第三章、 實驗材料與方法
第二節、 實驗方法
三、 生理生化分析
實驗完成後犧牲老鼠，並取出腦部組織，按 Groswisky 方法 (Tabuchi et al., 2009) 分成 cortex、hippocampus 區域。
取出之腦部組織分成左腦、右腦，於左腦輸注點附近進行切片，厚度約 0.1-0.3 cm 以便後續組織免疫染色分析，其餘組織分別加入 25 mM Lysis buffer (pH=7.5) (4℃) 均質。Cortex 分左、右腦，每次加入 300 μL buffer 後，均質離 心 (15,000 x g，30 min，4℃)；取上清液。Hippocampus 加入 300 μL 後，均質、
離心 (15,000 x g，30 min，4℃)，取上清液。保存於 -80℃ 的冷凍櫃中。
(二) 蛋白質含量之測定
以 bicinchoninic acid (BCA) 法蛋白質定量套組進行分析，BCA 法是利用蛋 白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原，所生成的 Cu2+ 可以 BCA 專一性地呈色 而定量，BCA reagent kit (23225, Pierce, Box, PO, USA) 含 Reagent A (BCA) 及 Reagent B (CuSO4)，先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻混合， BSA 標準品 (2 mg/mL) 以 Lysis buffer 稀釋一系列濃度，2000、1000、500、250、125、
62.5 與 31.25 mg/mL。各標準品每濃度與樣品取 10 μL 以三重複加入微量滴定 盤之孔槽內。每槽加 200 μL 上述之混合 BCA reagent，均勻混合後靜置 37℃ 反 應 10 min。以全光譜微量盤分析儀測 595 nm 吸光。作圖畫出標準校正線，並 決定未知樣本的濃度。
(三) 脂質過氧化測定分析法
脂質過氧化分析法是參考 Tarladgis et al. 之方法 (Tarladgis et al., 1964)，以
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(四) 組織免疫染色 (immunohistochemistry stain, IHC stain)
大鼠犧牲後取腦組織並快速浸泡於 10% 的福馬林中，進行石蠟包埋與切片 μL/well 之 Sample。在電泳槽內外注入 Electrophoresis running buffer，通入電流
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80 伏特至跑完 stacking gel，再以 120 伏特跑完 running gel 直到結束。
將已知濃度的樣本定量後，以電泳槽進行十二烷基硫酸鈉電泳法 (sodium dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。此電泳法利用分子 量不同來分離出蛋白質。電泳膠片 (gel) 的孔隙使分子量大的蛋白質位於上方，
分子量較小的蛋白質移動較快速則在下方。Gel 密度較小，蛋白通過孔徑較大，
比起密度大的膠片，分子量大的蛋白質相對移動速度變快。
(六) 蛋白質轉漬-西方墨點法 (western blot)
Polyvinylidene fluoride (PVDF) 轉漬膜先以甲醇浸泡，目的為洗去上層脂質 活化轉漬膜，電泳結束後將已分離之蛋白質膠體取出，以超純水潤洗過膠體和 PVDF 轉漬膜 5 min，以快速轉漬器 (Thermo Scientific Pierce G2 Fast Blotter) 進 行轉漬。截去上層 stacking gel 後，以 1-step transfer buffer (84731, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 潤濕依正極至負極方向依序疊放：7 張濾紙 (8 x 10.5 cm)、
已用甲醇溼潤的 PVDF 轉漬膜、電泳膠片、7 張 濾紙，將其組合完成後將以轉 漬槽上蓋蓋上，以 1.3 安培電流通電轉漬 10 min。
轉漬完成後，取出轉漬膜並於左上方截去一角以作標示，將轉漬膜浸置於 Urea-TBS-T 以 shacking (50 rpm) 的方式清洗 5 min 後，再以 TBS-T 清洗並 shacking 10 min，重覆 3 次後，在 blocking buffer (3% 脫脂牛奶) 中 shacking 1 hr 後， 加入以 blocking buffer (3% 脫脂牛 奶) 稀 釋後 之一次 抗體 shacking overnight (4℃) 或是 37℃ 1.5 hr 後，倒出抗體，再以 TBS-T 清洗並 shacking 10 min，重覆 3 次，加入以 blocking buffer (3% 脫脂牛奶) 稀釋後的二次抗體 shacking 1hr 後，倒出抗體，以 TBS-T 清洗並 shacking 10 min 重覆 3 次，於 避光的環境中加入 hydrogen peroxidase (HRP) 冷光呈色劑反應，隨後將轉漬膜 固定於壓片夾上以底片進行壓片 (1 sec ~ 15 min，效果不佳可重複壓片) 以顯影 劑、水、定影劑、水之順序進行洗片。拍照訊號強度使用 Chemi Capture 軟體分 析並以 Array Analysis 軟體量化分析，比對蛋白質的表現量。
48 四、統計分析
所有試驗皆進行三重複，實驗結果均以平均值 ± 標準偏差 (mean ± SD) 表 示。利用 SPSS 系統之單因子變方分析 (one-way ANOVA) 進行統計處理，再以 Duncan’s multiple range test 作組間的差異性比較，p<0.05、p<0.01 與 p<0.001 表 示具有顯著性差異。
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圖 4-1、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠於 參考記憶試驗中找尋平台時間記憶學習能力
Fig. 4-1. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on memory and learning ability of the Aβ40-infused rats in reference memory task.
