細胞凋亡

細胞凋亡(apoptosis)一詞最早是在1972 年由病理學家John Kerr 所 提出⁽⁵⁷⁾，原本字面之意思是指樹葉凋落或掉落。細胞凋亡又被稱為生理 上 的 細 胞 死 亡(physiological cell death) 或 是 計 畫 性 的 細 胞 死 亡 (programmed cell death)，在生理上扮演著相當重要的角色^(58-60)。例如在 胚胎發育、免疫系統功能、和組織恆定所需之重要生理過程。除此之外，

當正常的細胞受到傷害而發生基因突變時，也會啟動細胞凋亡之機制使 突變的細胞死亡，避免突變的遺傳⁽⁶¹⁾。而在病理學上，也有一些疾病與 細胞凋亡有關，例如阿茲海默症⁽⁶²⁾、自體免疫疾病和癌症⁽⁶³⁾。

二、細胞凋亡與細胞壞死

細胞凋亡主要是發生在單一細胞中。它可分為兩個時期，早期(early stage)以及晚期(later stage)。細胞凋亡早期時，會出現染色質濃縮 (compaction of nuclear chromatin)、細胞質濃縮(condensation of cytoplasm) 以及細胞皺縮(shrunken)等特徵；到了晚期，細胞核會開始發生裂解，然

後形成凋亡小體(apoptotic bodies)⁽⁶⁴⁾。在細胞凋亡過程中，並不會發生胞 器或是胞膜破裂，因此不會引起發炎反應或危害到周圍組織。細胞壞死 會同時發生在一群細胞，也可分為早期與晚期兩個時期。在細胞壞死早 期，細胞內之胞器會脹大，細胞膜也會破裂；到了晚期細胞膜也發生破

裂^(65-67)。由於細胞發生破裂，因此會釋放出發炎物質而引起局部發炎反

應，傷害到鄰近的細胞或組織(圖二)。

圖二、細胞凋亡與細胞壞死的區別 Andrew et al., 1998

三、細胞凋亡之訊息調控路徑(圖三)

1. 粒線體路徑(The intrinsic or mitochondrial pathway)

在細胞凋亡進行時，粒線體接受了凋亡訊息的刺激，會活化Bcl-2

家族蛋白，造成粒線體內外膜不穩定，便會釋出凋亡因子(apoptigenic factors)如：cytochrome c來誘發細胞凋亡的發生⁽⁶⁸⁾。在cytochrome c釋出 後，會與細胞質中的apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1)、

procaspase-9結合，形成apoptosome，使得caspase-9活化。而caspase-9與 caspase-8 能 共 同 活 化 caspase-3 、 caspase-6 、 caspase-7^(69-70) ， 使 得 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)裂解，使細胞走向apoptosis⁽⁷¹⁾。在粒 線 體 上 亦 有 另 一 個 凋 亡 因 子 ， Smac/DIABLO (second mitochrodria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI)會與cytochrome c一起從粒線體釋放出來，當cytochrome c與 Apaf-1結合的時候，Smac/DIABLO會與inhibitors of apoptosis proteins (IAPs)結合，抑制IAPs 與caspase-9結合，因此caspase-9活化便不受抑制

(72)。有學者指出在caspase-9活化的過程中，除了cytochrome c和Apaf-1 使caspase-9活化外，Smac/DIABLO也需要同時與IAPs 結合，如此才可 使caspase-9持續保持在活化的狀態^(73-75)。

2. 內質網路徑(The intrinsic or endoplasmic reticulum pathway) Nakagawa 等生理學家於西元2000年提出了第三條細胞凋亡路徑，

內質網路徑(endoplasmic reticulum pathway)，發現caspase-12專一性地存 在 於 內 質 網 中 ， 且 觀 察 到caspase-12 有 和 grp78 、 presenilin-2 和 APP (β-amyloid precursor protein)一同存在於內質網的情形⁽⁷⁶⁾。當內質網受到 外在壓力刺激後，可觀察到Ca²⁺釋出、caspase-12 活化和細胞發生細胞 凋亡的現象。有文獻也指出，由內質網誘發的細胞凋亡也可受到Bcl-2 家 族的調控，因為在內質網上亦可發現Bcl-2蛋白的存在⁽⁷⁷⁾。

