第 4 章 討論
4.4. 結論
本研究針對納豆菌漆酶CotA laccase 在大腸桿菌異源表現系統內僅能以胞 內生產的限制予以改良，並探討利用訊號序列 (signal peptide) 修飾目標基因 及調整胞膜間區 (periplasmic space) 釋放條件等方式，外泌生產納豆菌漆酶的 可行性。研究結果顯示，納豆菌漆酶CotA laccase 在重組大腸桿菌內，毋需額 外修飾其它訊號序列，即能自然轉移至胞膜間區累積，此一現象有助於外泌生 產技術的開發。因此，進一步利用 glycine/Triton X-100 釋放法，並調整採用
「誘導」與「釋放」分開處理的方式，再搭配以醱酵槽進行細胞高密度培養策 略，建構了一個兼顧異源蛋白質「大量表現」及「高效釋放」的大腸桿菌外泌 生產模式，以此方式培養後於胞外釋放之納豆菌漆酶活性可達5.72 U/mL。較 原先胞內表現、並以超音波破菌的方式所得活性，提高近170 倍。故本研究所 建構的大腸桿菌外泌生產模式，除有效改善傳統破菌方式造成的能源耗費，對 於酵素工業化製程的簡化及生產成本的降低亦有所助益。
圖表
表 1 聚合酶連鎖反應引子
引子名稱 序列（5’-3’）
cotA-hlyA-1 TCCCCATAAAGCCTATGGAAGTCAGGGTAATCTTAATCCATTAATTAATGAAATCAGC
cotA-hlyA-2 AAATTACCTGCAGCTGAAATGATTTTGCTGATTTCATTAATTAATGGATTAAGAT
cotA-hlyA-3 AAATCATTTCAGCTGCAGGTAATTTTGATGTTAAAGAGGAAAGAGCTGCAGC
cotA-hlyA-4 GCATTACCGGACAACTGCAATAAAGAAGCTGCAGCTCTTTCCTCTTTAA
cotA-hlyA-5 TGCAGTTGTCCGGTAATGCCAGTGATTTTTCATATGGACGGAACTCAATAAC
cotA-hlyA-6 TTATTATGCTGATGCTGTCAAAGTTATTGAGTTCCGTCCATATG
pQE→cotA GCATGCGAGCTCGGTACCCCAATGACACTTGAAAAATTTGTGG
hlyA←pQE GCTTGGCTGCAGGTCGACCCTTATTATGCTGATGCTGTCAAAG
cotA→hlyA TCCCCATAAAGCCTATGGAAGTC
cotA←hlyA TTCCATAGGCTTTATGGGGATCAGTTATATCC
TorAF1 ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCAC
TorAR1 CCCAGCAGATACGGCAGGAAC
AmiAF1 ATGAGCACTTTTAAACCACTAAAAACACTC
AmiAR1 AGTGGAAATAACTGATCACGCCTTC
MalEF1 ATGAAAATAAAAACAGGTGCACG
MalER1 ACTTCAGCGCTACGGCACCC
OmpAF1 ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATT
OmpAF2 TCGATCTCTACGCGACGATCC
A-TorA-cotA CGAGCTCGGTACCCCAATGAACAATAACGATCTCTTTC
A-AmiA-cotA CGAGCTCGGTACCCCAATGAGCACTTTTAAACCAC
A-MalE-cotA CGAGCTCGGTACCCCAATGAAAATAAAAACAGGTGCAC
A-OmpA-cotA CGAGCTCGGTACCCCAATGAAAAAGACAGCTATCGC
cotA-6His GCTGCAGGTCGACCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTTATGGGGATCAGTTATATCC
表 2 在 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統中，修飾不同訊號序列之 cotA laccase 表現情 形
Induction
temp. hlyA torA amiA malE ompA cotA only
Vector only
Medium 25°C ND ND ND ND ND ND ND
37°C ND ND ND ND ND ND ND
Cell 25°C - ND ND ND ND 32.8 ND
37°C - ND ND ND ND ND ND
單位：mU/mL ND：Not detected
