樟芝(AC-10)調控乳癌細胞之細胞週期與轉移之機制探討; Induction of Cell cycle Arrest and Inhibition of Metastasis in Estrogen-Nonresponsive Breast Cancer Cell (MDA-MB-231) by Antrodia cinnamomea (AC-10) in Vitro and Vivo

全文

(1)中國醫藥大學營養研究所碩士學位論文. 樟芝(AC-10)調控乳癌細胞之細胞週期與轉移之機制探討 Induction of Cell cycle Arrest and Inhibition of Metastasis in Estrogen-Nonresponsive Breast Cancer Cell (MDA-MB-231) by Antrodia cinnamomea (AC-10) in Vitro and Vivo. 指導教授：楊新玲（Hsin-Ling Yang）博士共同指導教授：許游章（You-Cheng Hseu）博士. 研究生：陳皇琦（Huang-Chi Chen）. 中華民國九十六年七月.

(2) 縮寫表 AC-10：Antrodia cinnamomea AML：Acute Myelocytic Leukemia ANT：adenosine nucleotidetransporter ATRA：All-trans Retinoic Acid Apaf-1：apoptosis protease-activating factor-1 CDK：Cyclin-dependent kinase CDKI：Cyclin-dependent kinase inhibitor COX-2：cyclooxygenase-2 CARD：Caspase recruitment domain Caspase：cysteinyl aspartate-specific protease DISC：Death-inducing signaling complex DED ：Death effector domain DNA-PK：DNA-dependent protein kinase DiOC6：3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide ERK：extracellular responsive kinase ECM：Extracellular Matrix FAS-L：Fas ligand FADD：Fas-associated death domain protein FACS：flow cytometry FBS：Fetal bovine serum JNK：c-Jun NH2-terminal kinase/stress-activated protein kinase MMPs：Matrix metalloproteinase MAPKs：Mitogen Activated Protein Kinases I.

(3) PARP：poly（ADP-ribose）polymerase PCNA：proliferating cell nuclear antigen PAI-1：Plasminogen activator inhibitor 1 PI：propidium iodide PBS：Phosphate-buffered saline Rb：Retinoblastoma protein tPA：tissue-type plasminogen activator TIMP：Tissue inhibitor of metalloproteinase uPA：urokinase-type plasminogen activator VDAC：voltage-dependent anion channel VEGF：Vascular endothelial growth factor. II.

(4) 目錄縮寫表-----------------------------------------------------------------Ⅰ 中文摘要--------------------------------------------------------------Ⅷ 英文摘要--------------------------------------------------------------Ⅹ 第一章、緒論---------------------------------------------------------1 第一節、細胞週期------------------------------------------------3 第二節、細胞凋亡------------------------------------------------9 第三節、活化絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)途徑與細胞凋亡-----------------------------------------------------15 第四節、環氧化酵素-2(COX-2)與乳癌之相關性----------18 第五節、腫瘤之侵入與轉移------------------------------------20 第六節、腫瘤動物模式簡介------------------------------------22 第七節、樟芝相關之文獻背景---------------------------------23 第八節、研究動機------------------------------------------------32 第二章、研究方法---------------------------------------------------34 第一節、研究器材------------------------------------------------34 第二節、細胞實驗------------------------------------------------37 第三節、動物實驗------------------------------------------------49 第三章、研究結果與圖表------------------------------------------55 第一節、樟芝(AC-10)對人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)細胞. III.

(5) 週期之影響---------------------------------------------55 第二節、樟芝(AC-10) 活化 MAPK pathway 調控人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)之細胞週期-------------------56 第三節、樟芝(AC-10)對於人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)轉移相關酵素蛋白表現與活性之影響--------------57 第四節、樟芝(AC-10)對於移植人類乳癌細胞株 (MDA-MB-231)的活體動物之影響---------------59 第四章、討論----------------------------------------------------------88 第五章、結論----------------------------------------------------------93 第六章、參考文獻----------------------------------------------------94. IV.

(6) 圖表目錄圖一、細胞週期調控圖示-------------------------------------------------8 圖二、細胞凋亡與細胞壞死的區別--------------------------------------10 圖三、細胞凋亡之訊息調控路徑---------------------------------------- 12 圖四、MAPKs 之訊息傳遞路徑圖---------------------------------------18 圖五、COX-2下游產物PGE2影響細胞生理機制----------------------------19 圖六、MMPs調控機制------------------------------------------------------------22 圖七、樟芝子實體實型態--------------------------------------------------------24 圖八.(A) MDA-MB-231 以不同濃度之 AC-10 處理 24 小時，經流式細胞儀分析之細胞週期分佈---------------------------------------------------62 (B) MDA-MB-231 經不同濃度之 AC-10 處理 24 小時，細胞週期分佈量化圖------------------------------------------------------------------63 圖九.以0、40、80、160、240 μg/mL AC-10處理24小時和以160 μg/mL AC-10處理後在0、4、8、12、18、24小時時間點分析MDA-MB-231 細胞之Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A表現量------------------------64 圖十.以0、40、80、160、240 μg/mL AC-10處理24小時和以160 μg/mL AC-10處理後在0、4、8、12、18、24小時時間點分析MDA-MB-231 細胞CDK4、CDK2、CDC2蛋白表現----------------------------------66 圖十一.以0、40、80、160、240 μg/mL AC-10處理2 4小時和以160 μg/mL AC-10處理後在0、4、8、12、18、24小時時間點分析MDA-MB-231 細胞p21、p27、PCNA之相對表現量--------------------------------68 圖十二.MDA-MB-231經由160 μg/mL AC-10處理後在不同時間點分析 MAPK family protein (ERK1/2、p38、JNK)及其磷酸化之表現-70. V.

(7) 圖十三. MDA-MB-231以MAPK pathway培養1小時後，加入160 μg/mL AC-10培養4小時分析Cyclin D1蛋白表現---------------------------72 圖十四. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於MMP-9蛋白表現與活性之影響---------------------74 圖十五. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於uPA蛋白表現與活性之影響-------------------------75 圖十六. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於tPA活性與分泌量之影響-----------------------------76 圖十七. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於PAI-1蛋白表現和分泌量及TIMP-2蛋白表現量之影響-------------------------------------------------------------------------77 圖十八. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於VEGF蛋白表現和分泌量之影響--------------------79 圖十九.裸鼠移植人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)以腹腔注射AC-10後體重和腫瘤體積變化之影響----------------------------------------------80 圖二十.裸鼠移植人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)以腹腔注射AC-10後觀察腫瘤抑制效果----------------------------------------------------------81 圖二十一. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤的cyclin D1變化--------------------------82 圖二十二. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤PCNA之變化-----------------------------83 圖二十三. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤PAI-1之變化------------------------------84 圖二十四. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤Bcl-2之變化-------------------------------85 圖二十五. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤COX-2之變化-----------------------------86 圖二十六. TUNEL assay觀察AC-10誘導乳癌腫瘤細胞凋亡現象 -------87. VI.

(8) 圖二十七.AC-10抑制乳癌生長機制圖---------------------------------------- 93 表一、Proximate composistion in Antrodia cinnamomea---------------------25 表二、三萜類及多醣體有效成份說明------------------------------------------27. VII.

(9) 中文摘要. 樟芝(Antrodia cinnamomea)是一種生長在牛樟樹上的蕈類，為台灣特有中藥，尤其具有抗腫瘤之功效。在本實驗室已證實樟芝發酵液 (AC-10)具抗乳癌作用，會誘導乳癌細胞之細胞凋亡，但詳細機轉未探討。因此本論文將由細胞實驗(in vitro)和動物實驗(in vivo)兩方面來探討AC-10調控乳癌細胞株(MDA-MB-231)細胞週期與轉移之機制。. 在細胞實驗中發現 AC-10 在劑量與時間效應上皆會降低乳癌細胞之 Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、Cyclin A 和 PCNA 蛋白表現，增加 P27 和 P21 蛋白表現，同時 AC-10 可經由活化 JNK pathway 調控 Cyclin D1 表現，使細胞週期停滯在 G0/G1 期。本研究亦探討 AC-10 對 MMP-9、uPA、tPA、PAI-1、TIMP-2 及 VEGF 等乳癌細胞轉移相關因子之影響。結果由西方墨點法得知 AC-10 可減少 MMP-9、uPA 和 VEGF 蛋白表現，但會增加 PAI-1 及 TIMP-2 蛋白表現，以 zymography assay 也發現 MMP-9、uPA 和 tPA 之酵素活性受到抑制。另外進一步利用酵素連結免疫吸附法發現 AC-10 可抑制 VEGF 及 tPA 的分泌量，但會增加 PAI-1 的分泌量。. 在動物實驗方面，給予注射AC-10之實驗組其腫瘤顯著小於控制組，利用免疫組織染色發現腫瘤組織中調控細胞週期演進之蛋白 Cyclin D1、PCNA其抗原性顯著低於控制組，而與轉移相關之PAI-1 蛋白其抗原性顯著高於控制組。另外，免疫組織染色也觀察到實驗組腫瘤組織Bcl-2和COX-2之表現低於控制組，進一步利用TUNEL assay 發現給予AC-10之實驗組有細胞凋亡情形。綜合上述細胞實驗和動物實驗之結果，證實AC-10藉由調控乳癌 VIII.

(10) 細胞之細胞週期蛋白表現而誘導細胞週期停滯，進而導致細胞凋亡。在腫瘤轉移方面AC-10會影響乳癌腫瘤轉移之相關酵素表現與活性，來抑制癌細胞之轉移。因此AC-10在未來醫藥之應用上可望成為具潛力的抗乳癌藥物。. Keyword：樟芝（Antrodia cinnamomea, AC-10），轉移（Metastasis），細胞凋亡（Apoptosis）、細胞週期（Cell cycle）、活體動物抗癌試驗（Xenograft tumor assays）. IX.

