動物試驗

一、本研究動物試驗模式

1949 年 Best 等人誘導酒精性肝損傷之方法是在大鼠飲水中加入酒精，但 發現大鼠可自行選擇是否飲用，因此使酒精攝取量不足以誘發肝損傷 (Best et al., 1949)，直到 1963 年學者 Lieber 提出給予大鼠含有酒精之液態飼料，使動物攝 取營養來源同時攝取足夠的酒精 (12-18 g/kg)，且酒精攝取量為添加在飲水中約

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2-3 倍，血液中酒精濃度維持在 100-150 mg/dL (Lieber, 1963)。而後 Lieber 與 DeCarli 餵食大鼠液態飼料 (飼料成分中以酒精取代依照動物所需總能量中之 36% 碳水化合物)，顯示實驗動物依飼養期不同而發展為脂肪肝、酒精性肝炎等 不同程度之肝病變，並伴有 TG 及肝中 TC 上升，而控制組動物則保有正常的 肝臟。此一應用 Lieber-DeCarli nutrient diet 誘發酒精性肝病變之實驗動物模式，

已成為主要的肝病變誘發動物模式且沿用至今 (Lieber and DeCarli, 1982; Lieber and DeCarli, 1989)。另外，酒精性肝病之機制及治療的文獻回顧中提及，運用 Lieber-DeCarli liquid nutrient diet 餵食大鼠、小鼠、狒狒 (baboons) 和小型豬 (minipigs) 等，所產生之肝損傷包含：肝臟脂肪變性、酒精性肝炎和類似人類酒 精性肝病變的組織學特徵 (Altamirano and Bataller, 2011)。雖然許多的研究模式 是以短期大量酒精攝入促使肝細胞中粒線體 DNA 耗損及脂質過氧化，因而啟 動肝細胞凋亡與壞死，但大量急性的酒精攝取較不符合人類對於酒精攝取的行為 (Nanji, 2004)，因此本實驗以 Lieber-DeCarli liquid nutrient diet 誘發酒精性肝損 傷，飼料配方如表 3-1。

二、紅麴菌抗氧化物質 DMA、DFC 對酒精性肝損傷之影響 (一) 動物飼養

本研究採用之 7 周齡 C57BL/6J 品系雄性小鼠，購自財團法人國家實驗動 物研究院實驗動物中心，每組 8 隻，共 56 隻，飼養於溫度 23 ± 1^oC，光照時 間為 8:00 - 20:00 之 12 小時循環光照環境下。第一周適應期給予 Laboratory Rodent Diet，一周後體重均達 20 g 便進行試驗分組並開始餵食 Lieber-DeCarli Regular Control 或 Ethanol Diet，食物與水皆不予限制。試驗進行 6 周，試驗物 質以管餵方式每日給予固定量，其劑量換算參考美國 FDA 公告，以 60 公斤之 成人為基準，人體每日每公斤體重之建議攝取量的 12.3 倍為小鼠之劑量 (US FDA, 2005)。

(二) 分組與餵食劑量換算

本實驗使用之 DMA 與 DFC 由晨暉生物科技公司提供，其中 DMA 之萃 取與純化鑑定參照 2013 年 Lee 等人發表之方法 (Lee et al., 2013a)；DFC 依據 2012 年 Hsu 等人發表之方法 (Hsu et al., 2012b)。分組與試驗劑量如表 3-2。正 控制組 silymarin：silymarin 在目前肝臟疾病應用上之機制包括抗發炎、抗氧化、

47 表 3-1 試驗飼料組成

Table 3-1 Composition of experimental diets

Items Control Rat Diet DYET# 710027

Ethanol Rat Diet DYET# 710260 Ingredients Concentration (g/L) Concentration (g/L)

Casein, (100 Mesh) 41.4 41.4

L-Cystine 0.5 0.5

DL-Methionine 0.3 0.3

Corn Oil 8.5 8.5

Olive Oil 28.4 28.4

Safflower Oil 2.7 2.7

Maltose Dextrin 115.2 25.6

Cellulose 10.0 10.0

Mineral Mix #210011 8.75 8.75

Vitamin Mix # 310011 2.5 2.5

Choline Bitartrate 0.53 0.53

Xanthan Gum 3.0 3.0

Total 221.78 132.18

95% Ethanol (ml/L) 0.0 67.0

Grand total (kcal/L) 999.8465 1000.2805

This control diet contains 1.0 Kcal/mL, of which 35% are fat derived, 47% are derived from carbohydrate, and 18% are derived from protein. This ethanol diet contains 1 Kcal/ml, of which 35% are fat derived, 11% derived from carbohydrate, 18% are derived from protein, and 36% are derived from ethanol.

