第三章、 實驗材料與方法
第一節、 實驗材料
二、 實驗儀器
1. 超 純 水 機 (Ultrapure water system) (PURELAB Classic UV MK2, ELGA LabWater Co., Marlow, UK)
2. 滅菌釜 (Autoclave) (TM-329, TOMIN MEDICAL EQUIPMENT Co., Ltd., New Taipei, Taiwan)
3. 酸鹼度計 (pH meter) (UltraBasic pH Meter, Denver Instrument Co., Goettingen, Germany)
4. 電磁加熱攪拌器 (Hotplate & Stirrer) (SH-301, Suntex Instruments Co., Ltd, New Taipei, Taiwan)
5. 電子天平 (Electronic Balance) (AY-220, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)
6. 高 速 冷 凍 離 心 機 (Universal Centrifuge) (Z326K, Hermle Labortechnik, Wehingen,Germany)
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7. 熱風烘箱 (Forced convection oven) (XIN-XONG, Inc., aohsiung, Taiwan) 8. 恆溫水浴槽 (Water bath) (OSB-2000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd, Tokyo, Japan) 9. 振盪混合器 (Vortex mixer) (VM-2000, Digisystem Laboratory Instruments Inc.,
New Taipei, Taiwan)
10. 全 光 譜 微 量 盤 分 析 儀 (Microplate Spectrophotometer) (Multiskan™ GO, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)
11. 顯微鏡數位攝影機 (Digital camera) (Moticam 5, Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Germany)
12. 快 速 轉 漬 器 (Thermo Scientific Pierce G2 Fast Blotter) (Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford, IL, USA)
(二)動物試驗相關設備
1. 動物腦部立體定位儀 (Stereotaxic instrument) (Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)
2. 微小滲透壓幫補 (Mini-Osmotic Pump) (Model 2004, Alzet® Corporation, Palo Alto, CA, USA.)
3. 腦部輸注套組 (brain Infusion Kit II 3-5 mm, Alzet®, Cupertino,CA, USA)
36 第二節、 實驗方法
一、試驗物質製備
(一) 乳酸菌發酵豆奶製備
大豆與蒸餾水之以 1:10 (w/v) 之比例於室溫下浸泡 8 小時後，以磨漿機製 成豆奶，並以紗布進行過濾，除去豆渣。將濾過後之豆奶加熱至 95℃ 維持 5 分 鐘，冷卻後於 4℃ 冷藏可保存一星期，使用前將豆奶之濃度統一調整至 15 Brix 再以 90℃ 水浴 1 小時，待冷卻後接菌。NTU 101 發酵豆奶粉末、豆奶粉末、
乙醇萃取物、水萃取物等試驗物質及成分含量均由晨暉生物科技股份有限公司提 供。
(二) 萃取物製備條件
試驗菌株於 37℃ 下培養活化兩代後將其接種於豆奶中，接種量為 1% (v/v)，
於 37℃ 下分別靜置培養 12、24、36 與 48 小時後進行試驗。
1. 乙醇萃取物
發酵豆奶冷凍乾燥後取其凍乾粉末 25 g 溶於 95% 乙醇 100 mL 後在 37
℃ 水浴 30 分鐘，取其酒精層並以 Whatman No. 42 濾紙過濾，以減壓濃縮機 進行濃縮，濃縮後之萃取物後以 DMSO 回溶。其中含有 6.26 μg/mg 的 genistein 與 6.78 μg/mg 的 daidzein。
2. 水萃取物
發酵豆奶凍乾後取其凍乾粉末 10 g 溶於蒸餾水 25 mL 後在 37℃ 水浴 30 分鐘。再以 10,000 x g 離心 20 分鐘，取清液經冷凍乾燥，以蒸餾水回溶即為水 萃取物。當中含有 0.127 μg/mg 的 daidzein。
二、動物行為試驗
(一) 實驗動物飼養與分組
本研究中所採用之動物為購自樂斯科生物科技股份有限公司之 SD 品系雄