(11) Abstract Antrodia cinnamomea is well known in Taiwan as a traditional Chinese medicine. Plants possess many phytochemicals with various bioactivities , which include anticancer activities. In this laboratory analyzed the Antrodia cinnamomea fermentation fluid (AC-10) which had anti-breast cancer effect and could induce the breast cancer cell apoptosis, but mechanisms was unclear. In this study, we have addressed the cytostatic and apoptosis effects of AC-10 on breast cancer cell line (MDA-MB-231) in vitro and in vivo. Treatment of MDA-MB-231 with AC-10 resulted in the inhibition of cell proliferation,arrested of cell cycle in G0/G1 phase and commitment to apoptosis. The results also demonstrated that down-regulate the expression of cell cycle progress factors Cyclin D1, CDK4, Cyclin E, Cyclin A and PCNA , and up-regulate the expression of cell cycle progress factors P27 and P21 in dose- and time-dependent. simultaneously AC-10 may activate JNK pathway to regulate Cyclin D1 expression, induce arrest of cell cycle in G0/G1 phase. This research also discusses treatment of MDA-MB-231 with AC-10 effect metastasis relevant factors of breast cancer cell as MMP-9, uPA, tPA, PAI-1, TIMP-2 and VEGF. The result also demonstrated that down-regulate the expression of MMP-9, uPA and the VEGF,and up-regulate the expression of PAI-1 and the TIMP-2. By zymography assay, the activity of MMP-9, uPA and tPA is suppressed. Furthermore by the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay also analyzed AC-10 which suppressed VEGF and the tPA secretion, but can increase PAI-1 the secretion. Our results revealed that treatment of AC-10 inhibited MDA-MB-231 tumor growth in experiments. Whereas, AC-10 did not show any side effects X.

(12) in these in vivo studies. By the Immunohistochemistry, in tumour regulate cell cycle protein of Cyclin D1, PCNA expression obviously is lower than the control group, but higher than the control group of PAI-1which its antigen with metastasis relevant. Moreover, the Immunohistochemistry also observes the experimental group tumor to Bcl-2 and the COX-2 is lower than the control group. By TUNEL assay ,. that induce apoptosis in. experiment groups which injected AC-10. Our results suggest that AC-10 induce arrest of cell cycle in G0/G1 phase.AC-10 also effect enzyme expression and metastasis in the breast cancer tumor, which suppress the metastasis of the cancer. Therefore, AC-10 had could be used as a health food preventing and alleviating MDA-MB-231 proliferation and possess the potential to be developed as an anticancer drug.. Keyword ： Antrodia cinnamomea; Metastasis; Apoptosis; Cell cycle; Xenograft tumor assays. XI.

(13) 第一章緒論近年來，癌症的發生高居國人十大死因的第一位，而其中乳癌更成為危害我國婦女健康及生命的重大疾病。台灣地區婦女乳癌在十大癌症的發生率與死亡率分居第二位與第四位，國內女性乳癌的發生率雖然較西方國家低，但國內乳癌的發生年齡卻較西方國家為低，東方人乳癌發生年齡大約45 歲，西方婦女乳癌發生年齡大約50 歲(1-3)。影響乳癌發生之危險因子，包括飲食習慣、環境因素、體重、年齡、懷孕史、月經史及荷爾蒙製劑之使用等(4)。因此女性乳癌在國內公共衛生的防治上，就顯得格外重要。探討乳癌的形成原因，對乳癌防治在衛生政策上，可以提供必要的方針，另一方面，期望能降低乳癌的發生率。. 病因乳癌的病因尚不能完全明瞭，癌症的形成是環境因子及細胞生長過程中之基因變異所導致(5)。目前對於乳癌的發生之複雜致病原因歸納為環境性因子（如社經地位、飲食習慣、乳房受放射線的輻射、口服避孕藥、地理分佈等）及個體性因子（如荷爾蒙失調、乳腺疾病、乳癌家族病史等）其中以乳癌家族病史為重要的危險因子，顯示乳癌的發生與遺傳有密切的關係。. 乳癌之臨床治療方式乳癌的治療必須根據疾病的階段、患者年齡、患者是否處於更年期、腫瘤大小及腫瘤表面是否具有某些荷爾蒙的接受器而決定(6)包括： 1.手術切除 1.

(14) 2.放射治療(7) 放射線治療可縮小腫瘤或在手術後摧毀可能殘餘的癌細胞。 3.荷爾蒙治療 a.卵巢切除術(ovariectomy)(8) b.抗雌性激素藥 (Antiestrogen drugs)(9-14) c.減少雌性激素產生的藥物(Aromatase inhibitor)(15) d.Progestogens(16,17) e.Pituitary down-regulators(18) 4.化學藥物治療化學療法是使用抗癌(細胞毒殺)藥，破壞癌細胞。化學療法對於 hormone-insensitive 乳癌是主要的治療方法。在過去，乳癌病患所使用的抗癌藥物包括DNA alkylators、intercalators、 antimetabolites、antitumor antibiotics 以及 tubulin inhibitors(19) 。 1970 年代，臨床治療主要使用 doxorubicin和epirubicin這兩個anthracyclines，它們會和DNA結合，抑制 RNA和蛋白質的合成。它們也會產生free radical，阻斷topoisomerase Ⅱ，使DNA不能分裂。而目前taxanes類(paclitaxel、docetaxel)是最常被使用的化療藥物。Taxanes會和tubulin結合，引起tubulinpolymerization。由於 microtubule必須在polymerization和depolymerization之間取得平衡，而 taxanes會破壞此平衡，使乳癌細胞之細胞週期停滯。. 5. 化學預防(chemoprevention) 化學預防(cancer chemoprevention)，意指利用天然藥物或食材來達到避免癌症發生或抑制腫瘤之生成；目前已知在多種中草藥或食材中，可能存在含有具生理活性之化學物質且可能有抗腫瘤細胞生長之化合. 2.

(15) 物(20)。近年來陸續發現中草藥萃取物或天然食材中含有許多活性分子，除一般生理活性外，在細胞或動物實驗中甚至具有抗癌功效。有許多文獻指出多酚類化合物、三萜類、多醣體等等，具有化學預防之功效可被作為預防癌症發生之有效物質。而其作用機制可能與清除自由基之抗氧化特性或調控細胞內訊息傳遞有關，進而預防癌症的發生。根據研究文獻指出民間常用之中草藥如：靈芝、黃芩、人蔘、芍藥、樟芝等等以及天然食材如：菇類、十字花科蔬菜、香椿、茶葉等皆存有化學預防功效之活性物質。對於癌症的治療不論是何種方式治療皆可能引起副作用，故研發新的抗癌藥物是刻不容緩。但是研發新的抗癌藥物是一個複雜且耗時的過程，新藥的安全性及有效性最終必須經過臨床試驗加以證實，所以從天然食材或中草藥中發掘對於癌細胞具有生長抑制或誘導癌細胞凋亡之生物有效性成分是現在對於抗癌藥物研發的新趨勢。. 第一節細胞週期細胞增生(cell proliferation)是細胞生命活動的重要特徵之一，細胞藉著複製由原來的親代細胞(mother cell)變成兩個子代細胞(daughter cell)，來倍化自己的數目，這種規律且複雜的動作稱為細胞週期(cell cycle)。在正常細胞之生長過程中，DNA 的套數會由2N變為4N，之後細胞由一分為二。細胞週期可區分為四個時期分別為Interphase(G0、 G1、S and G2 phase)及M phase(21)(圖一)。. Gap 0 (G0) phase：細胞處於休眠期，可能為暫時性或永久性的停止生長。當細胞得到訊號指使，會快速返回細胞週期，分裂增殖。如結締組織中的纖維母細胞，平時並不分裂，一旦組織受到傷害，它們會返回細 3.

(16) 胞週期，分裂產生大量纖維母細胞，分佈於傷口部位，使傷口癒合。如神經細胞(neuron)發展到最後階段便不再生長。. Gap 1 (G1) phase：此期之細胞開始生長，細胞大小增加，同時產生RNA 及合成蛋白質，目的是為DNA 複製做好準備。在G1 phase的晚期有一個特定時期，稱為限制點(restriction point)或檢查點(checkpoint)。如果細胞走向分裂，則可以通過限制點進入S phase，開始合成DNA。. Synthesis (S) phase：DNA 合成期，為了使分裂後的二個子細胞相似，必須複製使含量增加一倍。. Gap 2 (G2) phase：DNA複製到有絲分裂的期間，此時細胞核內DNA的含量由G1 phase的2n變成4n。G2期也存在限制點，檢查DNA是否完成複製，細胞是否生長至合適大小，環境因素是否有利於細胞分裂等。. Mitosis (M) phase：細胞分裂期，這個階段的細胞停止生長及蛋白質合成，所有細胞的能量集中在複雜而有規律性的細胞分裂以期得到兩個相似之子細胞。真核細胞的細胞週期中，共有三個檢查點，第一個檢查點在G1 phase 的晚期，也就是要進入S phase前的檢查點，稱之為G1 Checkpoint，它主要檢查細胞的大小、營養、生長因子，以及DNA是否受損；第二個檢查點在G2 phase的晚期，也就是要進入M phase前的檢查點，稱之為G2 Checkpoint，它主要檢查細胞的大小和DNA的複製過程是否完全，每次進入S phase或M phase檢查是否一切準備就緒，才可以接著進行DNA的. 4.

(17) 合成或是細胞分裂作用。在G1 Checkpoint和G2 Checkpoint當中，要是 DNA有受損，細胞就會進入Rest state(G0)，待DNA修補完後再進入下一個phase，在M phase的過程中也有一個檢查點，稱之為Spindle Assembly Checkpoint，它主要檢查染色體是否附著在紡綞體(spindle)上。在文獻中指出，當DNA受損時，週期便無法通過檢查哨而停下(Cell cycle arrest)，此時細胞內會進行DNA的修復，一旦修補完成時才進入下一期，若是發現有無法彌補的錯誤時，細胞則選擇走向凋亡(apoptosis)，以避免錯誤遺傳至下一代(22)。細胞，為了維持整個細胞週期的正常運轉，細胞內會利用許多不同的蛋白，形成許多不同的複合體，來掌控細胞週期的正常運行。經由一系列特殊的Cyclin-CDK(Cyclin-CDK complex)的活化與否來調控細胞週期進行，細胞的增生。對於多樣的抑制增生(antiproliferative)訊號，包含有DNA損傷(DNA damage)、分化(differentiation)、接觸性抑制(contact inhibition)、和衰老(senecence)則會促使CDK的抑制者來負向調控細胞週期的進行(23-26)。CDK在細胞週期的進行中，會常態性的表現，而Cyclin 則會受到Cyclin gene的活化，或是Ubiquitin的水解作用所調控(27)。這些蛋白包含：. 一、Cyclins週期蛋白家族 Cyclins家族，主要在細胞週期中被合成。目前已知至少有8種Cyclins 的存在，分別為A、B1,2,3、C、D1,2,3、E、F、G及H，這些Cyclins在 N- 端與 CDKs 鍵結處皆具有約 150 個胺基酸的相同區域，稱之為 cyclin-box(28-31)。cyclin-box媒介Cyclins與CDKs的結合。Cyclins C、D以及E，主要存在於G1 phase，並在G1-S的過渡期間被分解。而Cyclins A. 5.