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表 3-2 紅麴菌次級代謝物 DMA 與 DFC 對預防酒精誘發小鼠肝損傷試驗之動 物分組與試驗物質劑量配置

Table 3-2 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Monascus-fermented secondary metabolites DMA and DFC on the prevention of ethanol-induced liver injury in mice

Groups Experimental samples Dose (mg/kg b.w.)

NOR - -

EtOH - -

SL silymarin 200

DMA-L dimerumic acid 3

DMA-H dimerumic acid 15

DFC-L deferricoprogen 3

DFC-H deferricoprogen 15

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抗纖維化和免疫調節作用 (Lieber et al., 2003)，本研究以 200 mg/kg 作為每公斤 小鼠每日所需之劑量。DMA 與 DFC 尚未有人體建議劑量，為考量萃取效率，

便以紅麴 50 % 酒精萃取物中含有 3 mg/g 之 DFC 為本次試驗之低劑量。

DMA-L 組：以 3 mg 之 DMA 做為每公斤小鼠每日所需劑量。DMA-H 組：以 五倍低劑量之 DMA，15 mg/kg。DFC-L 組：以 3 mg 之 DFC 做為每公斤小鼠 每日所需劑量。DFC-H 組：以五倍低劑量之 DFC，15 mg/kg 為每日所需劑量。

三、紅麴菌黃色素 MS、AK 進行預防酒精性肝損傷之動物試驗 (一) 動物飼養

本研究採用之 7 周齡 C57BL/6J 品系雄性小鼠，購自財團法人國家實驗動 物研究院實驗動物中心，每組 8 隻，共 56 隻，飼養於溫度 23 ± 1^oC，光照時 間為 8:00 - 20:00 之 12 小時循環光照環境下。第一周適應期給予 Laboratory Rodent Diet，一周後體重均達 20 g 便進行試驗分組並開始餵食 Lieber-DeCarli Regular Control 或 Ethanol Diet，食物與水皆不予限制。試驗進行 6 周，試驗物 質以管餵方式每日給予固定量，其劑量換算參考美國 FDA 公告，以 60 公斤之 成人為基準，人體每日每公斤體重之建議攝取量的 12.3 倍為小鼠之劑量 (US FDA, 2005)。

(二) 分組與餵食劑量換算

本實驗使用之 MS 與 AK 由暉生物科技公司所提供，參照 Hsu 等人於 2010 年發表之方法，以紅麴發酵產物作為原料製備與鑑定，純度為 99.9% (Hsu et al., 2010d)。分組與試驗劑量如表 3-3。正控制組 silymarin：以 200 mg/kg 作 為每公斤小鼠每日所需之劑量；MS-L 組：以 3 mg 的 MS 為每人每天所需攝 取之含量，根據上述之換算公式，每日每公斤小鼠所需之劑量為 3 mg/60 x 12.3 可得 0.615 mg 之 MS，為每日每公斤小鼠所需劑量；MS-H 組：為低劑量五倍 濃度，以 3.075 mg 為最終小鼠每日每公斤之劑量；AK-L 組：人體每人每天所 需建議劑量為 1.5 mg，根據換算公式，每日每公斤小鼠所需之劑量為 1.5 mg/60 x 12.3，得 0.3075 mg 之 AK，此為每日每公斤小鼠所需劑量；AK-H 組：為低 劑量之五倍濃度，以 1.5375 mg 為最終小鼠每日每公斤之劑量餵之。

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表 3-3 紅麴菌次級代謝物 MS 與 AK 對預防酒精誘發小鼠肝損傷試驗之動物 分組與試驗物質劑量配置

Table 3-3 The animal grouping and sample dose in the animal test for the evaluation of Monascus-fermented secondary metabolites MS and AK on the prevention of ethanol-induced liver injury in mice

Groups Experimental samples Dose (mg/kg b.w.)