Trials
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Escape Latency (sec)
0 20 40 60 80 100
Vh A SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
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圖 4-2、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠於 probe test 試驗中於目標象限之游泳時間記憶學習能力之影響
Fig. 4-2. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on memory and learning ability the Aβ40-infused rats in probe test. Data are presented as mean ± SD (n=8). *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ###
indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
T im e s p e m t i n t ar ge t q u ad ran t ( se c)
0 10 20 30 40 50
***
***
***
***
###
###
##
#
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Aβ 組有極顯著改善效果 (p<0.001) 並較 Gs+Dz 組改善效果佳。以 Gse+Dze 組表現出最佳的效果，再者為 SmE 組，而 Gs+Dz 組雖然改善效果不如 L-SmE、Gse+Dze 但也表現出有極顯著改善空間探測能力的效果 (p<0.001)，SmE 組則沒有表現出顯著下降 (p>0.05)。以上結果可得知，經發酵的 L-SmE 組與去
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圖 4-3、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠於 工作記憶試驗中記憶學習能力之影響
Fig. 4-3. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on memory and learning ability of the Aβ40-infused rats in working memory task. Data are presented as mean ± SD (n=8). *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ,
#, ##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
Escape Latency (sec)
0 10 20 30 40 50
***
*** *** ***
***
###
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圖 4-4、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之 大腦皮質與海馬迴中 TBARS 含量之影響
Fig. 4-4. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the formation of TBARS in the cortex and hippocampus of Aβ40-infused rats. Data are presented as mean ± SD (n=8). *, **, ***
indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
TBARS content (ug/g) protein
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三、前發炎因子 NF-κB、iNOS 與 COX-2 蛋白表現之影響
TNF-α 刺激 1κB kinase 後釋放 p50 與 p65 並聚合成 NF-κB。而釋出的 NF-κB 便進入細胞核活化相關基因，接著轉譯出發炎反應蛋白 COX-2 與 iNOS 等發炎物質 (Lin et al., 2013)，於實驗結果圖 4-7、4-8 顯示，在大腦皮質與海馬 迴組織中 Aβ 組均顯著的高於 Vh 組 (p<0.05)，證明腦部輸注 Aβ40 可能造成 NF-κB 蛋白含量的增加，而 L-SmE 對於 Aβ 組有顯著抑制 NF-κB 蛋白含量 之效果 (p<0.05)，SmE 則無此效果 (p>0.05)。海馬迴的方面 L-SmE 組對於 Aβ 組有極顯著改善效果 (p<0.001)，SmE 也有顯著抑制 NF-κB 蛋白含量之效果 (p<0.01)，兩組比較之間雖然有 L-SmE 組較佳之趨勢，但並無顯著差異 (p>0.05)。
而在 Gs+Dz 組與 Gse+Dze 組的方面，雖然都有顯著抑制 NF-κB 蛋白含量之 效果 (p<0.05)，但與 L-SmE 組間則無差異 (p>0.05)。
大量的 iNOS 產生大量的 NO，便會引起大量自由基攻擊細胞組織加劇其 發炎反應，如圖 4-9、4-10 實驗結果顯示大腦皮質組織中 Aβ 組與 Vh 組 iNOS 蛋白表現有顯著上升 (p<0.01)，雖然在海馬迴之中看不出顯著上升 (p>0.05) 但 是 Aβ 組中的 iNOS 蛋白表現量也有較多之趨勢，皮質中 L-SmE 組有極顯著 抑制 iNOS 蛋白含量之效果 (p<0.001) 但 L-SmE 組與其他組別比較則沒有改 善效果的差異 (p>0.05)。海馬迴的方面 L-SmE 組對於 Aβ 組有顯著改善的效果 (p<0.05)，純物質組的方面，Gs+Dz 組與 Gse+Dze 組在皮質中對於 Aβ 組都有 極 顯 著 抑 制 iNOS 蛋 白 含 量 之 效 果 (p<0.001) ， 但 與 L-SmE 組 效 果 相 同 (p>0.05)。海馬迴中 Gs+Dz 組與 Gse+Dze 組對於 Aβ 組有顯著抑制 iNOS 蛋 白含量之效果 (p<0.05) ，但與 L-SmE 組比較效果仍無差異 (p>0.05)。
COX-2 其功能在於能刺激血管擴張素與組織胺以擴張血管增加血液流量，
並活化 macrophages 或其他免疫細胞充斥於發炎組織 (Medeiros et al., 2010) 容 易使發炎反應加劇。圖 4-11、4-12 顯示 COX-2 的蛋白表現中 L-SmE 組對於 Aβ 組有顯著改善效果 (p<0.01)，Gs+Dz 組與 Gse+Dze 組表現出顯著改善效果
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圖 4-5、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之 大腦皮質組織中前發炎因子蛋白 Western blotting 圖
Fig. 4-5. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the proinflammatory factor in the cortex of Aβ40 infusion rats.