(18) 與B被稱為mitotic cyclins，穩定的存在於interphase，但在mitosis時會迅速分解(32)。而Cyclin H則會和 CDK7形成一具有酵素活性的複合物，進而活化cdc 2 (CDK1)及CDK2(31)。 (一) Cyclin A；Cyclin A在細胞週期的G2/S phase出現(33)。它目前較為了解的功能，是促進DNA 複製或中心體複製(34)，所以它與cyclin B一起被稱為mitotic cyclin。 (二) Cyclin B 細胞週期進行至G2/M，B型態的cyclin會作用在此間期，它與cdc2複合成maturation-promoting factor (MPF)，啟始了染色體凝集、核膜破裂與紡垂絲形成的機制，進而引導染色體在子細胞作均等的分裂。 (三) Cyclin D 分為D1、D2及D3三種基因序列相似的蛋白，它們經由生長因子 (mitogen)的作用，在短時間內濃度突然增高，進行細胞週期的啟動。有研究指出，它們是細胞內與細胞外生長環境溝通的橋樑(35)。一般而言，cyclin D1是促使細胞由G0 phase進入G1 phase的因子(36)，D2與D3則具有組織專一性(tissue specificity)，較常在T 細胞型態的白血球出現，其他組織例如乳癌組織則較少或沒有表現 (37). 。他們分別會與cdk4或cdk6形成複合物，促進細胞經由G0 phase. 進入G1 phase，進行細胞生長。 (四) Cyclin E 則與cdk2作用，會磷酸化RB1蛋白，促使E2F蛋白釋放，執行由G1 phase轉入S phase作DNA複製的功能(38)。cyclin E會因本身調節機制或經由E2F、TGF-ß 的誘導而在G1/S增高濃度(39)，之後作用在細胞週期其他基因上，以促使細胞週期持續進行(40)，現有研究發現，cyclin E也作用於中心體的複製功能(41)。. 6.

(19) 二、Cyclin-dependent kinases (CDKs)週期蛋白依賴激酶家族 Cyclin-dependent kinases (CDKs)是一群蛋白激酶家族，會和特殊的 Cyclin 結合而活化。目前已知共有 7 種 CDKs 被發現，分別是 cdc 2 (CDK1)、CDK2、3、4、5、6、7。細胞在G0/G1時期，CDK4、5及6會和Cyclin D家族結合；而CDK2也會與Cyclin D家族結合，但主要還是在 G1及G1-S過渡期與Cyclin A及E結合。如上述所提及，CDK7會與Cyclin H結合，並磷酸化cdc2、CDK2或RNA polymerase的C端次單元體(42-43)。 cdc2主要存在S、G2以及M phase，並與Cyclin A及B結合(44)。. 三、Cyclin-dependent kinases inhibitors (CDKIs)週期蛋白依賴激酶抑制因子細胞週期中，除了上述Cyclins與Cyclin-dependent kinases的正向調控因子外，另有一家族擔任著負向調控的角色，稱之為Cyclin-dependent kinases inhibitors(CDKIs)(44-46)。在哺乳類細胞中，CDKI主要可分為兩大族群，一為INK4家族，另一為KIP/CIP家族。在INK4家族(命名由來為 inhibit cdk4)，特別針對抑制的目標為cyclin D-dependent kinases(47-48)， INK4 proteins 功能為抑制Cyclin D/CDK4之結合及Cyclin D/CDK6之結合而達G1 phase的控制；另外INK4 proteins可抑制低磷酸化的視網膜原瘤蛋白 (hypophosphorylated retinoblastoma protein) 與轉錄因子 (transcriptional factor, E2F)結合，進而抑制S phase基因的轉錄作用，最終造成G1 phase停滯(49-51)。INK4 proteins其主要成員有p14、p15 (INK4B)、p16 (INK4A). 、p18(INK4C) 以及p19(INK4D) 。另一個族群為KIP/CIP家族，包括了. p21(CIP1/WAF1/SDI1) ，p27(KIP1) 以及p57(KIP2) 。KIP/CIP家族所影響的層級較. 7.

(20) INK4家族為廣，其所調控的蛋白包括Cyclin E/CDK2、Cyclin D/cdc2、 Cyclin D/ CDK6、Cyclin A/CDK2及Cyclin B/cdc2等。. Adrian et al., 2000. 圖一、細胞週期調控圖示. 四、細胞週期與癌症許多研究證實，腫瘤細胞會透過genetic和epigenetic的機轉，影響細胞週期相關之調控因子(如Cdk inhibitor的喪失或cyclins的過度表現等 ) ，使細胞週期運行失控而導致細胞癌化 (carcinogensis) 和 cancer promotion。此外，細胞週期檢查點功能失調也是造成細胞癌化的重要因素之ㄧ(52)。在正常情形下，當細胞DNA或紡錘體(spindle apparatus)受損時，細胞會啟動DNA修復機制並暫停細胞週期之進行以確保細胞在複製. 8.

(21) 或分裂前將受損之DNA修復。相對的，如果細胞DNA損傷逕行啟動S phase或M phase就會因為基因體不穩定而導致細胞進行transformation。另一方面，由於癌細胞之細胞週期檢查點功能喪失使得癌細胞對於作用在DNA或微小管的藥物特別敏感。因此相較於正常細胞，腫瘤細胞對這些藥物有較高敏感性(53-54)。有鑒於此與細胞週期相關分子即成為具潛力之抗癌藥物之發展標的(55-56)。. 第二節細胞凋亡一、細胞凋亡之定義細胞凋亡(apoptosis)一詞最早是在1972 年由病理學家John Kerr 所提出(57)，原本字面之意思是指樹葉凋落或掉落。細胞凋亡又被稱為生理上的細胞死亡 (physiological cell death) 或是計畫性的細胞死亡 (programmed cell death)，在生理上扮演著相當重要的角色(58-60)。例如在胚胎發育、免疫系統功能、和組織恆定所需之重要生理過程。除此之外，當正常的細胞受到傷害而發生基因突變時，也會啟動細胞凋亡之機制使突變的細胞死亡，避免突變的遺傳(61)。而在病理學上，也有一些疾病與細胞凋亡有關，例如阿茲海默症(62)、自體免疫疾病和癌症(63)。. 二、細胞凋亡與細胞壞死細胞凋亡主要是發生在單一細胞中。它可分為兩個時期，早期(early stage) 以及晚期 (later stage) 。細胞凋亡早期時，會出現染色質濃縮 (compaction of nuclear chromatin)、細胞質濃縮(condensation of cytoplasm) 以及細胞皺縮(shrunken)等特徵；到了晚期，細胞核會開始發生裂解，然. 9.

(22) 後形成凋亡小體(apoptotic bodies)(64)。在細胞凋亡過程中，並不會發生胞器或是胞膜破裂，因此不會引起發炎反應或危害到周圍組織。細胞壞死會同時發生在一群細胞，也可分為早期與晚期兩個時期。在細胞壞死早期，細胞內之胞器會脹大，細胞膜也會破裂；到了晚期細胞膜也發生破裂(65-67)。由於細胞發生破裂，因此會釋放出發炎物質而引起局部發炎反應，傷害到鄰近的細胞或組織(圖二)。. Andrew et al., 1998. 圖二、細胞凋亡與細胞壞死的區別. 三、細胞凋亡之訊息調控路徑(圖三) 1. 粒線體路徑(The intrinsic or mitochondrial pathway) 在細胞凋亡進行時，粒線體接受了凋亡訊息的刺激，會活化Bcl-2. 10.

(23) 家族蛋白，造成粒線體內外膜不穩定，便會釋出凋亡因子(apoptigenic factors)如：cytochrome c來誘發細胞凋亡的發生(68)。在cytochrome c釋出後，會與細胞質中的apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1)、 procaspase-9結合，形成apoptosome，使得caspase-9活化。而caspase-9與 caspase-8 能共同活化 caspase-3 、 caspase-6 、 caspase-7(69-70) ，使得 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)裂解，使細胞走向apoptosis(71)。在粒線體上亦有另一個凋亡因子， Smac/DIABLO. (second. mitochrodria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI)會與cytochrome c一起從粒線體釋放出來，當cytochrome c與 Apaf-1結合的時候，Smac/DIABLO會與inhibitors of apoptosis proteins (IAPs)結合，抑制IAPs 與caspase-9結合，因此caspase-9活化便不受抑制 (72). 。有學者指出在caspase-9活化的過程中，除了cytochrome c和Apaf-1. 使caspase-9活化外，Smac/DIABLO也需要同時與IAPs 結合，如此才可使caspase-9持續保持在活化的狀態(73-75)。. 2. 內質網路徑(The intrinsic or endoplasmic reticulum pathway) Nakagawa 等生理學家於西元2000年提出了第三條細胞凋亡路徑，內質網路徑(endoplasmic reticulum pathway)，發現caspase-12專一性地存在於內質網中，且觀察到 caspase-12 有和 grp78 、 presenilin-2 和 APP (β-amyloid precursor protein)一同存在於內質網的情形(76)。當內質網受到外在壓力刺激後，可觀察到Ca2+釋出、caspase-12 活化和細胞發生細胞凋亡的現象。有文獻也指出，由內質網誘發的細胞凋亡也可受到Bcl-2 家族的調控，因為在內質網上亦可發現Bcl-2蛋白的存在(77)。. 11.

(24) 3. 死亡受器路徑(The extrinsic or death receptor pathway) 在death receptor方面，當death receptor接受到刺激後，會聚集在一起，形成 death-inducing signaling complex (DISC) ， DISC 會吸引 Fas-associated death domain (FADD) protein這個adaptor molecule的結合 (78). ，然後用death-effector domain(DED)與一個或是多個procaspase-8蛋白. 相接，當多個procaspase-8接連在一起後，便互相切割對方，使彼此活化，接著活化態的caspase-8便會繼續活化下游的apoptotic caspase(79) 使得細胞凋亡發生。另外，目前也發現death receptor路徑會經由活化Bcl-2家族蛋白中的Bid，來達到與粒線體路徑產生互動。當caspase-8活化之後，會切割Bid使其轉換成truncated Bid(tBid)，接著tBid會由細胞質移動到粒線體上，可能經由與Bax或Bak作用 (80) ，進一步促進cytochrome c的釋放 (69-70). ，而其中第一與第二條路徑最後都會使得effector caspase活化。. Gupta et al.,2006. 圖三、細胞凋亡之訊息調控路徑. 12.