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性大鼠，第一部分比較乳酸菌發酵豆奶與未發酵豆奶分試驗分組為週齡 8 週、
6 組，每組 8 隻，共 48 隻。第二部分功效成分的比較試驗分為 8 組，每組 8 隻，共 64 隻。飼養於控制相對溼度 60%，室溫 26 ± 1℃，光照時間為 8:00~20:00 之 12 小時光照循環，食物與水供給不予限制之環境下。大鼠預養至體重達到 300 g 時進行實驗分組與腦部輸注幫浦植入手術。
第一部分的乳酸菌發酵豆奶未發酵豆奶比較組試驗中分為八組每組 8 隻，
分為假手術組 Vehicle, Vh 組，注射空白試劑以一般飼料餵食，連續 28 天腦部 輸注 Aβ40 的 Amyloid β-peptide, Aβ 組以一般飼料餵食，在飲水中餵食未發酵 豆奶之乙醇萃取物組 Ethanol extracts of Soy milk, SmE 組，在飲水中餵食益生菌 發酵豆奶之乙醇萃取物組 Ethanol extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmE 組，在飲水中加入純物質 Genistin 和 Daidzin 組 (Gs+Dz 組)，在飲水中加入純 物質 Genistein 和 Daidzein (Gse+Dze 組)。第二部分功效成分比較組每組 8 隻，
分為假手術組 Vehicle, Vh 組，注射空白試劑以一般飼料餵食，連續 28 天腦部 輸注 Aβ40 的 Amyloid β-peptide, Aβ 組以一般飼料餵食，餵食乳酸菌發酵豆奶 組 NTU 101 fermented-Soy milk, L-Sm 組，餵食乳酸菌發酵豆奶之乙醇萃取物組 (Ethanol extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmE 組)，餵食乳酸菌發酵豆 奶之水萃取物組 (Water extracts of NTU 101 fermented-Soy milk, L-SmW 組)，在 飲水中加入純物質 Genistin (Gse 組)，在飲水中加入純物質 Daidzein (Dze 組)，
以及飲水中加入純物質 Equol (E 組)。
(二) 餵食劑量之計算 1. 餵食劑量換算
本研究使用雄性 SD 大鼠購自樂斯科生物科技股份有限公司 (Ilan, Taiwan)，
週齡 8 週，每組 8 隻，飼養於控制相對溼度 60%，室溫 26 ± 1℃，光照時間 為 8:00~20:00 之 12 小時光照循環，食物與水供給不予限制之環境下。大鼠預 養至體重達到 300 g 時進行實驗，試驗物質餵食的劑量依照表一、二所示，餵
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表一、L-SmE 與 SmE 改善 Aβ40 腦部輸注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試 驗之動物分組
Table 1. Animal grouping for the study on the effect of L-SmE and SmE on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ-infused rat
Group Sample Aβ-40
infusion Dose(mg/rat/day)
Vh - -
-Aβ - +
-L-SmE Ethanol extracts of NTU101 fermented-Soy
milk + 116.4
SmE Ethanol extracts of Soy milk + 116.4
Gs+Dz Genistin+Daidzin + 0.729+0.789
Gse+Dze Genistein+Daidzein + 0.729+0.789
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表二、Gse、Dze 與 E 改善 Aβ40 腦部輸注之阿茲海默症大鼠記憶學習能力試 驗之動物分組
Table 2. Animal grouping for the study on the effect of Gse, Dze and E on ameliorating the impairment of memory and learning ability in intracerebroventricular Aβ-infused rat
Group Sample Aβ40
infusion Dose(mg/rat/day)
Vh - -
-Aβ - +
-L-Sm NTU101 fermented-Soy milk + 1200
L-SmE Ethanol extracts of NTU101 fermented-Soy milk + 116.4
L-SmW Water extracts of NTU101 fermented-Soy milk + 147.6
Gse Genistein + 0.729
Dze Daidzein + 0.789