3. 死亡受器路徑(The extrinsic or death receptor pathway)

在death receptor方面，當death receptor接受到刺激後，會聚集在一 起 ， 形 成 death-inducing signaling complex (DISC) ， DISC 會 吸 引 Fas-associated death domain (FADD) protein這個adaptor molecule的結合

(78)，然後用death-effector domain(DED)與一個或是多個procaspase-8蛋白 相接，當多個procaspase-8接連在一起後，便互相切割對方，使彼此活化，

接著活化態的caspase-8便會繼續活化下游的apoptotic caspase⁽⁷⁹⁾使得細 胞凋亡發生。另外，目前也發現death receptor路徑會經由活化Bcl-2家族 蛋白中的Bid，來達到與粒線體路徑產生互動。當caspase-8活化之後，會 切割Bid使其轉換成truncated Bid(tBid)，接著tBid會由細胞質移動到粒線 體上，可能經由與Bax或Bak作用⁽⁸⁰⁾，進一步促進cytochrome c的釋放

(69-70)，而其中第一與第二條路徑最後都會使得effector caspase活化。

圖三、細胞凋亡之訊息調控路徑 Gupta et al.,2006

四、調控細胞凋亡之相關分子

從上述的各種細胞凋亡之訊息傳遞路徑中，可得知細胞凋亡是經由 許多蛋白質來調控的，而這些蛋白質主要分述如下：

1. Bcl-2 家族

在粒線體路徑中，Bcl-2家族扮演著重要的角色。在人類中，目前已 有20個Bcl-2之家族成員被定義，依其結構特徵可分為三群^(81-82)。

(1) Group I (例如：Bcl-2, Bcl-XL等)在結構上具有4個Bcl-2 homology domains (BH1-BH4)，功能上具有anti-apoptotic activity之特徵，平常 會與C端的hydrophobic tail嵌插於粒線體外膜上，保護粒線體膜的穩 定。

(2) Group II (例如：Bax, Bak等) 在結構上大致與Group I相似，結構上缺 少BH4 domain，功能上具有pro-apoptotic activity之特徵。有文獻指出 pro-apoptotic activity 蛋 白 常 會 和 anti-apoptotic activity 蛋 白 形 成 heterodimer的形式，而影響anti-apoptotic activity蛋白的作用，破壞粒 線體膜之穩定性，造成粒線體內之物質釋出。

(3) Group III (例如：Bid, Bad等)在結構上最大的特徵是只具有BH3 domain⁽⁸³⁾。

Bcl-2 家族可能的作用機制：

a.形成pore 讓粒線體內的物質釋出。

b.pro-apoptotic 與anti-apoptotic activity蛋白形成heterodimer來調控細胞 凋亡的發生。

c.直接藉由與adaptor和procaspases結合來調控caspases的活化。

d.與粒線體膜上之蛋白例如，voltage-dependent anion channel (VDAC)和

adenosine nucleotidetransporter (ANT) 結 合 形 成 PTP (permeability transition pore)，造成粒線體膜電位快速降低。

e.形成功能較差的選擇性ion channel ⁽⁸³⁾。 2. Caspases 家族

在整個細胞凋亡發生的過程中，會有一群對天門冬胺酸(Asp)具有特 異性的蛋白酵素活化，並且對下游的蛋白產生水解作用，造成細胞凋亡 的發生， 這一群蛋白酵素稱做caspases^(84-85)。Caspases在細胞凋亡的路 徑中，扮演著極為重要的角色。這類蛋白酵素的活化與否，會直接或間 接左右細胞凋亡的進行⁽⁸⁶⁾。Caspases為一胱胺酸蛋白酵素家族(cysteine proteases)，在細胞凋亡發生的過程中，扮演著很重要的角色。目前知道 caspase家族共有14 個成員，可以大略區分為兩個次家族：ICE subfamily (inflammation group)和CED-3subfamily (apoptosis group)^(84,87)。平時此酵 素是以proenzyme(zymogen)的型式存在於細胞內。當經過蛋白質水解的 切割作用後，就會變成有活性的次單位(subunit)，繼而形成完全活化的 四合體(tetramer)⁽⁸⁸⁾。此酵素會辨認特殊的胺基酸序列(DEVD)，然後在 天門冬胺酸(Asp)後將特定蛋白切割水解⁽⁸⁹⁾。Caspase可由活化路徑區分 為：

