動物行為試驗

(二) 萃取物製備條件

試驗菌株於 37℃ 下培養活化兩代後將其接種於豆奶中，接種量為 1% (v/v)，

於 37℃ 下分別靜置培養 12、24、36 與 48 小時後進行試驗。

1. 乙醇萃取物

發酵豆奶冷凍乾燥後取其凍乾粉末 25 g 溶於 95% 乙醇 100 mL 後在 37

℃ 水浴 30 分鐘，取其酒精層並以 Whatman No. 42 濾紙過濾，以減壓濃縮機 進行濃縮，濃縮後之萃取物後以 DMSO 回溶。其中含有 6.26 μg/mg 的 genistein 與 6.78 μg/mg 的 daidzein。

2. 水萃取物

發酵豆奶凍乾後取其凍乾粉末 10 g 溶於蒸餾水 25 mL 後在 37℃ 水浴 30 分鐘。再以 10,000 x g 離心 20 分鐘，取清液經冷凍乾燥，以蒸餾水回溶即為水 萃取物。當中含有 0.127 μg/mg 的 daidzein。

二、動物行為試驗

(一) 實驗動物飼養與分組

本研究中所採用之動物為購自樂斯科生物科技股份有限公司之 SD 品系雄

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性大鼠，第一部分比較乳酸菌發酵豆奶與未發酵豆奶分試驗分組為週齡 8 週、

6 組，每組 8 隻，共 48 隻。第二部分功效成分的比較試驗分為 8 組，每組 8 隻，共 64 隻。飼養於控制相對溼度 60%，室溫 26 ± 1℃，光照時間為 8:00~20:00 之 12 小時光照循環，食物與水供給不予限制之環境下。大鼠預養至體重達到 300 g 時進行實驗分組與腦部輸注幫浦植入手術。

第一部分的乳酸菌發酵豆奶未發酵豆奶比較組試驗中分為八組每組 8 隻，

分為假手術組 Vehicle, Vh 組，注射空白試劑以一般飼料餵食，連續 28 天腦部 輸注 Aβ40 的 Amyloid β-peptide, Aβ 組以一般飼料餵食，在飲水中餵食未發酵 豆奶之乙醇萃取物組 Ethanol extracts of Soy milk, SmE 組，在飲水中餵食益生菌 發酵豆奶之乙醇萃取物組 Ethanol extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmE 組，在飲水中加入純物質 Genistin 和 Daidzin 組 (Gs+Dz 組)，在飲水中加入純 物質 Genistein 和 Daidzein (Gse+Dze 組)。第二部分功效成分比較組每組 8 隻，

分為假手術組 Vehicle, Vh 組，注射空白試劑以一般飼料餵食，連續 28 天腦部 輸注 Aβ40 的 Amyloid β-peptide, Aβ 組以一般飼料餵食，餵食乳酸菌發酵豆奶 組 NTU 101 fermented-Soy milk, L-Sm 組，餵食乳酸菌發酵豆奶之乙醇萃取物組 (Ethanol extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmE 組)，餵食乳酸菌發酵豆 奶之水萃取物組 (Water extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmW 組)，在 飲水中加入純物質 Genistin (Gse 組)，在飲水中加入純物質 Daidzein (Dze 組)，

以及飲水中加入純物質 Equol (E 組)。

(二) 餵食劑量之計算 1. 餵食劑量換算

本研究使用雄性 SD 大鼠購自樂斯科生物科技股份有限公司 (Ilan, Taiwan)，

週齡 8 週，每組 8 隻，飼養於控制相對溼度 60%，室溫 26 ± 1℃，光照時間 為 8:00~20:00 之 12 小時光照循環，食物與水供給不予限制之環境下。大鼠預 養至體重達到 300 g 時進行實驗，試驗物質餵食的劑量依照表一、二所示，餵

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表一、L-SmE 與 SmE 改善 Aβ40 腦部輸注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試 驗之動物分組

Table 1. Animal grouping for the study on the effect of L-SmE and SmE on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ-infused rat

Group Sample Aβ-40

infusion Dose(mg/rat/day)

Vh - -

-Aβ - +

-L-SmE Ethanol extracts of NTU101 fermented-Soy

milk + 116.4

SmE Ethanol extracts of Soy milk + 116.4

Gs+Dz Genistin+Daidzin + 0.729+0.789

Gse+Dze Genistein+Daidzein + 0.729+0.789

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表二、Gse、Dze 與 E 改善 Aβ40 腦部輸注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試 驗之動物分組

Table 2. Animal grouping for the study on the effect of Gse, Dze and E on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ-infused rat

Group Sample Aβ40

infusion Dose(mg/rat/day)

Vh - -

-Aβ - +

-L-Sm NTU101 fermented-Soy milk + 1200

L-SmE Ethanol extracts of NTU101 fermented-Soy milk + 116.4

L-SmW Water extracts of NTU101 fermented-Soy milk + 147.6

Gse Genistein + 0.729

Dze Daidzein + 0.789

E Equol + 0.789

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食 劑 量 換 算 參 照 美 國 FDA 所 提 供 之 公 式 計 算

