亞瘧蚊 (Anopheles gambiae) 之漆酶基因 msLac1、
msLac2 及 agLac1 的表現，和昆蟲的消化系統運作或不同時期之外骨骼發育有 關 [16]。
而在細菌漆酶的研究方面，一般認為與細菌的型態發生、防止內孢子遭受 UV、過氧化氫 (H2O2) 破壞或維持細胞內銅離子濃度的恆定有關 [17]。以枯 草桿菌 (Bacillus subtilis) 的 CotA 蛋白質為例，無論是在其胺基酸序列與結構 上 所 具 有 的 4 個 保 守 區 域 ， 及 對 於 包 含 Syringaldazine
(N,N-bis(3,5-dimethoxyhydroxy-benzylidenehydrazine)) 、 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphate)) 等常見的漆酶基質，均有催化功能，因此 CotA 被認為是一種漆酶。依據 Hullo 等人研究，CotA 主要表現於枯草桿菌內孢子 表層，並參與內孢子表面褐色色素的生合成，及類似真菌漆酶之下游產物 melanin-like product，以提供內孢子對抗 UV 光的侵害 [18]。
1.3.2. 結構
漆酶包含 4 個銅離子鍵結，依據電子順磁共振 (electron paramagnetic resonance, EPR) 特性進一步分為 3 類：第 1 類 (Type 1 Cu) 為順磁性，且於 610 nm 具有吸收峰，使漆酶結晶成藍色而稱藍銅 (blue copper) 酵素；第 2 類 (Type 2 Cu) 雖具順磁性，惟於可見光譜無吸收，故僅於電子順磁共振光譜中 可偵測；第3 類銅離子 (Type 3 Cu) 於 330 nm 具有吸收峰，但因含有成對電 子而無順磁性，僅可由吸收光譜測得 [13, 19]。
另外，依據Kumar 等人分析 100 餘種漆酶結構，發現位於 4 個銅離子結 合位的12 個胺基酸均含 HXH motif 的保守區域 (L1-L4) ，其中 L2 和 L4 在 不同漆酶間的保守性高，L1 和 L3 的差異與漆酶的多樣性及還原電位差異有 關 [20, 21]。以 Bacillus subtilis 漆酶 CotA 為例，由 Type 1 Cu 與 HCH motif 中的Cysteine 492 結合，另 Histidine 491、Histidine 493 則分別與 Type 3 Cu 結合，發生氧化還原反應時，電子即經由HCH motif 於 Type 1 Cu→Type 2 Cu
→Type 3 Cu 所構成的核心區域傳遞 [20] 。
1.3.3. 應用
漆酶主要藉由對酚類或芳香環類化合物進行氧化反應，使其產生自由基，
由O2接收電子並還原為H2O [17] ，以 benzenediol 為定義基質的反應定義式：
4 benzenediol + O2 → 4 benzosemiquinone +2 H2O
相較於過氧化酶，漆酶的還原電位較低，過去認為僅能氧化酚類化合物，
但 後 續 研 究 指 出 ， 若 添 加 適 當 還 原 介 質 如 ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphate))，先經漆酶反應後生成較高還原電位的自由基，
除能有效提升木質素分解效率，亦能分解多環芳香化合物及工業染劑等 [22, 23]。
在紙漿工業上，去除木質素是相當重要的加工程序，不同於過去必須使 用強酸、強鹼並在高溫下利用化學法分解，漆酶能在相對溫和的條件下分解木 質素，不僅有效降低成本，也不易對環境產生壓力，是目前主要的應用方向[23]。
由於漆酶對氧化基質種類較無專一性，在含氧氣的環境中即可反應並分 解許多含有生物毒性及污染性的酚類或芳香環類化合物，副產物為水，對環境 影響小，因此，也被應用於工業廢水處理。依Abadulla 等團隊研究，Trametes hirsuta 漆酶能分解 triarylmethane、indigoid、azo 及 anthraquinone 等染劑，並 降低染劑對Pseudomonas putida 的生物毒性達 80% [22]。
1.4. 漆酶的異源表現
生物所自然生合成的漆酶受限於原物種生長特性，漆酶產量低且分離純
化程序繁瑣，難以符合工業應用需求。故利用重組DNA 技術將漆酶基因轉由
較易培養、生長快速的宿主生產表現，可有效提高產量，也能藉由基因工程技 術進一步調控表現機制、提高酵素專一性及反應環境耐受性等。例如，在真菌 漆酶異源表現的研究方面，Hong 等人以醱酵槽培養技術，利用 Pichia pastoris SMD1168 生產雲芝 Trametes versicolor 漆酶 Lcc1，最高活性可達 140 U/mL [24]。
細菌漆酶較真菌漆酶具有反應溫度高、耐受pH 值廣，且細菌較真菌生長
快速等優勢，但會受限於細菌漆酶的表現量較低，不易純化等問題。以Bacillus subtilis 漆酶基因 cotA 為例，該基因主要表現於內孢子表層，細胞表現漆酶 時已進入內孢子形成狀態，難以透過一般蛋白質純化技術取得，遑論進行量
產與應用。因此，藉由異源表現方式大量生產蔚為主流。依據Guan 等團隊研 究，將Bacillus pumilus W3 漆酶 CotA 表現於 Bacillus subtilis WB600 中，該 重組漆酶在 20-90°C 及 pH 6.5-11.5 對 2,6-DMP 皆有活性，以醱酵槽培養並 經酵素純化後最高產量達373.1 U/ml [25]。
產與應用。因此，藉由異源表現方式大量生產蔚為主流。依據Guan 等團隊研 究，將Bacillus pumilus W3 漆酶 CotA 表現於 Bacillus subtilis WB600 中，該 重組漆酶在 20-90°C 及 pH 6.5-11.5 對 2,6-DMP 皆有活性，以醱酵槽培養並 經酵素純化後最高產量達373.1 U/ml [25]。