第三章、 研究結果與圖表
第四節、 樟芝(AC-10)對於移植人類乳癌細胞株
ㄧ、 AC-10對於以皮下注射癌細胞的方式建立活體動物腫瘤生成模式之 影響
以皮下注射的方法將人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)植入裸鼠背部 右下側，約二至三週後可於注射位置觀察到腫瘤團塊。每週測量腫瘤體 積與裸鼠體重變化並記錄之。試驗組別包括：(1)控制組(生理食鹽水)；
(2)低劑量組(55mg/kg , AC-10)；(3)高劑量組(110mg/kg , AC-10)；(4)正對 照組COX-2 Inhibitor(2mg/kg , NS-398)。以腹腔注射的方式給予AC-10，
結果發現在實驗期間各組裸鼠體重無明顯變化(圖十九, A)，腫瘤生長 情形如圖十九, B所示實驗第三週後給予AC-10之組別腫瘤體積顯著小 於控制組。與控制組比較給予AC-10之組別腫瘤生長受到抑制，而且抑 制生長的效果與AC-10之濃度呈正相關(圖二十, A)。在裸鼠犧牲後也 發現高劑量組(110mg/kg , AC-10)有2隻裸鼠無腫瘤生長情形(圖二十, B)。
二、 AC-10 可抑制活體動物乳癌組織 Cyclin D1和 PCNA 之表現 在細胞實驗發現AC-10可經由降低Cyclin D1和PCNA蛋白表現來抑 制MDA-MB-231細胞的增生誘導細胞週期停滯，活體動物移植腫瘤生成 模式中也發現AC-10可有效抑制腫瘤的生長(圖十九, B)。於是利用組織 免疫染色分析腫瘤組織中Cyclin D1和PCNA的變化。實驗結果發現高劑 量組(110mg/kg AC-10)其腫瘤組織中Cyclin D和PCNA蛋白表現與控制 組相比顯著減少分別為52%與38% (圖二十一、二十二)。此部份的實驗 結 果 顯 示AC-10在體外試驗可抑制MDA-MB-231細胞之Cyclin D1和 PCNA表現，於活體動物所建立的乳癌腫瘤組織亦有相同的效果。
三、 AC-10 可誘導活體動物乳癌組織 PAI-1 之表現
血漿纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen activator inhibitor 1 , PAI-1)可經由調控尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator , uPA)進而抑制MMPs表現降低腫瘤轉移機率。在活體動物實驗 中 發 現 注 射AC-10 之 實 驗 組 PAI-1 表 現 增 加 ， 在 高 劑 量 組 (110mg/kg
AC-10)腫瘤組織中PAI-1表現與控制組相比顯著提高33%(圖二十三)。
四、 AC-10 對乳癌組織中 Bcl-2 及 COX-2 表現之影響
Bcl-2 是 Bcl-2 family 中抗細胞凋亡之蛋白，在許多癌細胞中發現 Bcl-2 和 COX-2 會過度表現而抵抗細胞凋亡。COX-2 之表現也與腫瘤 細胞轉移有關。且在本實驗室先期之體外實驗中已發現 AC-10 可調控 Bcl-2 和 COX-2 蛋白表現而誘導細胞凋亡，故在活體實驗中，再以免疫 組織化學染色來判定 AC-10 於活體中對 Bcl-2 及 COX-2 的表現之影響 是否與體外試驗具有相同的功效。結果如圖二十四、二十五所示，與控 制組比較高劑量組(110mg/kg AC-10)其腫瘤組織 Bcl-2 及 COX-2 蛋白表 現顯著減少38%和 54%。而在低劑量組(55mg/kg AC-10) Bcl-2 及 COX-2 蛋白表現雖有降低但其並無統計上之意義。
五、 AC-10 對乳癌腫瘤中 DNA 斷裂的影響
細胞凋亡時，由於endogenous endonuclease的活化而將DNA切成 oligonucleosome，這些斷裂的DNA fragment末端出現3'-OH基，而這3'-OH 基即可被terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)結合，而偵測出凋亡 的細胞。本實驗以腹腔注射AC-10利用TUNEL stain來偵測腫瘤組織之細 胞凋亡的情形，於400倍之倍率光學顯微鏡觀察腫瘤組織切片。結果如 圖二十六所示，注射AC-10後在高劑量組(110mg/kg AC-10)可增加細胞 核被DAB深染的數目，即表示AC-10可引發細胞凋亡。
(A)
40 μg/mL
80 μg/mL
160 μg/mL
240 μg/mL control
圖八.(A) MDA-MB-231 以不同濃度之 AC-10 處理 24 小時，經流式細胞 儀分析之細胞週期分佈。
(B)
圖八.(B) MDA-MB-231 經不同濃度之 AC-10 處理 24 小時，細胞週期分 佈量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比較。
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Phase %
0 20 40 60
80 G1
G2
S
* * *
*
* * *
* * *
(A)
Time (hours)
0 4 8 12 18 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL) 0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
(C)
Time (hours)
0 4 8 12 18 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL) 0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0 AC-10 處理後在 0、4、8、12、18、24 小時時間點分析 MDA-MB-231 細胞之 Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A 表現量。(A) Cyclin D1(B) Cyclin E (C) Cyclin A 之蛋白表現。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；
