NTU 101 乳酸菌發酵豆奶中預防阿茲海默症主要功效成分之探

第四章、結果

第二節、 NTU 101 乳酸菌發酵豆奶中預防阿茲海默症主要功效成分之探

(一) 參考記憶試驗

本研究方法與圖 4-1 之試驗方法相同，但目的於比較乳酸菌發酵豆奶中過去研究所提及具有功效之成分，何者為預防阿茲海默症主要功效成分。

如圖 4-22 顯示在 trial 1 (第一天第一次游泳)，無論任何組別均無法在限定時間 90 秒內找到位於第三象限之平台故為 90 秒，而經過第一天之學習記憶後，於 trial 4 中可以發現，L-SmE 組、L-SmW 組比起 Aβ 組有更少的搜尋時間，而 E 組有近似於 Vh 組的搜尋時間。在 trial 7-8 中 L-SmE 組、L-SmW 組都低於 Aβ 組，而 L-Sm 組雖然效果沒有 L-SmE 組、L-SmW 組好，但仍低於 Aβ 組，trial 9 試驗游泳中的 Gse 組、Dze 組、E 組都有低於Aβ 組，指出都有改善的效果，顯示餵食試驗物質的大鼠組別中除了餵食 NTU 101 發酵豆奶粉末的組別 (L-Sm 組) 外，都有改善長期記憶的效果，而 E 組呈現之最短平台搜尋時間。在參考記憶試驗試驗中，去醣基異黃酮中最有效的為 equol 餵食組，其次為 genistein，再者為 daidzein，呈現低於 Aβ 組的搜尋時間。

(二) 空間探測試驗

如圖 4-23 顯示，在 Probe test中 Aβ 組與假手術 Vh 組有極顯著上升 (p<0.001)，Gse 組呈現最佳改善效果，其次為 L-SmE 組，兩者都有達到和 Vh 組相同的效果，甚至有更久的滯留時間。L-SmW 組也呈現出與 Aβ 組有顯著增 加空間探測時間之差異 (p<0.001)，可知餵食發酵豆奶水萃取物可改善 AD 大鼠 空間探測能力，L-Sm 組、Dze 組、E 組效果雖沒 L-SmE 組、L-SmW 組和 Gse 組的效果好，但和 Aβ 組都有明顯的改善效果 (p<0.01)。

(三) 工作記憶試驗

於短期記憶的試驗中，圖 4-24 的結果顯示 Aβ 組顯著高於 Vh 組 (p<0.05)，而在 Gse 組、E 組出現最佳的改善效果，能近似於 Vh 組的搜尋時

圖 4-22、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠於參考記憶試驗中找尋平台時間記憶學習能力

Fig. 4-22. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on memory and learning ability of the Aβ40-infused rats in reference memory task.

trial

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Escape Latency (sec)

0 20 40 60 80 100

Vh A L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

圖 4-23、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠於 probe test 試驗中於目標象限之游泳時間記憶學習能力之影響

Fig. 4-23. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on memory and learning ability the Aβ40-infused rats in probe test. Data are presented as mean ± SD (n=8). *,

**, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, ^#,^##,^### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

Time spemt in target quadrant (sec)

0 10 20 30 40 50 60

*** *** ***

***

###

## ##

圖 4-24、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠於工作記憶試驗中記憶學習能力之影響

Fig. 4-24. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on memory and learning ability the Aβ40-infused rats in working memory test. Data are presented as mean ± SD (n=8). *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, ^#,^##,^### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

Escape Latency (sec)

0 10 20 30 40 50 60 70

* *

間，對於 Aβ 組都有顯著的改善效果 (p<0.05)。L-SmE 組、L-SmW 組以及 Dze 組降低的趨勢，但沒有顯著改善的效果 (p>0.05)，在 L-Sm 組沒有明顯的改善效 果 (p>0.05)，這三組顯示的數據，發酵豆奶較無法改善輸注 Aβ40 所帶來的工作 記憶試驗時間增加 (p>0.05)。

二、脂質過氧化物 TBARS 含量之影響

圖 4-25 結果顯示，Aβ 組的 TBARS 含量顯著高於 Vh 組，而在餵食試驗 物質後，無論在皮質或是海馬迴都有顯著降低 TBARS 之效果 (p<0.05)，其中又 以 Gse 組具有最佳改善效果 (p<0.05)，L-SmE 和 L-SmW 組對於 Aβ 組也可 以看出具有顯著改善效果， Dze 和 E 組在皮質或是海馬迴都有顯著降低 TBARS 之效果 (p<0.05)。Genistein 具最佳降低 TBARS 含量的作用，其次結果 為 daidzein，再者為 equol。

