細胞實驗

樟芝發酵液(AC-10)

細胞週期分布

( flow cytometry )

細胞週期蛋白表現

( western blotting )

乳癌細胞株

(MDA-MB-231)

MAPKs 蛋白分析 ( western blotting )

調控細胞週期途徑

( western blotting )

MAPKs Inhibitor

轉移相關蛋白表現

( western blotting )

轉移相酵素 活性分析

( zymography )

材料與方法

一、細胞培養 (Cell culture)⁽¹⁵⁹⁾ 1、培養液配製

(1) Dulbecco’s Modified Eagle Media ( DMEM )取一包 DMEM 粉末溶於 900 mL 的二次水中，加入 3.7 g NaHCO₃、5.9 g HEPES 110 mg Sodium pyruvate。溶解後調 pH 值至 7.4，並將體積定量至 1000mL。以 0.22μm 血清瓶專用無菌過濾膜( bottle top filter )過濾，再加入 1％青黴素 ( penicillin )/鏈黴菌( streptomycin )，混和後保存於 4℃。

(2) 1X 磷酸緩衝液( phosphate-buffer saline；PBS )

8 g NaCl、0.2 g KH₂PO4、0.2 g KCl、2.9 g NaHPO4･12H₂O 溶在 900 mL 二次水中，以 1 N NaOH 調整到 pH=7.2-7.4，並將體積定量至 1000 mL，

再經由 121℃、30 分鐘高壓滅菌後使用並存放於室溫備用。

2、細胞培養條件

將人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)培養於 DMEM 培養液中及，各 並含10％ 加熱去活化之胎牛血清( heat-inactivated foetal bovineserum；

FBS)，置於 37℃、5％CO2 培養箱中培養。

3、繼代培養( secondary culture )：

細胞培養在 T75 培養皿 ( flask )中生長至八、九分滿時，將 DMEM 去除，PBS Wash 2 次再用 Trypsin-EDTA 將細胞分離自 T75 培養皿，再 加入新鮮之DMEM +10%FBS 並將細胞液收集至 50ml 離心管中，在室 溫下1000rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 DMEM+10%FBS 混勻細

胞。取 100μL 細胞懸浮液與等量之 0.4% Trypan blue 溶液混合均勻，用 細胞計數器( hemocytometer )計數細胞數，依實驗需要之細胞密度均勻 的分至培養盤( culture plates ) 。

二、細胞週期分析 (Cell cycle analysis)

將 1x10⁶/well 細胞數種入 6 ㎝ dish，使細胞貼附後，以 PBS 洗一 次，給予不同濃度樟芝(0-240μg/mL)，在 37℃、5％ CO2的培養箱進行 培養，培養 24 小時後，將不同組別加入 2 mL 的 PBS 清洗，經 trypsin-EDTA 處理使細胞脫落分別移置 15mL 離心管中離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，再將細胞完全打散後加入 2 mL 的 PBS 清 洗離心 (1500 rpm、5 分鐘)。倒掉上清液，將細胞完全打散後，以 4℃

冰的 70%酒精進行細胞固定步驟(以”SHAKE 3”速度震盪，緩慢將酒精 滴入)，隨後將細胞固定步驟完成的樣品置於-20℃冰箱。隔天，將樣品 從-20℃冰箱取出後離心 (1500 rpm、5 分鐘) 以去除酒精，之後將細胞 完全打散。加入 2 mL 的 PBS 緩衝液清洗 1 次後將細胞完全打散。最 後在每個試管中加入500 mL 的 PI stain 染劑(其量可視細胞數目增減)，

避光反應30 分鐘。以 1 mL pipette 在 15 mL 離心管中抽吸數次後，將 細胞移到 FACS 專用管後避光置於冰上。最後以流式細胞儀(Flow cytometry; FACS)進行樣品分析，一秒細胞數不超過 300 顆細胞，每個數 據收12000 顆細胞，數據以 Modfit LTâ 軟體進行處理分析⁽¹⁵²⁾

三、細胞蛋白表現分析 (The analysis of cell protein expression) 1、試劑：

(1) Lysis buffer

10mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.32M sucrose、5mM EDTA、1％Triton X-100、

2mM dithiothreitol(DTT)、1mM phenylmethyl sulfonyl fluoride。

(2) 1.5 M Tris (pH=8.8)

取 91g Tris base 溶在 300 mL 二次水，以 1N HCl 調 pH 至 8.8，再用二 次水量定量至 500mL 用 0.45μm filter 過濾，4℃儲存 1 個月。

(3) 10% SDS

取 10g SDS，用二次水定量到 100 mL。

(4) Ammonium persulfate

取 0.1g Ammonium persulfate，溶於 1 mL 二次水。

(5) 1.5M Tris (pH=6.8)