*代表 P < 0.05 與控制組比較。
(A)
Time (hours)
0 4 8 12 18 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
(C)
Time (hours)
0 4 8 12 15 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL) 0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0 AC-10 處理後在 0、4、8、12、18、24 小時時間點分析 MDA-MB-231 細胞CDK4、CDK2、CDC2 蛋白表現。(A) CDK4 (B) CDK2 (C) CDC2。
結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比 較。
(A)
Time (hours)
0 4 8 12 18 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL)
0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0
(C)
Time (hours)
0 4 8 12 18 24
Protein level (% of control)
0
AC-10 concentration (μg/mL) 0 40 80 160 240
Protein level (% of control)
0 AC-10 處理後在 0、4、8、12、18、24 小時時間點分析 MDA-MB-231 細胞p21、p27、PCNA 之相對表現量。(A) p21 (B) p27(C) PCNA。結果 以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比較。
(A)
Time (min)
0 5 15 30 60 90 120 180 240
Protein lev el (% of control)
0
Protein lev el (% of control)
0
Protein lev el (% of control)
0
Protein lev el (% of control)
0
(C)
Time (min)
0 5 15 30 60 90 120 180 240
Protein lev el (% of control)
0
Protein lev el (% of control)
0
MAPK family protein (ERK1/2、p38、JNK)及其磷酸化之表現。(A) ERK1/2 (B) p38 (C) JNK。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P <0.05 與控制組比較。
(A)
control
U0126
AC-10
AC-10 + U0126
Protein level (% of control)
0
Protein level (% of control)
0
-(C)
control
SP600125
AC-10
AC-10 + SP600125
Protein level (% of control)
0 U0126(B)p38 抑制劑 SB203580(C)JNK 抑制劑 SP600125。結果以平均值
±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比較。#代表 P <
0.05 與 AC-10 比較。
(A)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Protein level (% of control)
0
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
MMP-9 activity (% of control)
0
圖十四. MDA-MB-231 以 0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10 處理 24 小時後對於 MMP-9 蛋白表現與活性之影響。(A)MMP-9 蛋白表現量 (B)MMP-9 活性。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P <
0.05 與控制組比較。
(A)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Protein level (% of control)
0
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
uPA activity (% of control)
0
圖十五. MDA-MB-231 以 0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10 處理 24 小時後對於 uPA 蛋白表現與活性之影響。(A) uPA 蛋白表現(B) uPA 活性。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控 制組比較。
(A)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
tPA activity (% of control)
0
圖十六. MDA-MB-231以0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10處理 24小時後對於tPA活性與分泌量之影響。(A) tPA活性(B) tPA分泌量。結 果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表P < 0.05 與控制組比較。
Concentration (ng/mL)
0 40 80 120 160 240
Secreted tPA (ng/105cell)
0
(A)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Protein level (% of control)