分別以hlyAsp、torAsp、amiAsp、malEsp 及 ompAsp 修飾之 cotA 基因於 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統表現，並偵測不同誘導條件下，胞內 (超音波破菌) 及胞 外漆酶活性表現情形。
僅未修飾訊號序列的組別，經超音波破菌後測得胞內漆酶活性32.8 mU/mL。
圖 1 在 E. coli M15/pQE 30-Xa 系統修飾不同訊號序列，對納豆菌漆酶於胞膜間 區累積的影響
分別以torAsp、amiAsp、malEsp 及 ompAsp 修飾之 cotA 基因於 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統表現，並以冷滲透休克法分離胞膜間區蛋白質，並檢測該區域漆酶 活性表現情形。
未修飾訊號序列的組別於胞膜間區累積活性均較有修飾組別為高，為 93.4±
1.09 mU/mL。
0 20 40 60 80 100 120
torAsp amiAsp malEsp ompAsp cotA only
Laccase activity (mU/mL)
圖 2 在 E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO® 系統中，IPTG 濃度及溫度等誘導 因子，對含不同訊號序列之納豆菌漆酶，於胞膜間區累積的影響
分別以torAsp、amiAsp 及 malEsp 修飾之 cotA 基因於 E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO®系統表現，並以冷滲透休克法分離胞膜間區蛋白質，並檢測該區
圖 3 在 E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO®-C (TOPO-C) 誘導培養時，同時添 加不同濃度Glycine 或 Triton X-100，對於納豆菌漆酶釋放至胞外的影響 TOPO-C 於 500 mL Hinton’s flask 以 37°C 振盪培養至 OD600=0.8-1.0 後加入 0.05 mM IPTG 及 0.25 mM CuSO4以25°C 誘導，同時添加不同濃度 Glycine 或Triton X-100 進行釋放，並觀察胞外漆酶活性表現情形。
Glycine 或 Triton X-100 的最適添加濃度均為 2% (w/v)，所釋放至胞外的漆酶 活性分別為38.44±1.85 及 9.85±0.418 mU/mL。
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.5 1 2 5
Glycine Triton X-100
Laccase activity (mU/mL)
Glycine/Triton X-100 concentration (%, w/v)
cotA vector － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋
2% Glycine＆
Triton X-100 － － ＋ － － － ＋ －
Cold osmotic
shock － － － ＋ － － － ＋
圖 4 SDS-PAGE 膠體電泳及活性染色分析在 E. coli BL21 (DE3)/ pEXP-5CT/TOPO®-C (TOPO-C)，胞外釋放 CotA laccase 情形
無cotA vector 者為未轉形質體之 E. coli BL21(DE3)對照組。經 Glycine/Triton X-100 釋放 (編號 3)，或以冷滲透休克法處理 (編號 4) 組別，於 40 kDa 可見 活性反應條帶。
M 1 2 3 4 1 2 3 4 M (kDa)
圖 5 E. coli BL21 (DE3)/ pEXP-5CT/TOPO®-C (TOPO-C) 誘導時同時添加 2%
Glycine 及 Triton X-100 後，納豆菌漆酶活性隨誘導時間釋放至胞外的變化 情形
TOPO-C 於 500 mL Hinton’s flask 以 37°C 振盪培養至 OD600=0.8-1.0 後加入 0.05 mM IPTG 及 0.25 mM CuSO4以25°C 誘導，同時添加 2% Glycine 及 Triton X-100 進行釋放，並以此為 0 點，定點取樣觀察胞外漆酶活性隨誘導及釋放 處理時間變化情形。
胞外漆酶活性於誘導、釋放後16 小時最高，為 224.7±11.6 mU/mL。
0 50 100 150 200 250 300
0 4 8 12 16 20 24
Laccase activity (mU/mL)
Time after induction (hr)
0 8 16 24 32 0
