動物實驗

細胞週期蛋白表現 ( Immunohistochemistry ) 細胞凋亡分析

( TUNEL assay )

腫瘤體積測量 nude mice

皮下注射 乳癌細胞株 MDA-MB-231 樟芝發酵液

(AC-10)

抑制轉移蛋白表現 ( Immunohistochemistry )

材料與方法

一、乳癌細胞株(MDA-MB-231)的培養

1 將乳癌細胞株(MDA-MB-231)培養於 DMEM 培養液中，內含 10 %

胎牛血清及抗生素。待細胞長滿後，以 PBS 清洗三次，然後將細胞以

5x10⁶/200μL 懸浮於無菌的 PBS 中備用。

二、裸鼠種系

實 驗 動 物 品 種 及 性 別 採 用 購 自 中 華 民 國 國 家 動 物 中 心 的 BALB/c(nu/nu) mice (5~7weeks old)雌性裸鼠，將其飼養在無菌箱中，並 以自動定時器控制光照週期，06:00~18:00 屬於光照期(light period)，

18:00~06:00 屬於黑暗期(dark period)，實驗進行之前動物先經 7 天之觀 察適應期。

三、裸鼠皮下植入癌細胞以產生腫瘤之動物模式之建立

乳癌細胞(5x10⁶/200μL)以皮下注射的方式將乳癌細胞植入裸鼠背 部右下側，將處理過的裸鼠養育於平常的環境下，每天觀察腫瘤生長情 形，ㄧ週後隨機分組(n=7)。在實驗期間每週測量腫瘤體積大小變化並紀 錄。腫瘤體積以長徑 x 短徑²/2 求得⁽¹⁵³⁾。

四、給予途徑

給予途徑採用腹腔注射且每隻裸鼠同一時段處理。給予期間:每週3 次固定時間給予樟芝(AC-10)共5週，犧牲動物解剖取出腫瘤，測量其重 量與體積，同時也搜集體內其它器官(包括：心臟、肝臟、腎臟、脾臟、

肺臟等)。試驗組別：(1)控制組(生理食鹽水)；(2)低劑量組(55mg/kg , AC-10) ； (3) 高 劑 量 組 (110mg/kg , AC-10) ； (4) 正 對 照 組 COX-2 Inhibitor(2mg/kg , NS-398)。

五、組織包埋和切片 I、材料

Maxwell’s Embedding Wax (邁克斯威爾氏包埋石臘)：Paraffin 100 g + Hance’s Rubber 母液 4 g + Bayberry Wax 7 g + 蜂臘 1 g

II、方法

組織放入10%的福馬林固定後，利用石蠟包埋。

1.包埋

(1)選取適當的金屬製底模，注入石蠟。

(2)夾取組織埋入石蠟。

(3)以包埋匣底部壓蓋組織片，再注入石蠟。

(4)放在室溫下，使它冷卻數分鐘，石蠟組織塊可輕易自底模剝離。

2.切片

(1)剃除組織塊周圍多餘的蠟（粗切）。

(2)將蠟塊置於切片機上固定，調整切片厚度(5 μm)。

(3)進行切片，邊以針頭協助調整切片。

(4)切完後將組織片放入溫水中伸展。

(5)數分鐘後，用載玻片將組織片撈起，並放置 37 ℃烘箱 1 天備用。

六、 樟芝(AC-10)對於活體動物乳癌組織Cyclin D1、PCNA和PAI-1蛋白 表現之影響

利用組織免疫染色分析，此方法最主要的優點是可以偵測出蛋白質 的位置；採用labeled streptavidin-biotin (LSAB)方法(DAKO Co. USA)進 行。

組織免疫化學染色分析

腫瘤組織切片取出後，浸泡二甲苯(xylene)在烘箱60℃、30分鐘脫蠟 後，依序放置於100%酒精中5分鐘、100 %酒精中5分鐘、95 %酒精中5 分鐘、70 %酒精中5分鐘，置於citrate buffer加熱90℃、20分鐘。之後利 用蒸餾水冷卻30分鐘，以磷酸鹽緩衝液洗滌，加入3%過氧化氫溶液作用 5分鐘，以去除組織中內源性的過氧化酵素。加入5% Blocking buffer反 應30分鐘之後，腫瘤組織切片以磷酸鹽緩衝液洗滌後，添加欲測的蛋白 質的初級抗體，分別採用anti-cyclin D₁、 anti-PCNA 及anti-PAI-1之單株 抗 體 。 在 室 溫 下 作 用2 小 時 ， 再 以 磷 酸 鹽 緩 衝 液 清 洗 。 加 入 streptavidin-conjugated horseradish peroxidase作用30分鐘後，加入呈色劑 DAB呈色，結果會在抗原位置上呈現紅色，並以Mayer’s hematoxylin進 行對比染色，最後依序放置於70 %酒精中5分鐘、95 %酒精中5分鐘、100