三、前發炎因子 NF-κB、TNF-α、IL-1β 與 IL-6 蛋白表現之影響

過去研究 genistein 和 daidzein 與其二次代謝物 equol 能透過抑制 NF-κB 的形成，減輕發炎反應 (Valles et al., 2008; Zhao et al., 2014)，genistein 也能透過直接減少 astrocytes 的細胞數量，達到減少發炎因子的目的 (Bagheri et al., 2013)。

結果圖 4-28、4-29 顯示在大腦皮質與海馬迴組織中 Aβ 組均極顯著的高於 Vh 組 (p<0.001)，而發酵豆奶粉末 L-Sm 與其萃取物組 (L-SmE、L-SmW) 的部分，

比起 Aβ 組居有極顯著改善效果 (p<0.001)，而在大腦皮質組織的部分 L-SmE 組的降低 NF-κB 蛋白含量的能力優於 L-Sm 組與 L-SmW 組 (p<0.05)，雖然 在海馬迴中三組並沒有比較出顯著差異 (p>0.05)，但是 L-SmE 組也是表現出較 好的改善趨勢。在純物質組中 Gse 組、Dze 組與 E 組與 Aβ 組呈現出極顯著 的改善效果 (p<0.001)，但 Gse 組與 E 組效果最佳。

TNF-α 與腫瘤壞死因子接受器 (TNF receptor) 結合後會誘導腫瘤壞死因子接受器活化 (Richman et al., 2013)，刺激 1κB kinase 釋放 p50 與 p65 並聚合成

80 p<0.001, respectively) as compared with Aβ, ^#,^##,^### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

圖 4-26、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織 中阿茲海默症前發炎因子 Western blotting 圖

Fig. 4-26. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the inflammatory factor in the cortex of Aβ40 infusion rats.

β- actin NF-κB

IL-1β IL-6 TNF-α

Aβ L-SmE Gse

Vh L-Sm L-SmW Dze E

42 kDa 65 kDa 17 kDa 36 kDa 31 kDa

圖 4-27、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 前發炎因子 Western blotting 圖

Fig. 4-27. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the inflammatory factor in the hippocampus of Aβ40 infusion rats.

β- actin NF-κB

IL-1β IL-6 TNF-α

Aβ L-SmE Gse

Vh L-Sm L-SmW Dze E

42 kDa 65 kDa 17 kDa 36 kDa 31 kDa

圖 4-28、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 NF-κB 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-28. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the NF-κB expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, ^#,^##,^### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

NF-kB expression percentage in cortex (%)

圖 4-29、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 NF-κB 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-29. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the NF-κB expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

NF-kB expression percentage in hippocampus (%)

0 100 200 300 400 500

***

*** ***

***

###

Interleukin-6 (IL-6)，IL-6 屬多功能之細胞激素其功能包括誘導急性期蛋白質之生合成或刺激 T 細胞的活化與刺激 B 細胞產生抗體 (Pabois et al., 2014)。

圖 4-30、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 TNF-α 蛋白質表現量化數據之影響。

Fig. 4-30. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the TNF-α expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

TNF- expression percentage in cortex (%)

圖 4-31、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 TNF-α 蛋白質表現量化數據之影響。

Fig. 4-31. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the TNF-α expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

TNF- expression percentage in hippocampus (%)

0 50 100 150 200 250

***

###

圖 4-32、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 IL-1β 蛋白質表現量化數據之影響。

Fig. 4-32. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the IL-1β expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-1 expression percentage in cortex (%)

圖 4-33、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 IL-1β 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-33. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the IL-1β expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-1 expression percentage in hippocampus (%)

0 50 100 150 200 250 300

***

*** ***

###

***

圖 4-34、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 IL-6 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-34. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the IL-6 expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ,

#,^##,^### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-6 expression percentage in cortex (%)

圖 4-35、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 IL-6 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-35. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the IL-6 expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-6 expression percentage in hippocampus (%)