取 12.1g Tris base 溶在 40 mL 二次水，以 1N HCl 調至 pH=6.8，再用 二次水定量到 100mL，用 0.45 μm filter 過濾，4℃儲存 1 個月。

(6) 10% running gel

8 ml H2O 、 5 ml 1.5M Tris (pH=8.8) 、 6.6 mL30% Acrylamide Mix(acrylamide：bisacrylamide 29：1)、0.2 ml 10% SDS、0.2 mL 10%

ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED (7) 12% running gel

6.6 ml H2O、5 mL 1.5M Tris (pH=8.8) 、8.0 mL 30% Acrylamide Mix(acrylamide：bisacrylamide 29：1)、0.2 ml 10% SDS、0.2 mL 10%

ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。

(8) 5% Stacking gel

3.5 ml H₂O、0.625 mL 1.5 M Tris (pH=6.8)、0.825 mL 30% Acrylamide Mix、0.05 mL 10% SDS、0.05 mL、10% ammonium persulfate 及 0.05 mL TEMED。

(9) 6X Protein loading dye

350 mM Tris-HCl (pH=6.8)、12% SDS 、35% glycerol、0.02% bromopherol blue、30% β-meanptoethanol

(10) 5X electrode buffer (pH=8.4)

取 54.5 g Tris base、24.8 g Boric acid、4.7 g EDTA2Na、5g SDS，用二次 水定量至1000mL。

(11) Transfer buffer

取 18.2 g Tris base、86.5 g Glycine、1200 mL methol，用二次水定量至 3 升。

(14) 1X PBS

取水800 mL 二次水，加入 8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4.12H₂O，調 pH 7.4，並定量 1000 mL。

(15) Washer buffer

500 mL PBS 再加入 500μL Tween-20。

(16) Block buffer

取 5% 脫脂奶粉溶於 PBS。

(17) 顯影劑

取 103 mL developer 加入 370 mL 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的 瓶子。

(18) 定影劑

取 103 mL fixter 加入 370 mL 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的瓶子。

(19) SuperSignal substrate solution

將 SuperSignal I：SuperSignal II＝1：1 混合，其加入的量是 PVDF 膜大 小調整。

西方點墨法分析(Western blotting)⁽¹⁴⁹⁾ 實驗步驟：

(1) 細胞蛋白質萃取( cytosolic protein extraction )

將細胞分盤培養在含有10% FBS的DMEM之6 cm dish中，每個dish細胞 數為1.0 × 10⁶ 個細胞。細胞貼壁後，加入不同濃度樟芝(0-240μg/ml)，

在培養箱反應24小時，取出培養盤用刮刀將細胞刮下，收集於50mL離 心管中，以1500 rpm、4℃離心5分鐘，去除上清液將細胞移置eppendorf tube加入1000 μL PBS細胞pellet完全打散後以1500 rpm、4℃ 離心5分 鐘，去除上清液加入適量lysis buffer將細胞pellet均勻打散，靜置於冰上 反應30分鐘，將溶解後之細胞液以12,000 rpm、4 ℃離心30分鐘，上清 液即為細胞蛋白萃取液。

(2) 蛋白質濃度定量分析 (Protein concentration assay)

配置不同濃度(0、2、4、6、8、10 μg /mL)之牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA) 標準品，並將欲測定之蛋白質溶液稀釋成適當的濃度。

取800 μL之ddH2O加入不同濃度牛血清白蛋白標準品及蛋白質溶液，加 入200 μL Protein assay dye (BIO-RAD)，充分混合後靜置5分鐘後測波長 595 nm之吸光值，並利用牛血清白蛋白標準品所求出的標準曲線計算出 欲測定之蛋白質溶液之濃度。

(3)聚丙烯醯胺膠體電泳法 (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)

10%或 12 % running gel，注入電泳玻片間，待凝膠完全後，加入 5 % stacking gel 位於 running gel 之上並插入電泳梳，於室溫下聚合反應 30 分鐘，完全聚合後去除電泳梳，裝置在電泳槽上，並浸泡於1X running buffer 中(stacking gel 之槽溝要補滿 1X running buffer) 。取 50 μg 之蛋

白質，加入相同體積的6×Protein loading buffer(為樣品 1/6 倍的體積)，

以 PBS buffer 調整使每一個樣品之體積相同，並以 97℃加熱 6 分鐘(使 蛋白質變性)，立即放回冰上靜置 5 分鐘，再將蛋白質樣品及 marker 注 入各個電泳膠片槽溝中進行電泳分析，先以 80 V 電壓跑 5 % Stacking gel，30 分鐘，再改變電壓為 100 V，待 marker 完全展開後即停止電泳，