(25) 四、調控細胞凋亡之相關分子從上述的各種細胞凋亡之訊息傳遞路徑中，可得知細胞凋亡是經由許多蛋白質來調控的，而這些蛋白質主要分述如下： 1. Bcl-2 家族在粒線體路徑中，Bcl-2家族扮演著重要的角色。在人類中，目前已有20個Bcl-2之家族成員被定義，依其結構特徵可分為三群(81-82)。 (1) Group I (例如：Bcl-2, Bcl-XL等)在結構上具有4個Bcl-2 homology domains (BH1-BH4)，功能上具有anti-apoptotic activity之特徵，平常會與C端的hydrophobic tail嵌插於粒線體外膜上，保護粒線體膜的穩定。 (2) Group II (例如：Bax, Bak等) 在結構上大致與Group I相似，結構上缺少BH4 domain，功能上具有pro-apoptotic activity之特徵。有文獻指出 pro-apoptotic activity 蛋白常會和 anti-apoptotic activity 蛋白形成 heterodimer的形式，而影響anti-apoptotic activity蛋白的作用，破壞粒線體膜之穩定性，造成粒線體內之物質釋出。 (3) Group III (例如：Bid, Bad等)在結構上最大的特徵是只具有BH3 domain(83)。 Bcl-2 家族可能的作用機制： a.形成pore 讓粒線體內的物質釋出。 b.pro-apoptotic 與anti-apoptotic activity蛋白形成heterodimer來調控細胞凋亡的發生。 c.直接藉由與adaptor和procaspases結合來調控caspases的活化。 d.與粒線體膜上之蛋白例如，voltage-dependent anion channel (VDAC)和. 13.

(26) adenosine nucleotidetransporter (ANT) 結合形成 PTP (permeability transition pore)，造成粒線體膜電位快速降低。 e.形成功能較差的選擇性ion channel (83)。 2. Caspases 家族在整個細胞凋亡發生的過程中，會有一群對天門冬胺酸(Asp)具有特異性的蛋白酵素活化，並且對下游的蛋白產生水解作用，造成細胞凋亡的發生，這一群蛋白酵素稱做caspases(84-85)。Caspases在細胞凋亡的路徑中，扮演著極為重要的角色。這類蛋白酵素的活化與否，會直接或間接左右細胞凋亡的進行(86)。Caspases為一胱胺酸蛋白酵素家族(cysteine proteases)，在細胞凋亡發生的過程中，扮演著很重要的角色。目前知道 caspase家族共有14 個成員，可以大略區分為兩個次家族：ICE subfamily (inflammation group)和CED-3subfamily (apoptosis group)(84,87)。平時此酵素是以proenzyme(zymogen)的型式存在於細胞內。當經過蛋白質水解的切割作用後，就會變成有活性的次單位(subunit)，繼而形成完全活化的四合體(tetramer)(88)。此酵素會辨認特殊的胺基酸序列(DEVD)，然後在天門冬胺酸(Asp)後將特定蛋白切割水解(89)。Caspase可由活化路徑區分為： a. 起始者 (apoptotic initiators) caspase-2 ， caspase-8 ， caspase-9 ， caspase-10 b. 執行者(effector caspases) caspase-3，caspase -6，caspase-7。起始者的主要功能在於傳遞細胞凋亡的訊號，而執行者主要是對細胞內的一些蛋白產生水解作用。當細胞接受到細胞凋亡的訊號刺激後，會先使起始者活化，然後由起始者對執行者產生蛋白水解的作用而使執行者活化，接著便由執行者來執行下游蛋白的水解作用(77,85)，引發細胞 14.

(27) 凋亡的發生。目前大略知道約有一百多種蛋白是Caspases的受質(90)，這些蛋白都會受到Caspases 的水解作用而分解或是活化，包含了核膜 lamin、細胞骨架蛋白fodrin和gelsolin、PAK2(p21-activated kinase 2) 、 CAD (caspase-activated DNase)(91-94)等。. 第三節絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)途徑與細胞凋亡活化絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)，是一種serine/threonine kinases的激酶家族，主要參與細胞外各種刺激物的訊息傳遞反應與細胞凋亡的信號轉導過程。MAPKs 級聯反應包括3 個順序的活化過程： MAPK kinase kinase(MAPKKK) 、 MAPK kinase (MAPKK) 及 MAP kinase 。每一種激酶又由不同成分組成。 MAPKKK 由 C—RAF ， B—RAF，MEKK等組成，MAPKK 由MEK，SEK，MKK3，MKK6等組成， MAPK 包括 ERK 1/2(extracellar signal-regluatedkinase) ， JNK/SAPK(c-Jun NH2-terminal kinase)以及p38。MAPK家族有多個成員及多條反應途徑，利用一連串的蛋白質磷酸化反應來進行訊息的傳導。依照細胞種類、cellular stmuli、細胞的環境等因素之不同會使各種 MAPK在細胞的生理功能上產生不同影響(圖四)。茲分述如下:. (1) ERK (extracellular responsive kinase) pathway 最早被發現的分子成員為 MAP-2 kinase (microtubule-associated proteins)，在受到胰島素的刺激便會大量活化的蛋白質激酶，進而造成細胞骨架蛋白質 MAP- 的磷酸化 (95) 。而在之後的研究也發現 MAP-2kinase 之異構酶 ERK1(96) 。有鑑於很多的生長因子以及分裂原 (mitogen) 都可以活化這些酵素，因此將這些酵素群統稱為 15.

(28) mitogen-activated protein (MAP) kinase。其中在細胞分化的過程中，因為 ERK1/2 可以廣泛的表現而能調控整個減數分裂以及有絲分裂的進行。許多物質，包含生長因子、細胞激素，甚至是致癌物質皆可以活化 ERK1/2 之途徑。當 ERK1/2 的途徑被啟動時，能促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡 (97) 。然而，也有許多文獻提出相反的理論，學者們認為 ERK1/2 在多種類的化療藥劑或預防藥物所導致的細胞凋亡機轉中扮演著不可或缺的角色，像是 taxol、resveratrol 以及 quercetin 等(98-100)。這些研究結果，可能與細胞之種類、細胞中誘導細胞凋亡的 inducer 與隨後之訊息傳遞路徑相關。. (2). c-Jun. NH2-terminal. kinase/stress-activated. protein. kinase. (JNK/SAPK) pathway 當細胞受到外界的壓力或是一些cytokine的刺激時，便會活化JNK。 JNK主要有3種isoform：JNK1、JNK2及JNK3，前兩者表現在大部分的組織，而JNK3主要表現在腦部及睪丸(101 。JNKs目前已被證實可透過幾 ). 個機制誘發細胞凋亡。活化之JNKs可將tumor suppressor gene p53磷酸化，因此抑制p53與Mdm2的結合而延緩p53之代謝並延長p53啟動細胞凋亡或細胞週期停滯之活性(102,103)。活化的JNKs也會將Bcl-2和Bcl-XL磷酸化，因此降低Bcl-2和Bcl-XL與Bax的結合能力進而抑制這些蛋白質的抗凋亡效應(antiapoptotic effect)。再者，透過對c-Jun/AP-1 transcription的活化作用，JNKs可藉由轉錄隻活化作用增加Fas ligand的表現而啟動細胞凋亡(103,104)。相對於促凋亡效應(proapoptotic effect)，JNKs亦被證實具 oncogenic activity。JNKs藉由磷酸化作用可活化及延長c-Jun和ATF-2 transcription factor之半衰期，進而活化與延長Ras和Src等相關之cell. 16.

(29) transformation機制(102)。活化的JNKs亦可將Bad磷酸化，因而抑制Bad的促凋亡效應(proapoptotic effect)(105)。. (3) P38 MAPK pathway 目前發現至少存在有四種異構酶: α、β、γ 及 δ (106)。有許多下游的蛋白質會受到 p38 MAPK的作用，包含 MSK1/2(107) 以及P90MAPKAPK2 (108). 。MSK1/2可以活化CREB等轉錄因子(109)。p38s也被證實在細胞凋亡. 與存活上扮演雙重角色。在乳癌細胞受v-Src所活化的p38會藉由調控 cyclin D的作用而增加細胞增生 (110) ；p38s也會透過活化NF-κB(Nuclear factor-kappa B)使腫瘤細胞產生抗藥性(111)，數種cellular stress如anticancer agent、UV raddiation、oxidative stresses、growth factor和ceramides等皆透過p38s而抑制細胞週期的進行或啟動細胞凋亡(112)。p38s對細胞週期之調控乃透過p21的作用使細胞週期停滯在G1 phase(113)，p38s亦可經由磷酸化作用抑制Bcl-XL、growth factors receptor之功能，增加p53與Fas lignad 的作用促使細胞進行細胞凋亡(114,115)。. 17.

(30) http://www.cellsignal.com/. 圖四、MAPKs 之訊息傳遞路徑圖. 第四節環氧化酵素-2(COX-2)與乳癌之相關性環氧化酵素（cyclooxygenase；COX首先在1976年被純化，繼而在 1988年被clone。主要將花生油酸進一步合成為前列腺素(prostaglandin； PGs)，是前列腺素合成過程所必備的酵素之一。目前有兩種isoform 的發現 : COX-1和COX-2。兩者的結構極為相似，兩者最大的不同在於兩者在組織中表現和調節方式的不同。COX-1普遍存在於各類細胞中，屬於一種 Housekeeping gene會持續在細胞中表現，主要是用來維持身體中的恆定作用，如Thromboxane的合成、胃壁完整性和維持正常腎血流； COX-2屬於誘導型基因，需要生長因子、細胞激素和腫瘤促進因子的誘導之下才會進一步的表現(108-111)。能夠調控COX-2的細胞外刺激物如：. 18.