a. 起 始 者 (apoptotic initiators) caspase-2 ， caspase-8 ， caspase-9 ， caspase-10

b. 執行者(effector caspases) caspase-3，caspase -6，caspase-7。

起始者的主要功能在於傳遞細胞凋亡的訊號，而執行者主要是對細 胞內的一些蛋白產生水解作用。當細胞接受到細胞凋亡的訊號刺激後，

會先使起始者活化，然後由起始者對執行者產生蛋白水解的作用而使執 行者活化，接著便由執行者來執行下游蛋白的水解作用^(77,85)，引發細胞

凋亡的發生。目前大略知道約有一百多種蛋白是Caspases的受質⁽⁹⁰⁾，這 些蛋白都會受到Caspases 的水解作用而分解或是活化，包含了核膜 lamin、細胞骨架蛋白fodrin和gelsolin、PAK2(p21-activated kinase 2) 、 CAD (caspase-activated DNase)^(91-94)等。

第三節 絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)途徑與細胞凋亡

活化絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)，是一種serine/threonine kinases的激酶家族，主要參與細胞外各種刺激物的訊息傳遞反應與細胞 凋亡的信號轉導過程。MAPKs 級聯反應包括3 個順序的活化過程：

MAPK kinase kinase(MAPKKK) 、 MAPK kinase (MAPKK) 及 MAP kinase 。 每 一 種 激 酶 又 由 不 同 成 分 組 成 。 MAPKKK 由 C—RAF ， B—RAF，MEKK等組成，MAPKK 由MEK，SEK，MKK3，MKK6等 組 成 ， MAPK 包 括 ERK 1/2(extracellar signal-regluatedkinase) ， JNK/SAPK(c-Jun NH2-terminal kinase)以及p38。MAPK家族有多個成員 及多條反應途徑，利用一連串的蛋白質磷酸化反應來進行訊息的傳導。

依照細胞種類、cellular stmuli、細胞的環境等因素之不同會使各種 MAPK在細胞的生理功能上產生不同影響(圖四)。茲分述如下:

(1) ERK (extracellular responsive kinase) pathway

最早被發現的分子成員為 MAP-2 kinase (microtubule-associated proteins)，在受到胰島素的刺激便會大量活化的蛋白質激酶，進而造成 細 胞 骨 架 蛋 白 質 MAP- 的 磷 酸 化⁽⁹⁵⁾。 而 在 之 後 的 研 究 也 發 現 MAP-2kinase 之異構酶 ERK1⁽⁹⁶⁾。有鑑於很多的生長因子以及分裂原 (mitogen) 都 可 以 活 化 這 些 酵 素 ， 因 此 將 這 些 酵 素 群 統 稱 為

mitogen-activated protein (MAP) kinase。其中在細胞分化的過程中，因為 ERK1/2 可以廣泛的表現而能調控整個減數分裂以及有絲分裂的進行。

許多物質，包含生長因子、細胞激素，甚至是致癌物質皆可以活化 ERK1/2 之途徑。當 ERK1/2 的途徑被啟動時，能促進細胞的增殖，抑制 細胞的凋亡⁽⁹⁷⁾。然而，也有許多文獻提出相反的理論，學者們認為 ERK1/2 在多種類的化療藥劑或預防藥物所導致的細胞凋亡機轉中扮演 著不可或缺的角色，像是 taxol、resveratrol 以及 quercetin 等^(98-100)。這 些研究結果，可能與細胞之種類、細胞中誘導細胞凋亡的 inducer 與隨 後之訊息傳遞路徑相關。