再進行蛋白質的轉印。

(4) 蛋白質轉印(transfer protein to PVDF membrane)

取 適 當 大 小 之 PVDF( polyvinylidene difluoride memberane ) ， 先 以 methanol 浸潤後再以緩衝液清洗，連同二張 3M paper 放入 transfer buffer 中浸潤。操作時重疊順序由下而上依序為海綿、3 M paper、Gel、PVDF、

3MM paper、海棉，並使用玻棒去除氣泡，放置於濕式 transfer machine 中，以 20 V 的電流轉印 14 小時，將蛋白質轉印到 PVDF 上。轉印後，

將 gel 取出觀察轉印之效果；PVDF 則進行西方點墨法。

(5) 免疫點墨法 (Immunoblotting)

轉印好蛋白質之PVDF memberane 用 Blocking solution 振盪 15 min，以 Blocking solution 作為溶劑分別將欲測之一次抗體稀釋至適的濃度，加 入 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋 轉器上室溫振盪2 小時，用 Washer buffer 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm。依不同的一次抗體，加入特異作用的二次抗體，稀釋倍數為 5000 倍，置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，用 Washer buffer 洗三 次，每次10 分鐘轉速為 100 rpm，以清洗未接合二次抗體，同時也可以 降 低 背 景 值 。 將 PVDF membrane 加 入 SuperSignal WestPico Chemiluminesent Substrate 溶液，振盪 3 分鐘，將轉印膜用保鮮膜完整包 裹，使用 Kodak BioMax light film 壓片(依訊息的強弱調整壓片時間的長

短)，將底片依序放入顯影劑、水、定影劑，最後再至入水中清洗並停止 顯色。以此方法檢視細胞內各個預測蛋白的變化量。

四、抑制劑之處理⁽¹⁶⁰⁾

細胞與 ERK 抑制劑 U0126(20 μM)、p38 抑制劑 SB203580(20 μM) 及 JNK 抑制劑 JNK Inhibitor II (20 μM)培養 1 小時後，再加入 160 μg/mL 樟芝(AC-10)與 vehicle control (0.1% DMSO)培養至指定時間。

五、酵素活性分析 (The analysis of enzyme activity) 1、Matrix Metalloproteinase zymography⁽¹⁶¹⁾

利用 Metalloproteinase zymography 分析樟芝(AC-10) 是否能抑制 MMP-9 酵素活性。將 8x10⁵/well 細胞數種入 6 孔培養盤，使細胞貼附後，

以 PBS 清洗二次，換成無血清培養液，添加不同濃度樟芝(0-240μg/mL)，

並於37℃、5%CO2 培養 24 小時，收集細胞培養液，於 1000 xg、4℃

離心5 分鐘，取等體積上清液加入 6 x dye(1.5 M Tris-HCl(pH6.8), 30%

SDS, 60% glycerol, 0.3% bromophenol blue)充分混合靜置 10 分鐘後進行 電泳分離，以8% SDS-PAGE、50V 進行電泳，其 running gel 含 gelatin(1 mg/mL)，當蛋白質標記(protein marker)到達膠體底部即停止電泳。之後 將 running gel 以 2.5% Triton-100 溶液室溫作用 30 分鐘，以去除 SDS，

再用清水清洗二次後，以Zymogen developing buffer 於室溫下先作用 30 分鐘後，再換成新的Zymogen developing buffer，於 37℃環境下繼續作 用 18 小時後移除，以清水洗一次，並利用 0.5% Coomassie Blue R-250 (0.5% Coomassie Blue R-250, 50% methanol, 10% acetic acid)染色 30 分 鐘，再以脫色劑(50% methanol, 10% acetic acid)脫色，若樣本含有

MMP-9，則在膠體分子量 92 kDa 位置會因 gelatin 被酵素分解而呈現的 透明band。

2、urokinase type plasminogen activator zymography⁽¹⁶¹⁾

取等體積上清液加入 6 x dye 1.5 M Tris-HCl(pH6.8), 30% SDS, 60%

glycerol, 0.3% bromophenol blue)充分混合靜置 10 分鐘後進行電泳分 離，以 8% SDS-PAGE、50V 進行電泳，其 running gel 含 Plasminogen (15 μg/mL)和 Casein(1 mg/mL)，當蛋白質標記(protein marker)到達膠體底部 即停止電泳。之後將running gel 以 2.5% Triton-100 溶液室溫作用 30 分 鐘，以去除SDS，再用清水清洗二次後，以 Zymogen developing buffer 於室溫下先作用30 分鐘後，再換成新的 Zymogen developing buffer，於 37℃環境下繼續作用 18 小時後移除，以清水洗一次，並利用 0.5%

