含訊號序列之納豆菌漆酶重組基因與質體建構

2.2.1. 納豆菌漆酶基因 cotA

本研究使用之納豆菌漆酶基因 cotA，係由本實驗室保有之納豆菌株 B.

subtilis natto NTU18，並由林軒立同學由該菌株中選殖而得，DNA 序列全長 1,542 bp，轉換為胺基酸序列並與 NCBI 登錄之標準菌株 B. subtilis str. 168 spore coat protein A 序列比較，僅 1 處胺基酸序列不同 (Tyr400 → Ala400)，但變異 位置並非位於銅離子所結合之4 個 HXH domain。重組納豆菌漆酶 CotA laccase 最適反應溫度為85°C，相對市售雲芝 Trametes versicolor 最適反應溫度 65°C 為高。另納豆菌漆酶最適反應酸鹼值為4.5；酵素動力學係數 Km為0.176 mM，

Vmax為1.74 M min^-1 [33]。

2.2.2. 訊號序列 (signal peptide, sp)

2.2.2.1. 第一型外泌系統 C 端訊號序列 (C-terminal signal peptide for type I secretion system )

參 照 NCBI 上 經 解 序 之 E. coli J96 hemolysin A 蛋 白 (protein ID:AAA23975.1) 末端第 965-1024 個胺基酸之基因序列，並利用 GeneDesign 工具 (http://54.235.254.95/gd/) 設計引子組 cotA-hlyA-1~6 (如表 1)，分別製備 模板引子混合液 (template primer mix, TPM)：6 組引子混合並以 ddH2O 調配 至終濃度15 nM ；及外引子混合液 (outer primer mix, OPM) ：取 cotA-hlyA-1 與 cotA-hlyA-6 混合並以 ddH2O 調配至終濃度 1.5 M。再以 Polymerase Chain Assembly Method (PCA) 反應 [34] 合成 C 端訊息序列 DNA 片段 hlyAsp。

PCA 反應流程：取 2.5 L TPM、10 L ddH2O 及 12.5 L Q5^® High-Fidelity DNA Polymerase (NEBuilder) 混合，並以下述流程反應：98°C 15 分， 50°C 30 秒，72°C 1 分；98°C 30 秒，50°C 30 秒，72°C 1 分，25 個循環；72°C 3 分鐘後維持於4°C。前述反應產物以 ddH2O 稀釋 5 倍後取 2.5 L，混合 2 L OPM、10 L ddH2O 及 12.5 L Q5^® High-Fidelity DNA Polymerase (NEBuilder) ， 再經98°C 15 分， 50°C 30 秒，72°C 1 分；98°C 30 秒，50°C 30 秒，72°C 1

本實驗針對第二型外泌系統，分別挑選 Sec-dependent (Sec) pathway：

malEsp、ompAsp，及 Twin-arginine translocation (Tat) pathway：torAsp、amiAsp 等較多誘使異源蛋白質成功外泌的訊號序列 (sp)。malEsp 及 ompAsp 分別取 自E. coli maltose-binding periplasmic protein 及 outer membrane protein A 之 N 端序列，該等蛋白質係藉由Sec pathway 運送，且分別與細胞攝入營養物質及 外膜蛋白質的運送有關；而 torAsp 及 amiAsp 則取自 E. coli Trimethylamine-N-oxide reductase 及 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 之 N 端序列，該等 蛋白質係藉由Tat pathway 運送，皆與細胞攝入營養物質有關。

利用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison,WI, USA) 抽取之coli K12 菌株染色體 DNA 作為模板，並分別以 TorAF1、TorAR1；

AmiAF1、AmiAR1；MalEF1、MalER1 及 OmpAF1、OmpAR1 等引子對進行 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)，增殖得 N 端訊號序列 DNA 片段：torAsp、amiAsp、malEsp 及 ompAsp。PCR 反應劑量：模板 DNA 1 L、

0.5 M 預混引子對 4 L 及 Q5^® High-Fidelity DNA Polymerase (NEBuilder) 5

L。PCR 反應流程：98°C 30 秒；98°C 10 秒，55°C 30 秒，72°C 10 秒，30 個循環；72°C 2 分鐘後維持於 4°C。另以 Zero Blunt^® PCR Cloning Kit (Invitrogen) 接合於 pCR^®-Blunt 質體後，轉形於 E. coli DH5增殖後收取質體 DNA 定序確認。

2.2.3. E. coli M15/pQE-30 Xa-cotA-hlyA 表現系統建構

以所合成之C 端訊號序列 DNA 片段及 cotA 基因為模板，並使用 pQE→

cotA、cotA←hlyA、cotA→hlyA、hlyA←pQE 等引子進行 PCR，並以經 smaI 限制酶處理後之pQE-30 Xa 直鏈狀質體，利用 HiFi DNA Assembly Master Mix (NEBuilder) 接合成環狀質體 DNA，轉形至 E. coli M15，並以含 50 ppm kanamycin 及 100 ppm ampicillin LB agar plate 篩選具抗性菌落，並抽取其質 體DNA，定序確認插入質體之序列正確，以 3 mL LB 於 37°C 隔夜培養，取 70 L 加入 30 L 50% glycerol 於-80°C 保存。

2.2.4. E. coli M15/pQE-30 Xa-(Type II signal peptide)-cotA 質體建構

本研究利用Gibson assembly 技術將帶有 signal peptide 之 cotA 基因片段 嵌入pQE-30 Xa 質體，Gibson assembly 係由 Daniel Gibson 於 2009 年所發明，

藉由設計具有相互重疊序列的引子，於兩段待接合的 DNA 添加重疊序列後，

再利用PCR 反應接合。

同時以前項所合成之N 端訊號序列 DNA 片段及 cotA 基因為模板，並使 用 A-TorA-cotA、A-AmiA-cotA、A-MalE-cotA、A-OmpA-cotA 與 cotA-6His 等引子進行PCR，合成 torAsp-cotA、amiAsp-cotA、malEsp-cotA 及 ompAsp-cotA 等片段，混合經過 smaI 限制酶處理後之 pQE-30 Xa 直鏈狀質體，利用 HiFi DNA Assembly Master Mix (NEBuilder) 接合成環狀質體 DNA，轉形至 E.

coli M15，並以含 50 ppm kanamycin 及 100 ppm ampicillin LB agar plate 篩選 具抗性菌落，並抽取其質體 DNA，定序確認插入質體之序列正確，以 3 mL

LB 於 37°C 隔夜培養，取 70 L 加入 30 L 50% glycerol 於-80°C 保存。

2.2.5. E. coli BL21 (DE3)/pEXP5-CT/TOPO^®-(Type II signal peptide)-cotA 質

體建構

以前項所合成種 signal peptide-cotA 片段，利用 pEXP5-CT/TOPO^® TA Expression Kit (Invitrogen)，接合成環狀質體 DNA，轉形至 E. coli BL21 (DE3) ， 並以含100 ppm ampicillin LB agar plate 篩選具抗性菌落，並抽取其質體 DNA，

定序確認插入質體之序列正確，以3 mL LB 於 37°C 隔夜培養，取 70 L 加 入30 L 50% glycerol 於-80°C 保存。