(31) 生長因子 (growth factor) 、細胞介質 (cytokines) 、腫瘤促進劑 (tumor promotor)、組織缺氧(hypoxia)、離子化輻射線(ionizing radiation)以及致癌物(carcinogens) (112-114)。COX-2的表現增加與各種人類癌症的惡性轉變有關，包含有結腸癌(colorectal cancer)、乳癌(breast cancer)、前列腺癌 (prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、胃癌(gastric cancer)、食道癌 (esophageal cancer)、皮膚癌(skin cancer)、肝癌(liver cancer)、胰臟癌 (pancreatic cancer)、腦癌(brain cancer)、肺癌(lung cancer)以及頭頸癌(head and neck cancer)等，已經有足夠的證據顯示COX-2在乳癌之腫瘤形成中扮演一個重要的角色。COX-2影響癌細胞的機制，例如：腫瘤轉移 (metastasis)、侵入(invasion)(115)、血管生成(angiogenesis)(116) 以及癌細胞的生長(117)有關。另外有許多報告指出藉由抑制COX-2與其主要的下游產物PGE2 (Prostaglandin E2)的表現可以有效的抑制癌細胞之生長並進而誘導其走向細胞凋亡的途徑(118,119)(圖五)。. 圖五、COX-2下游產物PGE2影響細胞生理機制 19. Konturek et al., 2005.

(32) 第五節腫瘤之侵入與轉移(Tumor invasion and metastasis) 腫瘤(tumor)是身體的某一部位形成一個細胞集團，它與周圍的細胞組織不同，它可分為良性腫瘤與惡性腫瘤。癌症被廣義的定義為惡性腫瘤，其主要的特徵是可以侵入周圍的組織(invasion)，並可轉移至遠處的其他組織(metastasis)，並在其他組織增殖，最後會導致宿主死亡。癌細胞會分泌細胞外基質分解酵素，包括 serine proteinase、metalloproteinases (MMPs)、cathepsins、plasminogen activator 及 heparanitase，破壞和分解基底膜與 ECM(extracellular matrix)是癌細胞進行侵入與轉移必須之過程。基底膜是一種特化結構，包含有 ECM (extracellular matrix)用來提供正常表皮細胞的附著。ECM 是由 collagen、proteoglycan 和 glycoprotein 所組成，所以癌細胞要進行侵襲和轉移就必須利用蛋白酵素來分解 ECM。其中 MMP-9 及 MMP-2 對於基底膜之破壞和癌細胞轉移扮演著重要角色(116)。基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase；MMPs)：MMPs 是一群體內蛋白酵素家族，一般將 MMPs 家族的成員分為四大類： Gelatinases 、 Collagenases 、 Stromelysins 以及 Membrane-type MMP (MT-MMP)，它們共同的特徵是需要鋅的存在才能執行功能(117)。所有的 MMPs 皆是以未活化酶原的形式分泌到細胞外，此時分子內蛋白的 cystiene 和 catalytic domain 上的鋅結合，MMPs 無法發揮作用。當經由其他的蛋白酶作用後，打斷 cystiene 和鋅的鍵結，使鋅完全外露，即成為活化態。MMPs 在人體內參與許多的生理反應，例如胚胎發育、器官組織形成、細胞凋亡，另外，在許多疾病中也發現了 MMPs 的作用，包括關節炎、心血管疾病、神經疾病、牙周病、胃潰瘍、肝硬化、肺纖維化等等，由於 MMPs 能分解細胞外間質(Extracellular Matrix，ECM)，故被認為和癌症的侵入和轉移有重要關係。在 MMPs 中廣為研究的為 20.

(33) Gelatinases，可分為 72KDa 的 gelatinase A (MMP-2)和 92KDa 的 gelatinase B (MMP-9)兩種，主要可以分解 gelatin，由於 gelatine 是 ECM 中最主要的組成物質，因此 gelatinases 也被認為是 MMPs 中和癌症最有相關性的一群(圖六)。MMPs 的表現受到體內天然抑制物，稱為 Tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)的調控。TIMP 可利用其分子特殊的環狀結構和雙硫鍵，和 MMPs 形成非共價鍵結，並遮蔽 MMPs 中的鋅，以抑制 MMPs 之活性。MMPs 和 TIMP 的平衡對人體相當重要，尤其是在癌症的侵入和轉移的過程，根據研究顯示，MMPs 過量表現時，癌症的侵犯能力會增加；反之，當 TIMP 之表現較高時，癌症的轉移能力則有顯著下降，同時，TIMP 本身也有抑制腫瘤細胞生長的功能。研究文獻也指出 MMPs 也會經由尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator , uPA)和組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator , tPA)活化纖維蛋白溶解酵素(plasmin)進而活化 MMPs，而尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator , uPA)亦受到血漿纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen activator inhibitor 1 , PAI-1)所調控 (118) 。 Folkman 在 1971 年提出惡性腫瘤與血管新生作用有關之理論，認為惡性腫瘤之發展依賴新生血管供給養份及排除代謝廢物，以促進腫瘤的生長及轉移(119)。血管新生作用是經由一連串複雜的反應所構成，在腫瘤剛形成時癌細胞或周圍結締組織，會分泌許多血管生成因子(例如： VEGF)，這些血管生成因子會與鄰近血管內皮細胞上之接受器進行接合，當內皮細胞受到活化時，會分泌蛋白分解酵素將血管基底膜與細胞外基質分解，然而將細胞外基質分解主要是透過 MMP-2 及 MMP-9 參與，而此類酵素在腫瘤轉移及血管新生作用皆扮演著重要的角色。. 21.

(34) TIMPs. MMPs. Modified from Wang ., 2001. 圖六、MMPs調控機制. 第六節腫瘤動物模式簡介近年來，無胸腺裸鼠(nude mice)作為一種新的動物模型，應用於免疫學、腫瘤學、毒理學等各個領域的研究，為免疫學、腫瘤學提供了的有效的研究工具。解剖裸鼠進行組織學檢查，證實裸鼠無正常胸腺，僅有胸腺異常的胸腺上皮，此種胸腺上皮不能使 T 細胞正常分化。淋巴結、脾臟及胸腺淋巴細胞數目很少，故裸鼠為淋巴細胞缺少症的動物。裸鼠 T 淋巴細胞缺損，表現為脾臟細胞失去細胞表面的 θ 抗原和喪失對有絲分裂刺激物反應的能力。θ 抗原是某些淋巴細胞在其 T 細胞活化前的一種分化抗原。由於裸鼠沒有 T 細胞，不能執行正常 T 細胞的功能，所以不會產生細胞免疫，對 Concanavalin A 或 Phytohemagglutinin P 刺激物亦無促進分裂原表現、移植排斥反應及輔助性 T 細胞或抑制性 T 22.

(35) 細胞的生成。無輔助性和抑制性 T 細胞的裸鼠，可明顯地改變它對原抗體的反應。由於裸鼠的免疫缺陷，不排斥來自異種動物的組織移植。因此可作移植人類惡性腫瘤的接受體。. 第七節樟芝相關之文獻背景一、樟芝簡介樟芝(Antrodia camphorata)又名牛樟菇或牛樟芝，僅生長在臺灣特有的國寶級保育樹種臺灣牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)之中空心材內壁組織上。在分類上為多孔菌科，Antrodia 屬的新種(120)。樟芝具有療效是源自於早期原住民特有的飲酒文化有關，導致罹患肝病變的比例居高不下，但在喝過以樟芝熬煮的湯汁後，肝病竟然都能痊癒，以致原住民皆將樟芝視為最珍貴的藥材。它被民間視為「靈芝之王」，是台灣特有的菇類。分佈於台灣山區海拔450-1500公尺之間之牛樟樹樹幹腐朽之心材內壁、或枯死倒扶之牛樟木材陰暗潮濕之表面。其子實體屬多年生，具有強烈衝鼻之樟樹香氣，與一般靈芝類有極大的差異。樟芝子實體外型成板狀或鐘狀，無柄，新鮮者表面成鮭紅色，老熟後顏色成桔色或黃色，菌蓋半圓形，其表面褐色至黑褐色具不明顯的縱皺，有光澤、邊緣平而鈍，菌肉兩層，上層為木材色、下層為象牙色(121)。樟芝最早存在的年代已不可考，因其只生長在台灣特有的牛樟樹上，牛樟樹 ( Cinnamomum kanehirai) 是台灣特有的常綠闊葉大喬木，與一般常見的樟樹不同，使用於雕刻及製作高級家具，生長於台灣海拔200-2000公尺的山區，尤其是桃園角板山、南庄三灣、南投竹山、高雄六龜等四大區。隨著台灣的高度開發大肆砍伐牛樟樹等樟樹類，牛樟樹已難得一見，並 23.

(36) 被台灣列為一級木的國寶級保護樹種。有關樟芝的成分研究，大多著重在大分子的多醣體(polysaccharides)和小分子的三帖類(triterpenoids)和固醇類(steroids)。. 圖七、樟芝子實體實型態. 陳啟禎,2004. 二、樟芝生物活性成分分析樟芝和一般藥用食用的蕈菇類一樣，具有複雜的成分，經由現代的分離及分析方法研究後，目前已知的生物活性成分包括：多醣體 (polysaccharides ，如： β- 葡聚醣 ) 、三帖類化合物 (triterpenoids) 、 (adenosine)、蛋白質(含免疫蛋白)、維生素【如：B、菸鹼酸、麥角固醇 (ergosterol)】、微量元素(如：鈣、磷、鍺)、核酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質素以及血壓穩定物質(如：antrodia acid)等等。整體而言，樟芝在生物活性成分的分析中，多著重於大分子的多醣體、小分子的三萜 24.

(37) 類化合物(triterpenoids)和固醇類(steroids)。其中又以對三帖類化合物的研究最多，而對多醣體的研究則較少。茲將其詳述如下：. 1.一般成分分析樟芝子實體乾重為31%，碳水化合物及纖維素(23%)約佔乾重之 56%，蛋白質約佔7%，粗脂肪(包含游離脂肪酸、單(雙或三)甘油酯、固醇類、磷脂質等)含量高達35%，遠高於其他菇類(2-8%)，此可說明樟芝具有較高量精油的原因。在乾燥的菌絲體中，水分約佔7%，纖維素則約佔7%，並含有豐富之醣類(57%)、蛋白質(10%)及灰分(10%)，其所含可溶性糖超過10%，包括阿拉伯糖醇(arabitol)、海藻醣(trehalose)和葡萄糖 (glucose)，並約含有8mg/g總游離胺基酸。在維生素分析上發現菌絲體之維生素B6 及Niacin含量明顯高於子實體，分別為77 ppm及l65 ng/g，約為子實體之3.5及130倍，但是維生素B12則略低於子實體(6 ppm)。在灰分的分析方面，菌絲體之含量大於子實體(2%)，此可能與培養基中有較高量之無機鹽類有關(122)(表一)。表一、Proximate composistion in Antrodia cinnamomea(陳勁初, 2001). 25.