NOR - -

EtOH - -

SL silymarin 200

MS-L monascin 0.615

MS-H monascin 3.075

AK-L ankaflavin 0.3075

AK-H ankaflavin 1.5375

51 (三) 動物犧牲

實驗動物禁食十二小時後以二氧化碳窒息法犧牲，並採集血液及肝臟組織。

血液經離心後，收集血清進行生化分析。組織表面以生理食鹽水清洗，再以擦手 紙吸乾後秤重，而後切取肝臟第二大葉部分組織，置入組織包埋盆浸泡於 10%

福馬林中，進行石蠟包埋與切片，供組織染色分析使用，最後剩餘之所有肝臟以 0.9% 生理食鹽水將其內部洗淨，儲存在 -80^oC 冰箱備用。

(四) 血清肝功能分析

血清中肝功能之檢測項目分別為 AST、ALT 和 ALP，以上皆委託尚捷醫 事檢驗所 (Tainan, Taiwan)，以生化自動分析儀 (Beckman-700, Fullerton, CA, USA)進行檢測。

(五) 血清中脂質濃度測定

血液中脂質濃度之檢測項目為血清中之 TC 及 TG，分別使用市售生化試 劑 (BXC 0261, Fortress) 分析 TC 濃度，以市售生化試劑 (BXC 0271, Fortress) 分析 TG 濃度，操作方法如套組說明書所示。

【TC 測定】 (BXC 0261, Fortress)

在 96 孔盤中加入 2 μL 血清樣品及 200 μL reagent，於 37 ^oC 下反應 5 min。

利用 ELISA reader 測量 500 nm 波長之吸光值，並與標準曲線比較，進行定量。

【TG 測定】 (BXC 0271, Fortress)

Cholesterol ester + H₂O Cholesterol Cholesterol + Fatty acids esterase

Cholesterol + O₂ Cholesterol

oxidase Cholestene-3-one + H₂O₂ 2 H₂O₂+ phenol + 4-aminoantipyrine Peroxudase

quinoneimine + 4 H₂O

Triglycerides + H₂O lipase glycerol + Fatty acids glycerol + ATP GK

glycerol-3-phosphate + ADP

glycerol-3-phosphate + O₂ GPO

dihydroxyacetone + phosphate + H₂O₂ 2 H₂O₂+ 4-aminophenazone + 4-chlorophenol quinoneimine POD

quinoneimine + HCl + 4 H₂O

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取 2 μL 血清樣品加至 96 孔盤中，接著加入 200 μL reagent，於 37 ^oC 下 反應 5 min。利用 ELISA reader 測量 546 nm 波長之吸光值，並與標準曲線比 較，進行定量。

(六) 肝臟脂質含量、氧化和抗氧化功能相關之成分或酵素活性測定 1. 肝臟組織均質液之製備

秤取 0.05 g 肝組織，加入 0.5 mL 之 1X-PBS (0.026 M NaCl、0.0026 M NaH2PO4，pH 7) 或 1X- lysis buffer (1% Triton X-100、20 mM Tris、40 mM NaF、

0.2% SDS、0.5% deoxy -cholate、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na₃VO₄、100 mM NaCl，pH 7.5) 或 DMSO 進行均質，依不同分析取用不同均質液。接著於 4

oC 下以 12,000 x g 離心 15 min，取上清液保存於 -80 ^oC 冰箱中，供日後分析 使用。

2. 肝臟脂質濃度測定

肝臟脂質濃度之檢測項目為 TC 及 TG，分別使用市售生化試劑 (BXC 0261, Fortress) 分析 TC 濃度，以市售生化試劑 (BXC 0271, Fortress) 分析 TG 濃度，操作方法如套組說明書所示。

【TC 測定】 (BXC 0261, Fortress)

其原理與前述相同。於 96 孔盤中加入 2 μL 組織均質液及 200 μL reagent，

於 37 ^oC 下反應 5 min。利用 ELISA reader 測量 500 nm 波長之吸光值，並以標 準曲線進行定量。

【TG 測定】 (BXC 0271, Fortress)

其原理與前述相同。取 2 μL 組織均質液至 96 孔盤中，接著加入 200 μL reagent，於 37 ^oC 下反應 5 min。利用 ELISA reader 測量 546 nm 波長之吸光 值，並以標準曲線進行定量。

3. 組織脂質過氧化分析 (TBARs assay)