E Equol + 0.789
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食 劑 量 換 算 參 照 美 國 FDA 所 提 供 之 公 式 計 算
(http://www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)，以 60 kg 成人為基準人體每日 每公斤體重之建議攝取量的 6.25 倍為每公斤大鼠之試驗劑量。
2. 阿茲海默症模式大鼠之誘導
誘導記憶學習能力損傷之設備由 Mini-Osmotic Pump (Model 2004, Alzet® Corporation, Palo Alto, CA, USA.)，輸注速率 0.25 μL/hr，內容量 234 μL，軟管 (長約 70 mm，內容量約 80 μL)、brain Infusion Kit II，3-5 mm，Alzet© 所構成，
如圖 3-1。
(三) 阿茲海默症模式大鼠建立之手術操作
Aβ peptide 由於其片段短小，所以於使用前須至於 PBS 緩衝溶液之中經過 7 天聚合反應配製成 Aβ 溶液，將配置完成之溶液和未加入 Aβ 之空白溶液 (做 為 vehicle 組) 注入 Alzet osmotic mini-pump，接上 brain infusion kit II 並使溶液 充滿整個輸注管與輸注頭。將大鼠去除頭部毛髮並置於動物立體定位儀上以 chloral hydrate (450 mg/kg) 口鼻吸入進行麻醉後，根據 Paxinos 與 Watson 之大 鼠腦部立體解剖圖進行左側腦室定位，以頭蓋骨上之 bregma 為中心，於縱軸 0.8 mm，橫軸 1.4 mm 位置進行海馬迴之定位並進行鑽孔 (Paxinos and Watson, 2005) 。待定位後，將 Alzet osmotic mini-pump 置於頸後皮下區，brain infusion kit II 置入，輸注頭深入頭蓋骨之深度為 4.0 mm。完成後並以生物黏合膠固定接 著墊片與接頭於頭蓋骨上。最後以縫合夾縫合，並歸回飼養籠中照顧。而手術日 程如圖 3-2 所示。
(四) 記憶學習能力試驗
手術完後第 27 天進行工作記憶試驗，休息平臺放置於不同象限 (第四象 限)，試驗 5 次 (第 1 次試驗室為認知訓練故不納入數據計算)，大鼠頭向外依 序隨機分別進入 5 個進入點，每次 90 sec；若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，
讓大鼠休息 15 sec 後，抓出泳池休息 60 sec，然後進行下一次之測試。若大鼠
41 圖 3-1、ALZET 腦部輸注幫浦
Fig. 3-1. Mini-osmotic pump and brain infusion kit
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圖 3-2、試驗物質改善阿茲海默症大鼠之記憶學習試驗日程表
Fig. 3-2. The experiment schedule of learning and memory task of test substance for Alzheimer’s disease rats.
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於 90 sec 尚未找到休息平臺，則將大鼠抓到休息平臺，休息 15 sec 後，移出泳 池休息 60 sec，再進行下一次之訓練，試驗結束後將試驗結果進行平均並統計組 間之差異。
1. 試驗裝置
圖 3-3 水迷宮裝置為圓形泳池之直徑為 180 cm，高度 60 cm，泳池中含有 一可移動的休息平臺 (escape platform)。平臺之直徑為 10 cm，高度為 30 cm。
實驗進行前泳池須加水至 32 cm 之液面高度 (液面標準為高於平台 2 公分)。
泳池區分為四個象限 ( I、II、III 與 IV 區)，並設置 4 個起始點，休息平臺放 置於任一象限之中心點。試驗期間並於泳池中心點之正上方架設攝影機以記錄實 驗動物之游泳路徑 (Tabuchi et al., 2009)。
2. 參考記憶試驗 (Reference memory task)
定位手術後第 24 至 26 天進行參考記憶試驗，休息平臺固定置於第三象限 上，大鼠頭向外依序隨機分別進入四個進入點，每天訓練 4 次，每次 90 sec；
若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，讓大鼠休息 30 sec 後回籠子休息 30 sec，
然後進行下一次之測試。
3. 空間性探測試驗 (Probe test)
第 26 天之參考記憶試驗後立即進行，將休息平臺移出泳池，將大鼠依序 隨機分別進入四個進入點，游泳 90 sec，同時以正上方之攝影機紀錄大鼠停留於 原參考記憶試驗中休息平臺放置之象限 (第三象限) 中之時間與全程游泳之路 徑。
4. 工作記憶試驗 (Working memory task)