(38) 2.有效成分分析目前菇類中有效成分的研究多集中於多醣體(polysaccharide)及三萜類(triterpenes)兩種成分(表二)。過去從靈芝及其菌絲體液體培養之菌絲體甲醇萃取物中分離之三萜類衍生物已有超過八十多種。以HPLC分析發現，靈芝有十八種不同類型的三萜類。三萜類的研究上證實具有抑制血小板凝集、抗高血壓、降低血膽固醇及抗HIV 病毒活性(123)。文獻也指出靈芝之三萜類靈芝酸(ganoderic acid)對肝癌細胞(hepatoma cells)具有細胞毒性之抗癌活性。靈芝子實體所分離之三萜類及固醇類具有誘導 Hep3B肝癌細胞計畫性死亡(apoptosis)之細胞毒性(124)。此外，靈芝三萜類也有活化巨噬細胞及T淋巴球細胞釋放細胞激素(cytokine)之抗腫瘤能力，和抑制大鼠mast cell釋放histamine之抗發炎能力。雖然三萜類之藥理作用仍不十分清楚，但其在化學鑑定上，己成為靈芝在藥理學上品質及分類學上的一種指標物質(125)。. 有關樟芝有效成分的研究不多，多由樟芝甲醇或氯仿萃取物中進行層析分離，鑑定出的成分多為類三萜類結構，包括 17 種 4-α-methylergostane type，6種lanostane type及4種l,3-benzodioxloe化合物。有文獻指出樟芝子實體中所含有之多氧化型之三萜類及固醇類，可能是造成樟芝具有強烈苦味之主要成分(126)。樟芝子實體甲醇萃取物可抑制金黃色葡萄球菌和鬚瘡小芽癬菌之生長及抗膽鹼、腸弛緩運動及血小板凝集作用等，經純化鑑定具生物活性之化合物有三萜類zhankuic acid A、B 及C，其中zhankuic acid A和C對P38淋巴癌細胞株有細胞毒殺作用，而zhankuic acid A和B具有anticholinergic及antiserotonergic的效果 (127). 。目前已知多醣體之研究多集中在抗腫瘤(128)、調節免疫(129)、抗泡疹、 26.

(39) 抗病毒(130)等功能上。現已有研究發現一些由菇類純化的多醣體具有抗腫瘤作用，均具有α-1,3 glucan(葡聚糖)的結構。以X－射線繞射分析得知，這種以α-l,3 鍵結的D－glucose骨架呈現3股右旋之螺旋型結構，而有文獻指出此種螺旋結構可能是抗腫瘤作用的重要結構(131)。. 表二、三萜類及多醣體有效成份說明名稱. 三萜類(Triterpenoids). 多醣體. 生化結構. 1.樟芝苦味的來源. 1.由數十萬到數百萬單醣. 2.由30個碳組成六角型或五角型的有. 2.屬於雜多醣. 機化合物總稱. 生理活性. 類組合而成. 3.發現總類200 種以上. 3.有效成份為β-D葡聚醣. 1.誘導癌細胞凋亡【Apoptosis】. 1.刺激免疫系統巨噬細. 2.抑致癌細胞轉移【MMP inhibition】. 胞、T 細胞、B 細胞及. 3.抗發炎【inhibit iNOS and COX-2. 自然殺手細胞活性，強. expression】. 化免疫機能. 4.免疫調節功能 5.降低肝功能GOT、GPT 指數 6.降血壓功能. 1.抗癌. 1.防癌抗癌. 2.消炎解熱鎮痛. 2.預防感冒. 3.保護肝臟機能治療肝炎. 3.促進新陳代謝. 4.消除疲勞增強體力 5.調節血壓預防中風. 27.

(40) 三、樟芝之相關研究 1.安全與毒理之相關研究 a.以每日餵食3 g/kg樟芝菌絲體發酵液給予小鼠連續15天，對小鼠並不具基因毒性，且對化學致癌物dacarbazine所誘發的DNA損傷有明顯的拮抗作用，即有抗基因毒性的功能(132)。 b.連續經口投予樟芝發酵液28天，發現其安全劑量在2 g/kg以下，對血液及尿液生化學的指標均在安全的範圍內(133)。 c.以乾燥菌絲體進行SD大鼠90天活體試驗，發現對肝臟、腎臟及脾臟不具毒性(134)。 d.根據急性毒性試驗，大鼠口服樟芝發酵液半數致死劑量(LD50)高於15 g/kg。在致畸試驗中，餵食SD雌鼠500 mg/kg/day乾燥樟芝發酵液，其子宮重量、生育力指數、受精卵著床前流失率、著床後死亡率及胎鼠平均體重均與控制組無顯著性差異，由胎鼠之外觀、內臟及骨骼檢查結果顯示，乾燥樟芝發酵液並不會造成任何畸胎現象(135)。 e.關於樟芝發酵液在高濃度下具有毒性的報告，以不同體積發酵液與大白鼠初代肝細胞培養，發現在20 μL/mL之系統濃度下，樟芝發酵濾液對並不會造成毒性效應，但是以40或60μL/mL 處理8 小時後，肝細胞乳酸去氫酶滲漏率(lactate dehydrogenase leakage; LDH leakage)顯著高於控制組(p < 0.05)，當以60 μL/mL處理24小時，肝細胞會發生形狀變形(shape deformation)與單層細胞崩潰(destruction of cell monolayer)的現象(136)。. 2.抗氧化功能之相關研究 a.在活體外系統中，樟芝子實體及菌絲體甲醇萃取物均具有清除自由基 28.

(41) 及螯合金屬離子能力，且新鮮子實體之抗氧化力優於乾燥子實體(137)。 b.以紅血球以及人類臍帶血管內皮細胞探討樟芝菌絲體水萃取液是否具有抗氧化及清除自由基的能力，結果顯示其可減少紅血球溶血的現象，減少細胞死亡率，此外，發現其具有毒殺血癌細胞(HL-60cells)的能力，但對正常內皮細胞卻不具細胞毒性，因此推論樟芝菌絲體可能具有保護性的抗氧化作用以及抗腫瘤能力(138)。 c.發酵濾液及菌絲體中之多醣體均可藉由誘導胞內抗氧化防禦能力，以清除胞內活性氧，因此可抑制脂質過氧化作用，減少DNA的氧化傷害。 d.樟芝發酵液與菌絲體均可顯著提升血清總抗氧化狀態，可延長AAPH 誘導紅血球溶血的時間，增加LDL之氧化遲滯期，顯著提升肝臟中 glutathione peroxidase及SOD 酵素活性，因此推測其具有保護高油飲食所誘發的氧化壓力功能(139)。. 3.保肝功能之相關研究 a.樟芝菌絲體發酵濾液具有提升SD大鼠初代肝細胞之抗氧化酵素及抑制脂質過氧化能力。 b.相對地，在活體系統中，也有研究證實樟芝子實體與菌絲體均有降低酒精所誘發之急性肝損傷的功能，而其保護機制應與其所具有的抗氧化與清除自由基能力有關。以腹腔注射及口服四氯化碳誘導大鼠慢性肝損傷後，樟芝菌絲體分別呈現無或有保護肝臟的能力(140,141)。 c.在12.4及24.8 mL/kg B.W/day之劑量下，於四氯化碳投予前一週，每日連續八週餵食樟芝菌絲體發酵濾液，直到實驗終了。結果顯示樟芝菌絲體發酵濾液對四氯化碳誘發大鼠慢性肝損傷有保護的能力，其保護機制應與其提升抗氧化與解毒酵素(glutathione Peroxidase、glutathione 29.

(42) reductase及glutathione S-transferase)活性與抑制肝臟與血漿脂質過氧化能力有關(142)。 d.以四氯化碳連續經口投予八週誘發慢性肝炎，由第四週開始口服投予樟芝發酵液至實驗終了，由血清生化值及肝臟膠原蛋白含量顯示，樟芝發酵液(1g/kg)具有改善四氯化碳誘發慢性肝炎的效果。除此外，在 2g/kg之劑量下，能抑制dimethylnitrosamine 所引起的肝臟纖維化。. 4.增強免疫及抗腫瘤功能之相關研究 a.多數菇類的多醣體皆可刺激免疫系統產生細胞激素(cytokine)或增強巨噬細胞吞噬能力。在體外試驗利用小鼠巨噬細胞株進行，發現樟芝菌絲體多醣不論是水萃取、鹼(NaOH)萃取或發酵液在100 μg/mL時，皆可刺激巨噬細胞分泌TNF-α。另外，從菌絲體萃取及發酵液萃取之多醣體，皆具有刺激巨噬細胞吞噬的能力(143)。 b.以樟芝發酵液(處理組)及無菌水(控制組)餵養小鼠，於四周後，取其脾臟細胞進行培養，結果顯示，樟芝發酵液可顯著增加脾臟細胞IL-2 及 IFN-γ基因的表現；而以LPS 刺激下的脾臟細胞，處理組IL-2及IFN-γ 基因表現亦顯著的增加，由此可知，樟芝發酵液具有提升免疫系統的調節作用(144)。 c.於ConA及PHA處理下，樟芝菌絲體均可促進淋巴細胞增生。於ConA 刺激下，樟芝菌絲體可刺激脾臟細胞產生Thl細胞激素IL-2，抑制Th2 細胞激素IL-4 之生成。 d.曾有報告指出樟芝菌絲體之甲醇萃取物在低劑量下，對肝腫瘤細胞株 HepG2即有很強的細胞毒殺作用，其次為水萃取部份，而發酵液則幾乎不具毒殺能力；但在高劑量(2000 μg/mL)下，均對正常人類白血球細 30.