NF-κB
β-actin 42 kDa
65 kDa Aβ SmE L-SmE GsDz GseDze
Vh
130 kDa iNOS
70-72 kDa COX-2
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圖 4-6、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之 海馬迴組織中發炎因子蛋白 Western blotting 圖
Fig. 4-6. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the proinflammatory factor in the hippocampus of Aβ40 infusion rats.
NF-κB
β-actin 42 kDa
65 kDa Aβ SmE L-SmE GsDz GseDze
Vh
130 kDa iNOS
70-72 kDa COX-2
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圖 4-7、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之 大腦皮質組織中 NF-κB 蛋白質表現量化數據之影響
Fig. 4-7. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the NF-κB expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
NF-kB expression percentage in cortex (%)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
* * *
*
#
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圖 4-8、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之 大腦皮質組織中 NF-κB 蛋白質表現量化數據之影響
Fig. 4-8. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the NF-κB expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
圖 4-9、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠之
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
NF-kB expression percentage in hippocampus (%)
0
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
iNOS expression percentage in cortex (%)
0
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大腦皮質組織中 iNOS 蛋白質表現量化數據之影響
Fig. 4-9. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the iNOS expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
圖 4-10、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠 之海馬迴組織中 iNOS 蛋白質表現量化數據之影響
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
iNOS expression percentage in hippocampus (%)
0 100 200 300 400
*
* *
#
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Fig. 4-10. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU 101-fermented soy milk (L-SmE) on the iNOS expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ###
indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
(p<0.05)。海馬迴的方面 Vh 組比起 Aβ 組有有下降的趨勢，但是並無 COX-2 蛋白含量顯著上升之狀況 (p>0.05)，而 L-SmE 組對於 Aβ 組有顯著抑制 COX-2 蛋白含量之結果 (p<0.05)，SmE 組則無顯著之效果 (p>0.05)，對於純物質組 的方面，雖然都有顯著抑制 COX-2 蛋白含量之效果 (p<0.05)，但與 L-SmE 組 表現之效果相同 (p>0.05)。
四、阿茲海默症相關因子 apo E 與 p-Tau 的蛋白表現
Tau 蛋白 的異 常磷 酸化 時會 形 成 雙 股螺 旋 纖維， 其 不 正 常 磷 酸 化 導 致 microtube 組裝能力降低甚至瓦解，繼而損害軸突運輸 (axoplasmic transport)，導 致神經傳遞物質無法順利降解，最終使神經元細胞退化死亡 (Wu et al., 2015)。
圖 4-15、4-16 結果顯示大腦皮質中 Aβ 組比起 Vh 組有顯著增加 p-Tau 蛋白 含量 (p<0.05)，在海馬迴中也能看到相當高量的 tau 蛋白在 Aβ 組與 Vh 組呈 現極顯著上升 (p<0.001)。 L-SmE 組能顯著抑制 Aβ 組 p-Tau 蛋白之含量 (p<0.01) 但在 SmE 組方面沒有顯著效果 (p>0.05)，反而還有多餘 Aβ 組 p-Tau 蛋白之含量的趨勢，海馬迴中 L-SmE 組有顯著抑制 p-Tau 蛋白含量之效果 (p<0.01)，SmE 組也有顯著抑制 p-Tau 蛋白含量之效果 (p<0.05)，但 L-SmE 組
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Fig. 4-11. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
COX-2 expression percentage in cortex (%)
0
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101-fermented soy milk (L-SmE) on the COX-2 expression in the cortex of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #, ##, ###
indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.
圖 4-12、豆奶乙醇萃取物與乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物對腦部輸注 Aβ40 大鼠 之海馬迴組織中 COX-2 蛋白質表現量化數據之影響
Fig. 4-12. Effect of ethanol extracts of Soy milk (SmE) and ethanol extracts of NTU
Vh Aβ SmE L-SmE Gs+Dz Gse+Dze
COX-2 expression percentage in hippocampus (%)
0 50 100 150 200 250
# #
* *
*
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101-fermented soy milk (L-SmE) on the COX-2 expression in the hippocampus of Aβ40 infusion rats. Data are presented as mean ± SD. *, **, *** indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with Aβ, #,
##, ### indicated the significant difference (p<0.05, p<0.01, p<0.001, respectively) as compared with L-SmE.