手術完第 27 天進行工作記憶試驗，休息平臺放置於不同象限 (第四象限)，
試驗 5 次 (第 1 次試驗室為認知訓練故不納入數據計算)，大鼠頭向外依序隨 機分別進入 5 個進入點，每次 90 sec；若大鼠於 90 sec 內即找到休息平臺，
44 圖 3-3、水迷宮裝置與分區域示意圖 Fig. 3-3. Instrument of water maze task
10 cm
60cm
180 cm 30 cm
2 cm
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讓大鼠休息 15 sec 後，抓出泳池休息 60 sec，然後進行下一次之測試。若大鼠 於 90 sec 尚未找到休息平臺，則將大鼠抓到休息平臺，休息 15 sec 後，移出泳 池休息 60 sec，再進行下一次之訓練，試驗結束後將試驗結果進行平均並統計組 間之差異。
三、生理生化分析 (一) 腦組織之處理
實驗完成後犧牲老鼠，並取出腦部組織，按 Groswisky 方法 (Tabuchi et al., 2009) 分成 cortex、hippocampus 區域。
取出之腦部組織分成左腦、右腦，於左腦輸注點附近進行切片，厚度約 0.1-0.3 cm 以便後續組織免疫染色分析，其餘組織分別加入 25 mM Lysis buffer (pH=7.5) (4℃) 均質。Cortex 分左、右腦，每次加入 300 μL buffer 後，均質離 心 (15,000 x g，30 min，4℃)；取上清液。Hippocampus 加入 300 μL 後，均質、
離心 (15,000 x g，30 min，4℃)，取上清液。保存於 -80℃ 的冷凍櫃中。
(二) 蛋白質含量之測定
以 bicinchoninic acid (BCA) 法蛋白質定量套組進行分析，BCA 法是利用蛋 白質對兩價銅離子 (Cu2+) 進行還原，所生成的 Cu2+ 可以 BCA 專一性地呈色 而定量，BCA reagent kit (23225, Pierce, Box, PO, USA) 含 Reagent A (BCA) 及 Reagent B (CuSO4)，先將 Reagent A 和 Reagent B 以 50：1 比例均勻混合， BSA 標準品 (2 mg/mL) 以 Lysis buffer 稀釋一系列濃度，2000、1000、500、250、125、
62.5 與 31.25 mg/mL。各標準品每濃度與樣品取 10 μL 以三重複加入微量滴定 盤之孔槽內。每槽加 200 μL 上述之混合 BCA reagent，均勻混合後靜置 37℃ 反 應 10 min。以全光譜微量盤分析儀測 595 nm 吸光。作圖畫出標準校正線，並 決定未知樣本的濃度。
(三) 脂質過氧化測定分析法
脂質過氧化分析法是參考 Tarladgis et al. 之方法 (Tarladgis et al., 1964)，以
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(四) 組織免疫染色 (immunohistochemistry stain, IHC stain)
大鼠犧牲後取腦組織並快速浸泡於 10% 的福馬林中，進行石蠟包埋與切片 μL/well 之 Sample。在電泳槽內外注入 Electrophoresis running buffer，通入電流
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80 伏特至跑完 stacking gel，再以 120 伏特跑完 running gel 直到結束。
將已知濃度的樣本定量後，以電泳槽進行十二烷基硫酸鈉電泳法 (sodium dodecyl Sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。此電泳法利用分子 量不同來分離出蛋白質。電泳膠片 (gel) 的孔隙使分子量大的蛋白質位於上方，
分子量較小的蛋白質移動較快速則在下方。Gel 密度較小，蛋白通過孔徑較大，
比起密度大的膠片，分子量大的蛋白質相對移動速度變快。
(六) 蛋白質轉漬-西方墨點法 (western blot)
Polyvinylidene fluoride (PVDF) 轉漬膜先以甲醇浸泡，目的為洗去上層脂質 活化轉漬膜，電泳結束後將已分離之蛋白質膠體取出，以超純水潤洗過膠體和 PVDF 轉漬膜 5 min，以快速轉漬器 (Thermo Scientific Pierce G2 Fast Blotter) 進 行轉漬。截去上層 stacking gel 後，以 1-step transfer buffer (84731, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) 潤濕依正極至負極方向依序疊放：7 張濾紙 (8 x 10.5 cm)、
已用甲醇溼潤的 PVDF 轉漬膜、電泳膠片、7 張 濾紙，將其組合完成後將以轉
已用甲醇溼潤的 PVDF 轉漬膜、電泳膠片、7 張 濾紙，將其組合完成後將以轉