0
Concertration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Secreted PAI-1 (ng/105 cell) 0
(C)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Protein level (% of control)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
* *
*
TIMP-2
0 40 80 120 160 240 (μg/mL)
圖十七. MDA-MB-231 以 0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10 處理 24 小時後對於 PAI-1 蛋白表現和分泌量及 TIMP-2 蛋白表現量之影響。
(A)PAI-1 蛋白表現(B) PAI-1 分泌量(C)TIMP-2 蛋白表現。結果以平均值
±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比較。
(A)
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Protein level (% of control)
0
圖十八. . MDA-MB-231 以 0、40、80、120、160、240 μg/mL AC-10 處 理 24 小時後對於 VEGF 蛋白表現和分泌量之影響。(A)VEGF 蛋白表現 (B) VEGF 分泌量。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=3；*代表 P < 0.05 與控制組比較。
Concentration (μg/mL)
0 40 80 120 160 240
Secreted VEGF (pg/105 cell) 0
(A)
Weeks
0 1 2 3 4 5
Body weight (g)
20 110 mg/kg AC 5mg/kg NS-398
(B)
Weeks
0 1 2 3 4 5
Tumo r vol ume (mm
3)
0(A)
(1) Control (2) 55 mg/kg
(3) 110 mg/kg (4) 5mg/kg NS-398
(B)
(1) Control (2) 55 mg/kg
(3) 110 mg/kg (4) 5mg/kg NS-398
圖二十. 裸鼠皮下植入人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)再以腹腔注射 AC-10 後觀察腫瘤抑制效果。(A)腫瘤大小(B)裸鼠犧牲後取出之腫瘤團 塊。
(A)
(1) Control (2) 55 mg/kg AC-10
(4) 5mg/kg NS-398 (3) 110 mg/kg AC-10
200x
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
Labelin g in dex %
0 20 40 60 80 100 120
* *
*
圖二十一. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤的cyclin D1變化。(A)組織免疫化學染色 分析腫瘤細胞cyclin D1蛋白的表現(棕色為陽性反應) (B)為組織免疫化 學染色之量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P <
0.05與控制組比較。
(A)
(1) Control
(4) 5mg/kg NS-398 (2) 55 mg/kg AC-10
(3) 110 mg/kg AC-10
200x
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
Labeling ind ex %
0 20 40 60 80 100 120
*
*
圖二十二. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤PCNA之變化。(A)組織免疫化學染色分 析腫瘤細胞PCNA蛋白的表現(棕色為陽性反應) (B)為組織免疫化學染 色之量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P < 0.05 與控制組比較。
(A)
(1) Control (2) 55 mg/kg AC-10
(3) 110 mg/kg AC-10 (4) 5mg/kg NS-398
200x
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
L abeli ng in dex %
0 20 40 60 80 100
* *
圖二十三. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤PAI-1之變化。(A)組織免疫化學染色分 析腫瘤細胞PAI-1蛋白的表現(棕色為陽性反應) (B)為組織免疫化學染色 之量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P < 0.05 與控制組比較。
(A)
200x (1) Control
(4) 5mg/kg NS-398 (2) 55 mg/kg AC-10
(3) 110 mg/kg AC-10
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
Labeling index %
0 20 40 60 80 100 120
*
*
圖二十四. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤Bcl-2之變化。(A)組織免疫化學染色分 析腫瘤細胞Bcl-2蛋白的表現(棕色為陽性反應) (B)為組織免疫化學染色 之量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P < 0.05 與控制組比較。
(A)
200x (1) Control