%酒精中5分鐘、100 %酒精中5分鐘，再用二甲苯(xylene)澄清2 次，最 後封片。在正向光學顯微鏡下計算每一百個細胞中之細胞核被深染之數 目即標記指數(labeling index)，以比較樟芝對腫瘤細胞labeling index的變 化。

七、樟芝(AC-10)促使活體腫瘤細胞凋亡之探討

A. Bcl-2 是 Bcl-2 family 中抗細胞凋亡之蛋白，在許多癌細胞中發現 Bcl-2 和 COX-2 會過度表現而抵抗細胞凋亡。COX-2 之表現也與腫瘤細胞轉 移有關。且在本實驗室先期之體外實驗中已發現AC-10 可調控 Bcl-2 和 COX-2 蛋白表現而誘導細胞凋亡，故在活體實驗中，再以免疫組織化學 染色來判定 AC-10 於活體內對 Bcl-2 及 COX-2 的表現之影響是否與細 胞實驗相同，仍具有相同的效能。

B. AC-10 對乳癌腫瘤中 DNA 斷裂的影響

細胞凋亡時，由於 endogenous endonuclease 的活化而將 DNA 切成 oligonucleosome，這些斷裂的 DNA fragment 末端出現 3'-OH 基，而這 3'-OH 基即可被 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)結合，而偵測 出凋亡的細胞。TUNEL assay (TdT end-terminal labeling)可在腫瘤組織切 片顯現出凋亡細胞的所在；故在活體實驗之 DNA 斷裂現象的分析中，

採用Fragment End Labeling (FragELTM) DNA Fragmentation Detection Kit (Oncogene Research Products Co.)來進行

TUNEL assay kit 試劑

PROTEINASE K: 2 mg/ml Proteinase K in 10 mM Tris, pH 8

5X TdT EQUILIBRATION BUFFER: 1 M Sodium Cacodylate, 0.15 M Tris, 1.5 mg/ml BSA, 3.75 mM CoCl2, pH6.6

TdT LABELING REACTION MIX: 3 vials containing a mixture of labeled and unlabeled deoxynucleotides at a ratio optimized for DNA Fragment End Labeling with TdT

TdT ENZYME: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase

STOP BUFFER: 0.5 M EDTA, pH 8

BLOCKING BUFFER: 4% BSA in PBS

50X CONJUGATE: Peroxidase streptavidin conjugate 50-fold concentrated solution

DAB TABLETS: 3,3’Diaminobenzidine (0.7 mg/tablet)

H2O2/UREA TABLETS: H2O2/urea (1.6 mg/tablet)

METHYL GREEN COUNTERSTAIN: 0.3% Methyl green

步驟

腫瘤組織切片取出後，浸泡二甲苯(xylene)在烘箱 60℃、30 分鐘脫 蠟後，依序放置於100%酒精中 5 分鐘、100 %酒精中 5 分鐘、95 %酒精 中 5 分鐘、70 %酒精中 5 分鐘，置於 citrate buffer 加熱 90℃、20 分鐘。

之後利用蒸餾水冷卻30 分鐘，以磷酸鹽緩衝液洗滌，加入 3%過氧化氫

溶液作用5 分鐘，以去除組織中內源性的過氧化酵素。以磷酸鹽緩衝液

洗滌，再以酵素 proteinase K 在室溫下作用 60 分鐘，再加入 TdT labeling reaction mixture 在室溫作用 90 分鐘，以 TBS (Tris-buffered saline；20 mM Tris-base, 137mM NaCl, 1M HCl, pH 7.6)沖洗，之後加入 Stop solution 於 室溫下作用5 分鐘，再以 TBS 沖洗後，先加入 blocking buffer，再加入 Conjugate reagent，於室溫下反應 30 分鐘，加入呈色劑 DAB (含 3, 3'diaminobenzidine 及 H2O2/urea in TAP/FAUCET H2O)在室溫下作用 10 分鐘，再以0.3%甲基綠(methyl green)作為對比染色，以絕對酒精脫色後 以阿拉伯膠封片。將染好之切片置於正向光學顯微鏡下觀察以每一百個 腫 瘤 細 胞 有 多 少 個 呈 現 細 胞 凋 亡( 即 被 染 成 棕 色 ) ， 稱 為 凋 亡 指 數 apoptotic index。