3.1. 納豆菌漆酶 (CotA laccase) 於 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統之表
現3.1.1. 含訊號序列 (signal peptide) 之納豆菌漆酶的建構與表現
利用自納豆菌株B. subtilis natto NTU18 選殖的 cotA 基因序列，分別在 其C 端增加第一型外泌系統訊號序列 E. coli J96 hlyAsp；及其 N 端增加第二 型外泌系統訊號序列：E. coli K12 torAsp、amiAsp、malEsp 及 ompAsp 等，
再以pQE-30 Xa 質體轉形至 E. coli M15 表現。
以100 mL LB 培養基於 500 mL Hinton’s flask 振盪培養轉形完成之 E.
coli M15 並於 25°C 及 37°C、以 0.05 mM IPTG 誘導 CotA laccase 表現 18 小 時後，於培養基中均無法測得漆酶活性。進一步利用超音波破菌後取可溶蛋 白質測試，僅可於25°C 誘導且未修飾訊號序列的對照組 (cotA only) 測得 漆酶活性32.8 mU/mL (如表 2)。
3.1.2. 納豆菌漆酶在胞膜間區 (periplasmic space) 之累積
為了解經修飾具有第二型外泌系統訊號序列的納豆菌漆酶，是否因聚集 於胞膜間區以致無法成功外泌至胞外，故以含100 mL LB 培養基於 500 mL Hinton’s flask 振盪培養各重組 E. coli 並於 25°C 誘導後，使用冷滲透休克法 (cold osmotic shock) 來分離 E coli M15 胞膜間區可溶蛋白質，並測量其漆酶 活性。結果顯示，無論是否修飾具有第二型外泌系統訊號序列，納豆菌漆酶 均有累積在胞膜間區的現象，但未修飾帶有此訊號序列的對照組，其在胞膜 間區所測得漆酶活性仍高於具有修飾訊號序列組別，達93.4±1.09 mU/mL (如
圖1)。顯示訊號序列的存在，未能提升納豆菌漆酶的外泌輸送。
3.2. 納豆菌漆酶於 E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO
®系統之表現3.2.1. 含訊號序列納豆菌漆酶的建構與表現
前述在 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統表現含第二型外泌系統訊號序列納 豆菌漆酶，推測可能受到pQE-30 Xa 質體所設計的 Histidine tag 及 Factor Xa (FXa) recognition site 於目標基因序列 N 端的遮蔽，影響了訊號序列功能，
故將含第二型外泌系統訊號序列的納豆菌漆酶改建構於 pEXP-5CT/TOPO® 質體，並轉形至E. coli BL21 (DE3) 表現。
以100 mL LB 培養基於 Hinton’s flask 振盪培養轉形完成之 E. coli BL21 (DE3)，並分別於 25°C 及 37°C、以 0.05、0.5、1、5、10 mM IPTG 誘導 CotA laccase 表現後，在培養基中仍無法測得漆酶活性。顯示利用上列第二型外 泌系統訊號序列無法外泌生產CotA laccase。
3.2.2. 納豆菌漆酶在胞膜間區之累積
進一步利用冷滲透休克法分離E coli BL21 (DE3) 胞膜間區可溶蛋白質並 測量其漆酶活性。結果如圖2 所示，在 25°C 誘導下，於胞膜間區納豆菌漆 酶的累積，多較37°C 誘導環境為佳。此外，在 0.05-10 mM 等不同濃度 IPTG 誘導下，未含訊號序列的納豆菌漆酶活性表現均高於含有訊號序列的組別。
綜合本階段研究結果，在E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO® 系統中，以 0.05 mM IPTG 於 25°C 誘導表現未含有訊號序列的納豆菌漆酶，於胞膜間 區測得漆酶活性較高，達 367.9±18.3 mU/mL，亦顯著高於表現在 E. coli M15/pQE-30 Xa 系統所得活性，故挑選未含訊號序列組別 (E. coli BL21 (DE3)/pEXP-5CT/TOPO®-CotA only，後簡稱 TOPO-C) 進行後續外泌試驗。
3.2.3. 胞內納豆菌漆酶的釋放
前述試驗顯示，以大腸桿菌異源表現的納豆菌漆酶，即使未予修飾訊號
序列處理，仍可藉由冷滲透休克法分離大腸桿菌胞膜間區蛋白質，而測得目 標蛋白質活性；惟冷滲透休克法雖改善了傳統以超音波破菌等耗能方式取 得胞內蛋白質，卻必須維持在0°C 環境下進行分離，且過程中需多次離心、
振盪、回溶菌體及置換緩衝液，對於工業化生產有所不利。
依據Yang 等人的研究，倘於誘導時同時添加 glycine 及 Triton X-100，可 提升胞膜間區蛋白質的釋放 [10]。為使納豆菌漆酶得以直接釋放至胞外，
及考量未來以醱酵槽進行細胞高密度培養時的菌體穩定性，我們參考 Yang 等人的研究，在誘導表現TOPO-C 時，同時於培養基中添加 0.5-5% (w/v) 不 同濃度的glycine 或 Triton X-100，置於 25°C 下振盪誘導表現 18 小時，將 菌液離心後取上清液測量漆酶活性。結果如圖3 所示，添加 glycine 或 Triton X-100 於培養基，確實能將胞內納豆菌漆酶釋放至胞外，而添加濃度之影響，