(2) c-Jun NH2-terminal kinase/stress-activated protein kinase (JNK/SAPK) pathway

當細胞受到外界的壓力或是一些cytokine的刺激時，便會活化JNK。

JNK主要有3種isoform：JNK1、JNK2及JNK3，前兩者表現在大部分的 組織，而JNK3主要表現在腦部及睪丸⁽¹⁰¹⁾。JNKs目前已被證實可透過幾 個機制誘發細胞凋亡。活化之JNKs可將tumor suppressor gene p53磷酸 化，因此抑制p53與Mdm2的結合而延緩p53之代謝並延長p53啟動細胞凋 亡或細胞週期停滯之活性^(102,103)。活化的JNKs也會將Bcl-2和Bcl-X_L磷酸 化，因此降低Bcl-2和Bcl-X_L與Bax的結合能力進而抑制這些蛋白質的抗 凋亡效應(antiapoptotic effect)。再者，透過對c-Jun/AP-1 transcription的活 化作用，JNKs可藉由轉錄隻活化作用增加Fas ligand的表現而啟動細胞

凋亡^(103,104)。相對於促凋亡效應(proapoptotic effect)，JNKs亦被證實具

oncogenic activity。JNKs藉由磷酸化作用可活化及延長c-Jun和ATF-2 transcription factor之半衰期，進而活化與延長Ras和Src等相關之cell

transformation機制⁽¹⁰²⁾。活化的JNKs亦可將Bad磷酸化，因而抑制Bad的 促凋亡效應(proapoptotic effect)⁽¹⁰⁵⁾。

(3) P38 MAPK pathway

目前發現至少存在有四種異構酶: α、β、γ 及 δ ⁽¹⁰⁶⁾。有許多下游的 蛋白質會受到 p38 MAPK的作用，包含 MSK1/2⁽¹⁰⁷⁾以及P90^MAPKAPK2

(108)。MSK1/2可以活化CREB等轉錄因子⁽¹⁰⁹⁾。p38s也被證實在細胞凋亡

與存活上扮演雙重角色。在乳癌細胞受v-Src所活化的p38會藉由調控 cyclin D的作用而增加細胞增生⁽¹¹⁰⁾；p38s也會透過活化NF-κB(Nuclear factor-kappa B)使腫瘤細胞產生抗藥性⁽¹¹¹⁾，數種cellular stress如anticancer agent、UV raddiation、oxidative stresses、growth factor和ceramides等皆 透過p38s而抑制細胞週期的進行或啟動細胞凋亡⁽¹¹²⁾。p38s對細胞週期之 調控乃透過p21的作用使細胞週期停滯在G1 phase⁽¹¹³⁾，p38s亦可經由磷 酸化作用抑制Bcl-XL、growth factors receptor之功能，增加p53與Fas lignad 的作用促使細胞進行細胞凋亡^(114,115)。

圖四、MAPKs 之訊息傳遞路徑圖 http://www.cellsignal.com/

第四節 環氧化酵素-2(COX-2)與乳癌之相關性

環氧化酵素（cyclooxygenase；COX首先在1976年被純化，繼而在 1988年被clone。主要將花生油酸進一步合成為前列腺素(prostaglandin；

PGs)，是前列腺素合成過程所必備的酵素之一。目前有兩種isoform 的 發現 : COX-1和COX-2。兩者的結構極為相似，兩者最大的不同在於兩 者在組織中表現和調節方式的不同。COX-1普遍存在於各類細胞中，屬 於一種 Housekeeping gene會持續在細胞中表現，主要是用來維持身體 中的恆定作用，如Thromboxane的合成、胃壁完整性和維持正常腎血流；

COX-2屬於誘導型基因，需要生長因子、細胞激素和腫瘤促進因子的誘 導之下才會進一步的表現^(108-111)。能夠調控COX-2的細胞外刺激物如：