Coomassie Blue R-250 (0.5% Coomassie Blue R-250, 50% methanol, 10%

acetic acid)染色 30 分鐘，再以脫色劑(50% methanol, 10% acetic acid)脫 色，若樣本含有urokinase type plasminogen activator,(uPA)，則在膠體分 子量45 kDa 位置會因 Plasminogen 被酵素分解而呈現的透明 band。

3、Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)分泌測定⁽¹⁶²⁾

藉由免疫分析法定量細胞上清液 PAI-1，將細胞上清液加到事先覆 於 PAI-1 抗體的微孔盤中，培養一段時間後，移除未結合的物質，再加 入 substrate 作用，產生顏色的變化，並立即測試酵素的活性，於 490 nm 具有吸光。吸光值愈高代表樣品中 PAI-1 含量愈多，再利用標準品做系 列稀釋所得到的標準曲線換算樣品中PAI-1 的含量。

試劑

PAI-1 standard Detection antibody Enzyme conjugate diluent Wadh buffer

Sample buffer 10％ Triton X-100 Stop solution

步驟

加入 100 μL standard、control 及稀釋過的 sample 在 4℃反應至隔夜，

抽掉上清液，用wash buffer 清洗 4 次，加入 100 μL 的 Detection antibody，

在室溫下反應 1 小時後抽掉上清液， wash buffer 清洗 4 次。再加入 100 μL 的 Enzyme conjugate diluent 在室溫下反應 1 小時抽掉上清液，用 wash buffer 清洗 4 次，加入 100 μL 的 substrate solution 室溫下反應 20 分鐘，

呈現藍色後加入50 μL 0.5N H2SO4 終止反應 以 ELISA reader 測波長 450 nm 的吸光值。

4、tissue-type plasminogen activator (tPA)分泌測定⁽¹⁶²⁾

藉由免疫分析法定量細胞上清液 tPA，將細胞上清液加到事先覆於 tPA 抗體的微孔盤中，培養一段時間後，移除未結合的物質，再加入 substrate 作用，產生顏色的變化，測試酵素的活性，於 490 nm 具有吸 光。吸光值愈高代表樣品中tPA 含量愈多，再利用標準品做系列稀釋所 得到的標準曲線換算樣品中tPA 的含量。

試劑

PET buffer (PBS-EDTA-Tween 20, powder) tPA Plasma standard

tPA Depleted Plasma standard Detection antibody

Substrate OPD Hydrogen Peroxide Stop solution

步驟

先加入 50 μL PET buffer 至每個 well 後再加入 20 μL standard、

control 及稀釋過的 sample 在室溫震盪(500-600 rpm)反應 1 小時，抽掉上 清液，用PET buffer 清洗 4 次，加入 50 μL 的 Detection antibody，在室 溫震盪(500-600 rpm)反應 15 分鐘後抽掉上清液， PET buffer 清洗 4 次。

再加入 100 μL 的 Substrate 在室溫震盪(500-600 rpm)反應 15 分鐘，加入 50 μL 的 Stop solution 室溫下反應 30 分鐘(避光)， 以 ELISA reader 測波 長 490 nm 的吸光值。

5、Vascular endothelial growth factor (VEGF)分泌測定⁽¹⁶³⁾

藉由免疫分析法定量細胞上清液 VEGF，將細胞上清液加到事先覆 於 VEGF 抗體的微孔盤中，培養一段時間後，移除未結合的物質，再加 入 substrate 作用，產生顏色的變化，並測試酵素的活性，於 450 nm 具 有吸光。吸光值愈高代表樣品中VEGF 含量愈多，再利用標準品做系列 稀釋所得到的標準曲線換算樣品中 VEGF 的含量。

試劑

VEGF Microplate VEGF Conjugate VEGF Standard

Assay Diluent RD1W Calibrator Diluent RD5K Wash Buffer Concentrate Stop Solution

步驟

先加入 50 μL Assay Diluent RD1W 至每個 well 後再加入 200 μL standard 及 sample 在室溫反應 2 小時，抽掉上清液，用 Wash Buffer 清 洗 3 次，加入 200 μL 的 VEGF Conjugate，在室溫反應 2 小時後抽掉上

先加入 50 μL Assay Diluent RD1W 至每個 well 後再加入 200 μL standard 及 sample 在室溫反應 2 小時，抽掉上清液，用 Wash Buffer 清 洗 3 次，加入 200 μL 的 VEGF Conjugate，在室溫反應 2 小時後抽掉上