(http://www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)，以 60 kg 成人為基準人體每日 每公斤體重之建議攝取量的 6.25 倍為每公斤大鼠之試驗劑量。

2. 阿茲海默症模式大鼠之誘導

誘導記憶學習能力損傷之設備由 Mini-Osmotic Pump (Model 2004, Alzet^® Corporation, Palo Alto, CA, USA.)，輸注速率 0.25 μL/hr，內容量 234 μL，軟管 (長約 70 mm，內容量約 80 μL)、brain Infusion Kit II，3-5 mm，Alzet^© 所構成，

如圖 3-1。

(三) 阿茲海默症模式大鼠建立之手術操作

Aβ peptide 由於其片段短小，所以於使用前須至於 PBS 緩衝溶液之中經過 7 天聚合反應配製成 Aβ 溶液，將配置完成之溶液和未加入 Aβ 之空白溶液 (做 為 vehicle 組) 注入 Alzet osmotic mini-pump，接上 brain infusion kit II 並使溶液 充滿整個輸注管與輸注頭。將大鼠去除頭部毛髮並置於動物立體定位儀上以 chloral hydrate (450 mg/kg) 口鼻吸入進行麻醉後，根據 Paxinos 與 Watson 之大 鼠腦部立體解剖圖進行左側腦室定位，以頭蓋骨上之 bregma 為中心，於縱軸 0.8 mm，橫軸 1.4 mm 位置進行海馬迴之定位並進行鑽孔 (Paxinos and Watson, 2005) 。待定位後，將 Alzet osmotic mini-pump 置於頸後皮下區，brain infusion kit II 置入，輸注頭深入頭蓋骨之深度為 4.0 mm。完成後並以生物黏合膠固定接 著墊片與接頭於頭蓋骨上。最後以縫合夾縫合，並歸回飼養籠中照顧。而手術日 程如圖 3-2 所示。

(四) 記憶學習能力試驗

手術完後第 27 天進行工作記憶試驗，休息平臺放置於不同象限 (第四象 限)，試驗 5 次 (第 1 次試驗室為認知訓練故不納入數據計算)，大鼠頭向外依 序隨機分別進入 5 個進入點，每次 90 sec；若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，

讓大鼠休息 15 sec 後，抓出泳池休息 60 sec，然後進行下一次之測試。若大鼠

41 圖 3-1、ALZET 腦部輸注幫浦

Fig. 3-1. Mini-osmotic pump and brain infusion kit

42

圖 3-2、試驗物質改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試驗日程表

Fig. 3-2. The experiment schedule of learning and memory task of test substance for Alzheimer’s disease rats.

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於 90 sec 尚未找到休息平臺，則將大鼠抓到休息平臺，休息 15 sec 後，移出泳 池休息 60 sec，再進行下一次之訓練，試驗結束後將試驗結果進行平均並統計組 間之差異。

1. 試驗裝置

圖 3-3 水迷宮裝置為圓形泳池之直徑為 180 cm，高度 60 cm，泳池中含有 一可移動的休息平臺 (escape platform)。平臺之直徑為 10 cm，高度為 30 cm。

實驗進行前泳池須加水至 32 cm 之液面高度 (液面標準為高於平台 2 公分)。

泳池區分為四個象限 ( I、II、III 與 IV 區)，並設置 4 個起始點，休息平臺放 置於任一象限之中心點。試驗期間並於泳池中心點之正上方架設攝影機以記錄實 驗動物之游泳路徑 (Tabuchi et al., 2009)。

2. 參考記憶試驗 (Reference memory task)

定位手術後第 24 至 26 天進行參考記憶試驗，休息平臺固定置於第三象限 上，大鼠頭向外依序隨機分別進入四個進入點，每天訓練 4 次，每次 90 sec；

若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，讓大鼠休息 30 sec 後回籠子休息 30 sec，

然後進行下一次之測試。

3. 空間性探測試驗 (Probe test)

第 26 天之參考記憶試驗後立即進行，將休息平臺移出泳池，將大鼠依序 隨機分別進入四個進入點，游泳 90 sec，同時以正上方之攝影機紀錄大鼠停留於 原參考記憶試驗中休息平臺放置之象限 (第三象限) 中之時間與全程游泳之路 徑。

4. 工作記憶試驗 (Working memory task)

手術完第 27 天進行工作記憶試驗，休息平臺放置於不同象限 (第四象限)，

試驗 5 次 (第 1 次試驗室為認知訓練故不納入數據計算)，大鼠頭向外依序隨 機分別進入 5 個進入點，每次 90 sec；若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，

44 圖 3-3、水迷宮裝置與分區域示意圖 Fig. 3-3. Instrument of water maze task

10 cm

60cm

180 cm 30 cm

2 cm

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讓大鼠休息 15 sec 後，抓出泳池休息 60 sec，然後進行下一次之測試。若大鼠 於 90 sec 尚未找到休息平臺，則將大鼠抓到休息平臺，休息 15 sec 後，移出泳 池休息 60 sec，再進行下一次之訓練，試驗結束後將試驗結果進行平均並統計組 間之差異。

三、生理生化分析