以2% glycine 或 Triton X-100 的釋放效果最佳，所釋放至胞外的漆酶活性 分別為38.44±1.85 及 9.85±0.418 mU/mL。
以 SDS-PAGE 蛋白質電泳及活性染色分析法，檢視重組大腸桿菌胞外釋 放CotA laccase 如圖 4。帶有 cotA 基因質體的 TOPO-C 重組大腸桿菌，於 IPTG 誘導時同時添加 2% glycine 及 Triton X-100，取其胞外培養基進行 SDS-PAGE 蛋白質電泳及活性染色，對照未添加及未含有 cotA 基因質體的組別，
經 glycine 及 Triton X-100 處理的組別，在約 40 kDa 處呈現一明顯色帶反 應，並與使用冷滲透休克法分離之胞膜間區蛋白質反應一致，說明了經 glycine 及 Triton X-100 處理後，確能有效釋放累積於胞膜間區的 CotA laccase。
3.3. 漆酶釋放條件的最適化
根據前項結果，利用添加glycine 及 Triton X-100，可將原本僅能於大腸桿 菌胞內表現的納豆菌漆酶釋放至胞外。因此，希望進一步探討外泌生產納豆 菌漆酶的最佳條件，以下試驗之設計是針對生產過程中的最適誘導期及釋放
期分別探討。
3.3.1. 最適誘導期
為了解使用IPTG 誘導及 glycine、Triton X-100 釋放處理的最佳處理期間，
故根據前項結果，於誘導TOPO-C 表現 CotA laccase 時，同時添加 2% (w/v) glycine 及 Triton X-100，並於誘導開始後固定時間點取樣偵測釋放至培養基 內的漆酶活性。結果如圖 5 所示，在加入 0.05 mM IPTG 及 2% glycine、
Triton X-100 進行誘導和釋放後 16 小時，於培養基中測得最高漆酶活性 224.7
±11.6 mU/mL。
3.3.2. 最適釋放期
由前項試驗得知，以0.05 mM IPTG 誘導並以 2% glycine 及 Triton X-100 釋放TOPO-C 胞內納豆菌漆酶，最佳誘導期間為 16 小時。考量大腸桿菌於 誘導過程同時進行胞內物質釋放，會影響菌體正常生長，不利後續細胞高密 度培養時的菌體累積。因此，依據前述所得最佳誘導期間，改良目標蛋白質 釋放策略，先培養並以0.05 mM IPTG 誘導 TOPO-C 於胞內表現、累積 CotA laccase 16 小時，再以 2% glycine 及 Triton X-100 進行釋放。另考量工業化 生產時，倘先收集菌體集中釋放及縮小釋放體積，可提高所得目標蛋白質純 度、減少污染，及降低釋放劑 (glycine、Triton X-100) 使用量等優勢。因此，
本階段實驗調整於16 小時誘導後，先離心收集菌體，並以十分之一體積 (10 mL) LB 培養基回溶，再加入 2% glycine 及 Triton X-100 釋放，並於釋放後
固定時間取樣，觀察釋放至胞外的納豆漆酶活性變化。結果如圖6 所示，同
時以2% glycine 及 Triton X-100 處理的組別，其釋放至胞外的漆酶活性於處 理8 小時後較單以 glycine 或 Triton X-100 的組別明顯提升，並於處理 24 小 時後趨緩，32 小時後單位活性達 10.56±0.068 U/mL，換算 10 倍濃縮前單位 活性約1 U/mL。比較前項試驗結果，胞外漆酶產量確有提高。
3.4. 以細胞高密度培養策略外泌生產納豆菌漆酶
上述試驗已逐步最適化 TOPO-C 外泌生產納豆菌漆酶 CotA laccase 的相 關培養、誘導及胞外釋放條件。在此，進一步利用5 L 醱酵槽以細胞高密度 培養策略來提高重組大腸桿菌細胞數量，再以glycine 及 Triton X-100 釋放 CotA laccase 至胞外，以提升目標蛋白質生產效率及產量。
本階段試驗使用Biostat B (B. Braun, Sartorius, Germany) 5 L 醱酵槽，利用 pH-stat 批次饋料培養 (分別以 4N NaOH 及饋料培養基 (Nutrient solution) 控制 pH 值於 7.0 )，於 37°C 培養 TOPO-C 12 小時後，降至 25°C 並添加 IPTG 及 CuSO4進行CotA laccase 誘導生產，期間於固定時間點取樣並轉置 於50 mL Hinton’s flask，測試添加 2% glycine 及 Triton X-100 於 25°C 振盪 釋放處理24 小時後，測量培養基漆酶活性。結果如圖 7 所示，接種 9 小時 後，生菌數已提高至1.8×1010 CFU/mL，且隨著主培養基內碳源耗盡，pH 值
上升超過7.5，系統自動饋入饋料培養基平衡酸鹼值。此時，監測槽內殘糖
值自饋料後皆維持於 0.1%以下，顯示菌體可接續利用饋料培養基內葡萄糖
生長，使細胞乾重持續累積，細胞乾重最終 (接種後 72 小時) 累積至 38.1 g/L。
納豆菌漆酶外泌方面，經釋放處理後測得漆酶活性於加入 IPTG 誘導後 (接種後 12 小時) 開始累積，並以誘導後 8 小時 (接種後 20 小時) 最高，達 5.72±0.36 U/mL。之後，逐漸下降，誘導後 60 小時 (接種後 72 小時) 為 0.71
±0.19 U/mL。