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利 用 TBA (thiobarbituric acid) 之 呈 色 法 ， 測 定 脂 質 過 氧 化 丙 二 醛 (malondialdehyde, MDA) 產量。MDA 產物愈多，其吸光值愈高，因此若樣品可 降低此系統之吸光值，則表示具有抗氧化效應。

脂 質 過 氧 化 分 析 法 是 參 考 Tarladgis 等 人 之 方 法 ， 以 TMP (1,1,3,3- tetramethoxypropane) 為標準品，先以二次蒸餾水將 TMP 稀釋為 1 mM，再以 1 N H₂SO₄ 將其濃度進行序列稀釋，並各取 100 μL，分析方法與樣品相同。

取 50 μL 之組織均質液加入 300 μL 的 5% trichloroacetic acid 及 100 μL 60 mmol/L 的 TBA ，於 95^oC 反應 30 min 後，冷卻於室溫，再於常溫下離心 20-30 min，測定其吸光值並與標準溶液之吸光值對照及蛋白濃度換算得 MDA 濃度 (Tarladgis et al., 1964)。

4. 穀胱甘肽過氧化酶 (glutathione peroxidase, GPx) 活性分析

以市售 glutathione peroxidase assay kit (RS 504, Randox) 進行分析，其原理 利用 GPx 催化 Glutathione (GSH) 氧化，在 glutathione reductase (GRd) 和 NADPH 皆存在的環境下，oxidised glutathione (GSSG) 會產生還原反應，使呈色 率 下 降 。 glutathione peroxidase assay kit 含 reagent (glutathione, glutathione reductase, NADPH)、buffer (phosphate buffer, EDTA) 及 cumene agent，首先以 buffer 將 reagent 配置完成，取 4 μL 組織均質液與 200 μL 上述之 reagent 均 勻混合，再加入 8 μL cumene agent，並於 37^oC 反應，同時以 340 nm 吸光值，

每 1 min 偵測一次，連續偵測 3.5 min，將吸光值變化量計算後求出樣品之酵素 活性。

5. 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 活性分析

使用 superoxide dismutase assay kit (SD 125, Randox) 進行分析，此分析方法 利用 xanthine 與 xanthine oxidase (XOD) 產生超氧自由基，再以 2-(4-iodophen -yl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (I.N.T.) 與超氧自由基反應並呈 色，藉由測定 I.N.T. 之呈色得 SOD 活性。superoxide dismutase assay kit 含 mixed substrate (xanthine, I.N.T.)、buffer (CAPS, EDTA) 以及 xanthine oxidase。

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先以 buffer 配置 mixed substrate，取 5 μL 組織均質液與 170 μL 上述之 mixed substrate 均勻混合，再加入 25 μL xanthine oxidase，並於 37^oC 反應，同時以 505 nm 吸光值，每 30 秒偵測一次，連續偵測 15 min，將吸光值變化量計算後求出 抑制率，再將抑制率套入標準曲線回推樣品之酵素活性。

6. 過氧化氫酶 (catalase, CAT)

CAT 具有催化 H₂O₂ 分解之功能，可將 H₂O₂ 分解為水與氧氣，當 H₂O₂ 分解時，可於 25 ^oC、波長 240 nm 條件下被偵測。取 9 μL 之組織樣本加入 1μL Triton X-100 成為 stock homogenate (SH)，再將 SH 以磷酸緩衝溶液進行稀釋，

調整至 pH 7 為 dilute homogenate (DH)。取 160 μL 之 DH 與 80 μL H₂O₂ (0.03 M) 混合均勻，並以分光光度計於波長 240 nm 下每 15 秒偵測一次，總共偵測 2 次，將吸光值帶入計算公式求得反應速率常數 K，而肝組織 CAT 活性便以每 單位蛋白質所含之反應速率 K 表示 (K/mg of protein)。

K = (2.3/△t) log (Al/A2)

△t：時間間隔 (15 秒鐘)

A1：第一次測定之樣品吸光值-空白吸光值 A2：第二次測定之樣品吸光值-空白吸光值

(七) 肝臟生化分析

1. 肝臟組織均質液之製備

秤取 0.1 g 肝組織，加入 1 mL 內含 protease/phosphatase inhibitor 之 1X-

秤取 0.1 g 肝組織，加入 1 mL 內含 protease/phosphatase inhibitor 之 1X-