四、阿茲海默症相關因子 Aβ40 在組織間蛋白沉積量之表現

Aβ40 在單體分子的時候對生物體造成的毒性不高，但是聚合形成 Aβ fibrils 後會導致 NBT 和 senile plaque 的沉積造成神經細胞的死亡並帶來強烈的氧化發炎反應 (Lloret et al., 2015)。本研究以組織免疫染色進一步評估輸注 Aβ40 於各組實驗動物之大腦皮質與海馬迴組織中之沈積情形。經 28 天連續輸注 Aβ40 後結果如圖 4-36 結果中可以看出 Aβ 組的海馬迴中有非常大量的蛋白沉積反應，以及在 L-Sm 組中有細小的、多量的蛋白沉積在海馬迴的周遭，同樣的情況也出現在 L-SmW 組織中，細小蛋白顆粒沉積在海馬迴帶狀組織的附近呈現包覆海馬迴的狀態，L-SmE 組、Gse 組與 E 組則沒有發現此情形甚至也很少反應出蛋白沉積，在 Dze 組中則是在海馬迴的上方有比較明顯的 Aβ40 蛋白沉積，

在海馬迴的周遭則沒有發現。

五、Astrocyte 及 microglia 活化因子 TLR-2 與 RAGE 蛋白表現量

TLR-2 與 RAGE 在接收到發炎因子後，會產生出更多的前發炎因子使其反應加劇，包含 TNF-α、IL-1β 與 IL-6 等等，而 TLR-2 與 RAGE 也有可能與 Aβ 結合，而直接釋出氧化發炎因子，無論是哪種路徑都會使得發炎反應惡化。就實驗所示，如圖 4-39、4-40 大腦皮質組織與海馬迴組織中，Aβ 組所呈現的 RAGE 蛋白質含量極顯著提升的結果 (p<0.001)，發酵豆奶粉末組 L-Sm 組於大腦皮質 組織中具有極顯著的改善效果 (p<0.001)，但是在海馬迴組織中卻沒有此趨勢，

反而有大於 Aβ 組的蛋白含量，而在其萃取物的蛋白表現上就有很好的效果，包 含 L-SmW 組與 L-SmE 組都有極顯著的改善效果 (p<0.001)，三個純物質餵食 組 Gse、Dze 與 E 組都具有極顯著的改善效果 (p<0.001)，而優劣順序分別是 Dze 組再者是 E 組，最後才是 Gse 組。

如圖 4-41、4-42 所示 TLR-2 的蛋白呈現則是，大腦皮質組織與海馬迴組 織中，Aβ 組都有極顯著大於 Vh 組的結果 (p<0.001)，而 L-Sm 組與 RAGE 蛋

圖 4-36、Genistein、daidzein 和 equol 對於腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 Aβ40 蛋白沉積量之影響 (100X) Fig. 4-36. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the Aβ40 accumulation in hippocampus of Aβ40-infused rats.

Vh Aβ L-Sm

L-SmW

L-SmE

Gse Dze E

100 μm

圖 4-37、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織 中抑制 astrocyte 及 microglia 活化因子蛋白 Western blotting 圖

Fig. 4-37. The factor of the astrocyte and microglia ethanol extracts of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol in the crotex of Aβ40 infusion rats.

圖 4-38、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 抑制 astrocyte 及 microglia 活化因子蛋白 Western blotting 圖

Fig. 4-38. The factor of the astrocyte and microglia ethanol extracts of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol in the hippocampus of Aβ40 infusion rats.

β- actin

Aβ L-SmE Gse

Vh L-Sm L-SmW Dze E

TLR-2 RAGE

42 kDa 25 kDa 84 kDa

圖 4-39、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織中 RAGE 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-39. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the RAGE expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-6 expression percentage in hippocampus (%)

圖 4-40、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之海馬迴組織中 RAGE 蛋白質表現量化數據之影響

Fig. 4-40. Effect of genistein (Gse), daidzein (Dze) and equol on the RAGE expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, ***

Vh Aβ L-Sm L-SmE L-SmW Gse Dze E

IL-6 expression percentage in hippocampus (%)

圖 4-41、Genistein、daidzein 和 equol 對腦部輸注 Aβ40 大鼠之大腦皮質組織

在文檔中 Study on the improvement of Alzheimer’s disease by (頁 94-120)

第四章、 結果

第二節、 NTU 101 乳酸菌發酵豆奶中預防阿茲海默症主要功效成分之探

Vh Aβ L-Sm

L-SmW

L-SmE

Gse Dze E

第四章、結果