(43) 胞無毒殺現象。 e. 以不同濃度之樟芝菌絲體甲醇萃取物測試對不同肝癌細胞株 (Hep3B、J5、J2、G2及SK-Hep-1)的抑制生長能力，以MTT方法分析結果發現，對Hep G2的影響最大；研究結果指出，樟芝菌絲體之甲醇萃取物並不會造成Hep G2細胞壞死的現象，進行細胞週期分析發現，在低濃度(62.5 ppm)時會使細胞走向G1 arrest，而高濃度(250 ppm)時會使細胞走向G2/M arrest(145)。 f.無論是經由腹腔注射或餵食樟芝菌絲體多醣，均對植入Sarcoma 180的小鼠腫瘤具有劑量性地抑制能力，並證實此能力與提升免疫細胞的活化有關(146)。 g.樟芝發酵液可抑制經LPS (lipopolysaccharide)刺激之RAW 264.7巨噬細胞所產生的 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 以及 COX-2 (cyclooxygenase-2)蛋白質之表現，並減少其下游產物NO (nitric oxide) 與PGE2 (prostaglandin E2)之生成，因此證實樟芝發酵液具有抗發炎之作用(147)。 h.樟芝發酵液處理之HL-60血癌細胞，會造成HL-60細胞之生長抑制，具有劑量性與時間性的抑制能力，並且能造成HL-60血癌細胞之細胞凋亡(148)。 i.樟芝發酵液處理之MCF-7乳癌細胞，會造成MCF-7乳癌細胞之生長抑制，具有劑量性與時間性的抑制能力，並且能造成MCF-7乳癌細胞之細胞凋亡(149)。. 5.預防心血管疾病及降血糖之相關研究 a.先加入25、50及100 μL之樟芝菌絲體水萃取液與HUVECs預培養24h， 31.

(44) 再在以15mM AAPH誘導 HUVECs傷害16h，結果發現樟芝菌絲體水萃取液分別可增加2l、32及44% HUVECs 的細胞存活率，呈現明顯的劑量效應，因此被認為具有預防心血管疾病的效果。 b.發現樟芝發酵濃縮液單一劑量(2、1、0.5 g/kg）經口投予後，對清醒之自發性高血壓大鼠連續觀察5小時，發現並無降壓作用，此外，連續投予20天也沒有降壓效果(46)。 c.餵予l5%油脂及0.2%膽固醇高脂飲食之雄性倉鼠，在同時餵予樟芝發酵液及菌絲體後，其血清及肝臟中三酸甘油酯及總膽固醇濃度均顯著地降低，因此認為樟芝菌絲體和發酵液對高脂飲食所誘發的高脂血症具有保護能力。 d.樟芝發酵液除了可以抑制經過硫酸銅(CuSO4)處理的LDL之氧化以及 TBARs之形成以外，還能減少氧化性(low-density lipoproteins)LDL對 HUVEC之傷害，故證實樟芝發酵液具有抗氧化與預防心血管疾病的能力(151)。. 第八節研究動機隨著社會進步、工商業之發展，環境污染問題日趨嚴重，加上生活與飲食習慣之日漸西化，癌症已躍居國人十大死亡原因之首，其中乳癌更是威脅女性健康甚深。關於預防癌症之最佳方式，不外是盡量排除日常生活中之致癌物質(carcinogens)，但是無論多努力，日常生活中與致癌物接觸之機會仍是不可避免。因此，如何強化抵抗體內抗癌能力乃是我們必須面對的課題。近來，多食用天然植物中具有降低癌化效用之成分以達到預防癌症發生之化學預防作用(chemoprevention)觀念已逐漸受到消費大眾的重視。不論流行病學或各種體內外實驗有關天然植物相關 32.

(45) 成分的化學性防癌效果，已累積相當多之證據，也獲得相當正面之結果。因此積極尋求、開發有效之健康食品，以期望能藉由生物科技之力，改善國民健康並提高生活品質。野生樟芝僅生長於牛樟樹上，市價昂貴。利用深層發酵原理可大量培養樟芝菌絲體，但由於此培養技術上並無子實體的形成，與一般野生所採食用之樟芝子實體有別，故為了解深層發酵法所產生之菌絲體是否真正具有抗癌能力，在本實驗事先期研究中發現樟芝調控COX-2及Bcl-2 之表現而誘導細胞凋亡。因此本實驗即以樟芝菌絲體對於乳癌細胞 (MDA-MB-231)及裸鼠活體之細胞週期與轉移機制探討，進而使台灣特有種樟芝成為具有更好經濟效益的保健食品。. 33.

(46) 第二章研究方法第一節、研究器材一、實驗材料 (1) 本實驗所使用之人類乳癌細胞株 (MDA-MB-231) 購自 ATCC (American Type Culture Collection) (2) 購自德國 BIO-RAD Protein assay dye reagent 、 30% Acrylamide/Bis solution (29:1) 、 Ammonium persulfate、N,N,N,N-Tetramethyl ethylenediamide(TEMED) (3) 購自德國 GIBCO Dulbecco,s Modified Eagle Media (DMEM) (4) 購自 Hyclone Trypsin-EDTA、Penicillin- Streptommycine (PS)、胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS) (5) 購自德國 Merck Methanol (6) 購自美國 Sigma Sodium chloride ( NaCl )、Potassium Chloride (KCl)、Glucose、Glycerol、 Xylene 、 Triton-X100 、 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 、 Sodium phosphate(NaHPO4) 、 Potassium Phosphate monobasic(KH2PO4) 、 Tris-base、Ethylenediamide-tetraacetic acid (EDTA)、Trypan blue、Pyruvate sodium、Ascorbic acid 、bovine serum albumin (BSA)、 Glycine、Sodium dodecyl sulfate (SDS)、Tris-HCl、β-actin mouse monoclonal antibody (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]) (HEPES) 34.

(47) (7) 購自美國 Santa Cruz 一級抗體： COX-2 goat polyclonal antibody、Bcl-2 mouse monoclonal antibody、 P21 rabbit polyclonal antibody、PCNA mouse monoclonal antibody、 Cyclin E rabbit polyclonal antibody、CDK2 rabbit polyclonal antibody Cyclin B rabbit polyclonal antibody、CDC2 rabbit polyclonal antibody、 Phospho-ERK mouse monoclonal antibody ERK rabbit polyclonal antibody、 MMP-9 goat polyclonal antibody、TIMP-2 rabbit polyclonal antibody、 TIMP-1 rabbit polyclonal antibody、PAI-1 rabbit polyclonal antibody、 uPA rabbit polyclonal antibody、VEGF mouse monoclonal antibody 二級抗體：Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG、Anti- sheep IgG、Anti- goat IgG 購自美國 Cell Signaling 一級抗體： Cyclin D1 mouse monoclonal antibody CDK4 mouse monoclonal antibody Cyclin A mouse monoclonal antibody P15 INK4B rabbit polyclonal antibody P27 kip1 rabbit polyclonal antibody Phospho-SAPK/JNK rabbit polyclonal antibody P38 MAP Kinase rabbit polyclonal antibody SAPK/JNK rabbit polyclonal antibody Phospho-P38 MAP Kinase rabbit polyclonal antibody 35.

(48) (8) 購自美國 CALBIOCHEM U0126、SB 203580、JNK Inhibitor II (9) 購自台灣食品工業研究所樟芝發酵液(AC-10). 二、儀器 (1) 天秤：Sartorius (2) 直之式電泳槽：Hoefer (3) 電泳轉印槽：BIO-RAD (4) 電源供應器：BIO-RAD computer power supply Model 3000 Xi (5) 迷你離心機：KUBOTA 2010 (6) 分光光度計：Spectrophotometer U-2000 (Hitachi) (7) 細胞培養箱：NUAIRETM US AUTO flow (8) 幫浦：HETO SUE 30Q (9) 無菌操作台：NUAIRETM class Ⅱ TYPE A/B3 (10) 倒立式顯微鏡：Nikon Diaphot 300 (11) 超音波震盪器：Bransonic PC 620 (12) 高壓殺菌釜：TOMIN TM32 (13) 數位影像分析儀：Alphar Imager 2000 (14) 水浴槽：FIRSTERTM SIENTIFIC (15) 水平式搖晃器：Oribital shaker OS 701 (16) 感光夾：HypercassetteTM rpn111649 (17) 純水製造機： Millipore milli-Q Plus (18) 震盪器：KS ORBITAL Shaker 36.

(49) (19) X 光感光厎片：Kodak Scientfic Imaging Film (20) ELISA Reader：Dynatech MR7000&Dynex MRX (21) ultracentrifuge：Beckman (22) Flow cytometry：Becton Dickinson (23) pH meter：Denver Basic. 第二節、細胞實驗. 樟芝發酵液(AC-10). 乳癌細胞株 (MDA-MB-231). 細胞週期分布 ( flow cytometry ). MAPKs 蛋白分析 ( western blotting ). 轉移相關蛋白表現 ( western blotting ). MAPKs Inhibitor 細胞週期蛋白表現 ( western blotting ). 調控細胞週期途徑 ( western blotting ). 37. 轉移相酵素活性分析 ( zymography ).

(50) 材料與方法一、細胞培養 (Cell culture)(159) 1、培養液配製 (1) Dulbecco’s Modified Eagle Media ( DMEM )取一包 DMEM 粉末溶於 900 mL 的二次水中，加入 3.7 g NaHCO3、5.9 g HEPES 110 mg Sodium pyruvate。溶解後調 pH 值至 7.4，並將體積定量至 1000mL。以 0.22μm 血清瓶專用無菌過濾膜( bottle top filter )過濾，再加入 1％青黴素 ( penicillin )/鏈黴菌( streptomycin )，混和後保存於 4℃。 (2) 1X 磷酸緩衝液( phosphate-buffer saline；PBS ) 8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、0.2 g KCl、2.9 g NaHPO4･12H2O 溶在 900 mL 二次水中，以 1 N NaOH 調整到 pH=7.2-7.4，並將體積定量至 1000 mL，再經由 121℃、30 分鐘高壓滅菌後使用並存放於室溫備用。. 2、細胞培養條件將人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)培養於 DMEM 培養液中及，各並含 10％加熱去活化之胎牛血清( heat-inactivated foetal bovineserum； FBS)，置於 37℃、5％CO2 培養箱中培養。. 3、繼代培養( secondary culture )：細胞培養在 T75 培養皿 ( flask )中生長至八、九分滿時，將 DMEM 去除，PBS Wash 2 次再用 Trypsin-EDTA 將細胞分離自 T75 培養皿，再加入新鮮之 DMEM +10%FBS 並將細胞液收集至 50ml 離心管中，在室溫下 1000rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 DMEM+10%FBS 混勻細 38.