(4) 5mg/kg NS-398 (2) 55 mg/kg AC-10
(3) 110 mg/kg AC-10
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
Labeling ind ex %
0 20 40 60 80 100 120
*
*
圖二十五. AC-10對裸鼠乳癌腫瘤COX-2之變化。(A)組織免疫化學染色 分析腫瘤細胞COX-2蛋白的表現(棕色為陽性反應) (B)為組織免疫化學 染色之量化圖。結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P <
0.05與控制組比較。
(A)
400x
(1) Control (2) 55 mg/kg AC-10
(3) 110 mg/kg AC-10 (4) 5mg/kg NS-398
(B)
Co ntro l
55 mg /kg AC -10
110 mg /kg AC -10
5 m g/k g N S-3 98
Ap opto tic ind ex %
0 20 40 60 80 100
*
*
圖二十六. TUNEL assay觀察AC-10誘導乳癌腫瘤細胞凋亡現象。(A)乳癌 腫瘤組織切片染色(棕色為陽性反應)(B)乳癌腫瘤組織染色量化圖。結果 以平均值±標準差(mean±SD)表示，n=4；*代表P < 0.05與控制組比較。
第四章 討 論
乳癌是已開發和開發中國家常見的癌症之ㄧ，也是威脅我國婦女健 康及生命的重大疾病。因此，發展天然物來預防或治療癌症是近年來致 力發展的工作。本實驗室在 2007 年已證實樟芝發酵液(AC-10)具抗乳癌 作用，會誘導乳癌細胞之細胞凋亡(159) 。在本論文將以細胞實驗(in vitro) 和動物實驗(in vivo)兩方面來探討 AC-10 調控乳癌細胞株(MDA-MB-231) 細胞週期與轉移之機制。
細胞為了維持整個細胞週期的正常運轉，細胞內會利用許多不同的 蛋白，形成許多不同的複合體，來掌控細胞週期的正常運行。經由一系 列特殊的Cyclin-CDK(Cyclin-CDK complex)的活化與否來調控細胞週期 進行，細胞的增生。由於癌細胞的細胞週期檢查點(checkpoint)功能缺失 相較於正常細胞完整的細胞週期檢查點(checkpoint)在化學藥物上有較 高的敏感性。因此調控細胞週期相關因子的表現與活性是預防癌症策略 之ㄧ。在經AC-10處理過的MDA-MB-231細胞發現，AC-10可藉由抑制 cyclin D1、cyclin E、cyclin A、CDK4和PCNA蛋白表現使其無法形成 Cyclin-CDK complex而阻斷細胞週期的運行。再者AC-10也會誘導p21和 p27表現增加以抑制Cyclin-CDK complex活化，再藉由流式細胞儀分析得 知AC-10會誘導MDA-MB-231細胞週期停滯在G0/G1期(G0/G1 phase arrest)。近年的研究文獻證實MAPK pathway可誘導細胞凋亡，同時也參 與了細胞週期演進的調控作用。在genistein和decitabine所誘導的細胞週 期G2/M期停滯(G2/M phase arrest)，MAPK pathway亦被證實扮演著關鍵
角色(155,156)。MDA-MB-231細胞經由AC-10處理後發現ERK、p38和JNK
蛋白表現量無顯著變化，但是磷酸化活化型ERK、p38和JNK蛋白表現卻
顯著提高，且在4小時達到活化高峰(圖十二)。利用ERK抑制劑U0126、
p38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125阻斷MAPK family protein活 化 與 表 現 ， 時 發 現 在AC-10 與 JNK 抑 制 劑 SP600125 共 同 培 養 的 MDA-MB-231細胞cyclin D1蛋白表現有回復的現象(圖十三, C)。因此推 測AC-10可能透過活化JNK pathway調控cyclin D1蛋白表現。綜觀上述推 論，AC-10可能經由抑制細胞週期調控蛋白Cyclin和CDK家族表現，以 及提高CDKI家族中p21與p27表現，進而影響細胞週期的演進。ㄧ般認 為p38和JNK pathway活化會引起細胞凋亡，而ERK則會促進細胞的存 活。但因細胞種類、細胞所處之環境以及細胞刺激物的不同，MAPK pathway活化所產生之生理反應也有所差異。但對於MDA-MB-231細胞 經AC-10處理後ERK與p38 pathway的活化所影響之生理反應仍需進一 步實驗探討以釐清其所扮演之角色。
由於腫瘤細胞的生長必須仰賴周圍組織的血管提供充足的養分才 能繼續生長或藉由血管進行移行和轉移到身體其他部位。而與腫瘤細胞 移行和轉移關係密切的基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)受到體內許多蛋白 的調控，這些因子包括活化因子urokinase-type plasminogen activator (uPA)、tissue-type plasminogen activator (tPA)、plasmin和促進血管新生 的vascular endothelial growth factor (VEGF)與抑制MMP-9活化因子 tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)、plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)。在身體正常的情況下這些調控因子會維持平衡，當有腫瘤生 成時調控因子會因腫瘤生長或轉移需要破壞此系統之平衡。有研究指出 抑制MMPs的活性主要有兩種：(1)增加TIMPs的表現與pro-MMPs形成複 合物來抑制MMPs的活性(2)直接抑制MMPs的活性(157)。而PAI-1也會透
過抑制uPA活性進而抑制下游分子MMPs活性(118)。本實驗發現，AC-10 可抑制MDA-MB-231細胞之MMP-9蛋白表現與活性(圖十四)。如圖十五
過抑制uPA活性進而抑制下游分子MMPs活性(118)。本實驗發現，AC-10 可抑制MDA-MB-231細胞之MMP-9蛋白表現與活性(圖十四)。如圖十五