2 4 6 8 10 12 14
2% Glycine 2% Triton X -100
2% Glycine and Triton X -100
圖 6 E. coli BL21 (DE3)/ pEXP-5CT/TOPO®-C (TOPO-C) 經誘導並濃縮 10 倍後，
再經釋放處理之胞外漆酶活性，隨釋放時間變化情形
100 mL TOPO-C 於 500 mL Hinton’s flask 以 37°C 振盪培養至 OD600=0.8-1.0 後 加入0.05 mM IPTG 及 0.25 mM CuSO4以25°C 誘導 16 小時後離心並以 10 mL LB 培養基回溶菌體，再添加 2% Glycine、2% Triton X-100 以及 2% Glycine 和 Triton X-100 進行釋放，並以此為 0 點，定點取樣觀察胞外漆酶活性隨釋放處 理時間變化情形。
以2% Glycine 和 Triton X-100 共同處理所釋放漆酶效率最高，處理 32 小時後 活性達10.56±0.068 U/mL。
Laccase activity (U/mL)
Time after release treatment (hr)
20160531 pH stat batch
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附錄
附錄1 大腸桿菌 (Escherichia coli) -hemolysin 蛋白質外泌機制 [1]
附錄2 枯草桿菌 (Bacillus subtilis) 漆酶 CotA 與銅離子結合位置關係 [20]
附錄3 表現載體 pQE-30 Xa 圖譜
載體上 Multiple cloning site (MCS) 可供外源基因插入；6xHis 為 Histidine tag，供純化蛋白質標記；Ampicillin 抗性基因可供篩選轉形成功菌株。圖譜 載自 QIAGEN 公司網站 (www.qiagen.com)。
附錄4 表現載體 pEXP5-CT/TOPO® 圖譜
載體上 TOPO® recognition site 供外源基因插入；6xHis 為 Histidine tag，供 純化蛋白質標記；Ampicillin 抗性基因可供篩選轉形成功菌株。圖譜載自 Invitrogen 公司網站 (www.invitrogen.com)。
附錄 5 本研究使用之訊號序列
附錄6 本研究使用相關培養基及試劑配方
Separating gel (per 10 mL) Stacking gel (per 5 mL)
A solution 4.15 mL 0.66 mL
5× non-reducing SDS sample buffer (per 100 mL)
Tris 3.03 g
EDTA 0.18 g
Glycerol 50 g
Bromophenol Blue 0.05 g
*pH 6.8, Store at 4°C
10× TGS buffer (per 1 L)
Tris 30.28 g
Glycine 114.13 g
SDS 10 g
*pH 8.3
CBR dye reagent (per 550 mL)
Coomassie brilliant blue R-250 0.75 g
Acetate 50 mL
Methanol 250 mL
H2O 250 mL
De-staining buffer (per 1L)
Acetate 100 mL Methenol 200 mL
H2O 700 mL
Laccase reaction buffer
ABTS 0.5 mM
NaOAC 50 mM
CuSO4 0.25 mM
*pH 4.5
Modified R medium (per liter) [37]
Citric acid 3 g
Nutrient solution (per liter) [33]
Citric acid 3 g KH2PO4 6.75 g (NH4)SO4 5 g Na2HPO4 1.18 g
MgCl2 5 g
NH4Cl 0.1 g Glucose 750 g Yeast extract 50 g
Trace metal solution (per mL of 5M HCl) [37]
FeSO4‧7H2O 10 mg ZnSO4‧7H2O 2.25 mg CaCl2‧H2O 1.35 mg MnSO4‧5H2O 0.5 mg CuSO4‧5H2O 1 mg AlCl6‧H2O 0.3 mg (NH4)6Mo7O24 0.1 mg H3BO3 0.2 mg Thiamine-HCl 2 mg
*Trace metal solution is sterilized by filtration