(51) 胞。取 100μL 細胞懸浮液與等量之 0.4% Trypan blue 溶液混合均勻，用細胞計數器( hemocytometer )計數細胞數，依實驗需要之細胞密度均勻的分至培養盤( culture plates ) 。. 二、細胞週期分析 (Cell cycle analysis) 將 1x106/well 細胞數種入 6 ㎝ dish，使細胞貼附後，以 PBS 洗一次，給予不同濃度樟芝(0-240μg/mL)，在 37℃、5％ CO2 的培養箱進行培養，培養 24 小時後，將不同組別加入 2 mL 的 PBS 清洗，經 trypsin-EDTA 處理使細胞脫落分別移置 15mL 離心管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完全打散後加入 2 mL 的 PBS 清洗離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，將細胞完全打散後，以 4℃ 冰的 70%酒精進行細胞固定步驟(以”SHAKE 3”速度震盪，緩慢將酒精滴入)，隨後將細胞固定步驟完成的樣品置於-20℃冰箱。隔天，將樣品從-20℃冰箱取出後離心 (1500 rpm、5 分鐘) 以去除酒精，之後將細胞完全打散。加入 2 mL 的 PBS 緩衝液清洗 1 次後將細胞完全打散。最後在每個試管中加入 500 mL 的 PI stain 染劑(其量可視細胞數目增減)，避光反應 30 分鐘。以 1 mL pipette 在 15 mL 離心管中抽吸數次後，將細胞移到 FACS 專用管後避光置於冰上。最後以流式細胞儀(Flow cytometry; FACS)進行樣品分析，一秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數據收 12000 顆細胞，數據以 Modfit LTâ 軟體進行處理分析(152). 三、細胞蛋白表現分析 (The analysis of cell protein expression) 1、試劑： (1) Lysis buffer 39.

(52) 10mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.32M sucrose、5mM EDTA、1％Triton X-100、 2mM dithiothreitol(DTT)、1mM phenylmethyl sulfonyl fluoride。 (2) 1.5 M Tris (pH=8.8) 取 91g Tris base 溶在 300 mL 二次水，以 1N HCl 調 pH 至 8.8，再用二次水量定量至 500mL 用 0.45μm filter 過濾，4℃儲存 1 個月。 (3) 10% SDS 取 10g SDS，用二次水定量到 100 mL。 (4) Ammonium persulfate 取 0.1g Ammonium persulfate，溶於 1 mL 二次水。 (5) 1.5M Tris (pH=6.8) 取 12.1g Tris base 溶在 40 mL 二次水，以 1N HCl 調至 pH=6.8，再用二次水定量到 100mL，用 0.45 μm filter 過濾，4℃儲存 1 個月。 (6) 10% running gel 8 ml H2O 、 5 ml 1.5M Tris (pH=8.8) 、 6.6 mL30% Acrylamide Mix(acrylamide：bisacrylamide 29：1)、0.2 ml 10% SDS、0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED (7) 12% running gel 6.6 ml H2O 、5 mL 1.5M Tris (pH=8.8) 、8.0 mL 30% Acrylamide Mix(acrylamide：bisacrylamide 29：1)、0.2 ml 10% SDS、0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。 (8) 5% Stacking gel 3.5 ml H2O、0.625 mL 1.5 M Tris (pH=6.8)、0.825 mL 30% Acrylamide Mix、0.05 mL 10% SDS、0.05 mL、10% ammonium persulfate 及 0.05 mL TEMED。 (9) 6X Protein loading dye 40.

(53) 350 mM Tris-HCl (pH=6.8)、12% SDS 、35% glycerol、0.02% bromopherol blue、30% β-meanptoethanol (10) 5X electrode buffer (pH=8.4) 取 54.5 g Tris base、24.8 g Boric acid、4.7 g EDTA2Na、5g SDS，用二次水定量至 1000mL。 (11) Transfer buffer 取 18.2 g Tris base、86.5 g Glycine、1200 mL methol，用二次水定量至 3 升。 (14) 1X PBS 取水 800 mL 二次水，加入 8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4.12H2O，調 pH 7.4，並定量 1000 mL。 (15) Washer buffer 500 mL PBS 再加入 500μL Tween-20。 (16) Block buffer 取 5% 脫脂奶粉溶於 PBS。 (17) 顯影劑取 103 mL developer 加入 370 mL 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的瓶子。 (18) 定影劑取 103 mL fixter 加入 370 mL 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的瓶子。 (19) SuperSignal substrate solution 將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混合，其加入的量是 PVDF 膜大小調整。. 41.

(54) 西方點墨法分析(Western blotting)(149) 實驗步驟： (1) 細胞蛋白質萃取( cytosolic protein extraction ) 將細胞分盤培養在含有10% FBS的DMEM之6 cm dish中，每個dish細胞數為1.0 × 106 個細胞。細胞貼壁後，加入不同濃度樟芝(0-240μg/ml)，在培養箱反應24小時，取出培養盤用刮刀將細胞刮下，收集於50mL離心管中，以1500 rpm、4℃離心5分鐘，去除上清液將細胞移置eppendorf tube加入1000 μL PBS細胞pellet完全打散後以1500 rpm、4℃ 離心5分鐘，去除上清液加入適量lysis buffer將細胞pellet均勻打散，靜置於冰上反應30分鐘，將溶解後之細胞液以12,000 rpm、4 ℃離心30分鐘，上清液即為細胞蛋白萃取液。 (2) 蛋白質濃度定量分析 (Protein concentration assay) 配置不同濃度(0、2、4、6、8、10 μg /mL)之牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA) 標準品，並將欲測定之蛋白質溶液稀釋成適當的濃度。取800 μL之ddH2O加入不同濃度牛血清白蛋白標準品及蛋白質溶液，加入200 μL Protein assay dye (BIO-RAD)，充分混合後靜置5分鐘後測波長 595 nm之吸光值，並利用牛血清白蛋白標準品所求出的標準曲線計算出欲測定之蛋白質溶液之濃度。 (3)聚丙烯醯胺膠體電泳法 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 10%或 12 % running gel，注入電泳玻片間，待凝膠完全後，加入 5 % stacking gel 位於 running gel 之上並插入電泳梳，於室溫下聚合反應 30 分鐘，完全聚合後去除電泳梳，裝置在電泳槽上，並浸泡於 1X running buffer 中(stacking gel 之槽溝要補滿 1X running buffer) 。取 50 μg 之蛋 42.

(55) 白質，加入相同體積的 6×Protein loading buffer(為樣品 1/6 倍的體積)，以 PBS buffer 調整使每一個樣品之體積相同，並以 97℃加熱 6 分鐘(使蛋白質變性)，立即放回冰上靜置 5 分鐘，再將蛋白質樣品及 marker 注入各個電泳膠片槽溝中進行電泳分析，先以 80 V 電壓跑 5 % Stacking gel，30 分鐘，再改變電壓為 100 V，待 marker 完全展開後即停止電泳，再進行蛋白質的轉印。 (4) 蛋白質轉印(transfer protein to PVDF membrane) 取適當大小之 PVDF( polyvinylidene difluoride memberane ) ，先以 methanol 浸潤後再以緩衝液清洗，連同二張 3M paper 放入 transfer buffer 中浸潤。操作時重疊順序由下而上依序為海綿、3 M paper、Gel、PVDF、 3MM paper、海棉，並使用玻棒去除氣泡，放置於濕式 transfer machine 中，以 20 V 的電流轉印 14 小時，將蛋白質轉印到 PVDF 上。轉印後，將 gel 取出觀察轉印之效果；PVDF 則進行西方點墨法。 (5) 免疫點墨法 (Immunoblotting) 轉印好蛋白質之 PVDF memberane 用 Blocking solution 振盪 15 min，以 Blocking solution 作為溶劑分別將欲測之一次抗體稀釋至適的濃度，加入 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，用 Washer buffer 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm。依不同的一次抗體，加入特異作用的二次抗體，稀釋倍數為 5000 倍，置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，用 Washer buffer 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm，以清洗未接合二次抗體，同時也可以降低背景值。將 PVDF membrane 加入 SuperSignal WestPico Chemiluminesent Substrate 溶液，振盪 3 分鐘，將轉印膜用保鮮膜完整包裹，使用 Kodak BioMax light film 壓片(依訊息的強弱調整壓片時間的長 43.

(56) 短)，將底片依序放入顯影劑、水、定影劑，最後再至入水中清洗並停止顯色。以此方法檢視細胞內各個預測蛋白的變化量。. 四、抑制劑之處理(160) 細胞與 ERK 抑制劑 U0126(20 μM)、p38 抑制劑 SB203580(20 μM) 及 JNK 抑制劑 JNK Inhibitor II (20 μM)培養 1 小時後，再加入 160 μg/mL 樟芝(AC-10)與 vehicle control (0.1% DMSO)培養至指定時間。. 五、酵素活性分析 (The analysis of enzyme activity) 1、Matrix Metalloproteinase zymography(161) 利用 Metalloproteinase zymography 分析樟芝(AC-10) 是否能抑制 MMP-9 酵素活性。將 8x105/well 細胞數種入 6 孔培養盤，使細胞貼附後，以 PBS 清洗二次，換成無血清培養液，添加不同濃度樟芝(0-240μg/mL)，並於 37℃、5%CO2 培養 24 小時，收集細胞培養液，於 1000 xg、4℃ 離心 5 分鐘，取等體積上清液加入 6 x dye(1.5 M Tris-HCl(pH6.8), 30% SDS, 60% glycerol, 0.3% bromophenol blue)充分混合靜置 10 分鐘後進行電泳分離，以 8% SDS-PAGE、50V 進行電泳，其 running gel 含 gelatin(1 mg/mL)，當蛋白質標記(protein marker)到達膠體底部即停止電泳。之後將 running gel 以 2.5% Triton-100 溶液室溫作用 30 分鐘，以去除 SDS，再用清水清洗二次後，以 Zymogen developing buffer 於室溫下先作用 30 分鐘後，再換成新的 Zymogen developing buffer，於 37℃環境下繼續作用 18 小時後移除，以清水洗一次，並利用 0.5% Coomassie Blue R-250 (0.5% Coomassie Blue R-250, 50% methanol, 10% acetic acid)染色 30 分鐘，再以脫色劑(50% methanol, 10% acetic acid)脫色，若樣本含有 44.