紅麴菌抗氧化物質 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷之影響

第四章研究結果

第一節紅麴菌抗氧化物質 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷之影響

一、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠體重與肝重/體重比值之影響

過去文獻指出酒精會直接對腸道及肝臟造成傷害，使得腸道的吸收能力和肝臟對營養素的代謝能力變差，進而造成營養失調 (Lieber, 2005a)，而器官組織的絕對與相對重量增加可作為毒性指標，但也可能為器官為了適應毒物所做出的反應，大部分肝損傷物質會有改變平滑內質網的構造、降低細胞色素含量、增加飽和醯基側鍵含量、促使膠原蛋白增生與纖維化等現象，進而導致重量增加 (De La Iglesia et al., 1982)。研究結果如表 4-1 所示，餵食酒精液態飼料之 EtOH 誘導 組體重於第二周時已顯著低於正常組 (p < 0.05)，而餵食 silymarin、DMA 及 DFC 之組別則不會造成像 EtOH 組顯著下降之趨勢。另肝臟組織重量佔動物體 重之百分比值表示於圖 4-1，顯示 EtOH 組之肝臟組織重量明顯高於正常組 (p

< 0.001)，高劑量之 DMA 與 DFC 能顯著降低肝臟重量 6.7% (p < 0.01) 及 9.4% (p < 0.001)。

二、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠血清中肝功能指標 AST、ALT 及 ALP 含量之變化

血清中天門冬胺酸轉胺酶 (AST) 和丙胺酸轉胺酶 (ALT) 活性為評估肝損傷之指標，而鹼性磷酸酶 (ALP) 則是用於檢測肝膽功能，且能依據各項變化判斷為何種階段之肝損傷 (Ramaiah, 2007)。表 4-2 為本試驗分析測定各組動物肝功能指標 AST、ALT 和 ALP，結果發現 EtOH 誘導組其 AST、ALT 及 ALP 數 值皆為正常組之 1.33 倍、1.34 倍 (p < 0.001) 與 1.16 倍 (p < 0.01)，而 SL 正 對照組和 EtOH 誘導組相比，只有 AST 與 ALT 具顯著差異 (p < 0.001)，但 ALP 並無差別。DMA 於低劑量時已能減低血清中三項肝功能指標，分別為 28.8%、24.9% (p < 0.001) 與 10.6% (p < 0.05)，DFC 則分別降低 30.3%、30.9%

(p < 0.001) 及 10.8% (p < 0.05)。且高劑量 DMA 及 DFC 皆使肝功能指標降低 至與正常組無差異 (p > 0.05)。顯示 DMA 和 DFC 能抑制酒精誘導肝功能指標 上升，使肝臟免於受到酒精之傷害。

三、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中脂質濃度之影響

表 4-1 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠體重之影響

Table 4-1 The effects of DMA and DFC on the body weight gain of the ethanol- induced liver injury mice

groups

body weight (g)

0th week 2nd week 4th week 6th week NOR 21.9 ± 0.83 23.4 ± 0.52 23.9 ± 0.64 25.3 ± 0.89 EtOH 22.0 ± 1.07 22.1 ± 0.64 ^# 22.4 ± 1.06 ^# 22.9 ± 0.99 ^#

SL 21.9 ± 0.83 23.4 ± 1.30 23.8 ± 1.04 24.1 ± 0.99 DMA-L 21.9 ± 0.83 22.8 ± 1.16 23.9 ± 0.35 23.8 ± 1.49 DMA-H 21.9 ± 0.83 22.9 ± 0.99 23.8 ± 1.28 23.1 ± 1.73 DFC-L 21.9 ± 0.83 23.0 ± 1.07 24.0 ± 0.76 23.5 ± 1.07 DFC-H 21.9 ± 0.99 22.6 ± 1.41 23.6 ± 1.51 23.0 ± 0.93 NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, DMA-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DMA, DMA-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DMA, DFC-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DFC, DFC-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC. Data are presented as mean ± SD (n=8).^# indicated the significant difference (p < 0.05) as compared with NOR.

圖 4-1 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝重/體重比值之影響

Fig. 4-1 The effects of DMA and DFC on the liver weight/body weight ratio of the ethanol-induced liver injury mice

NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, DMA-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DMA, DMA-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DMA, DFC-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DFC, DFC-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC. Data are presented as mean ± SD (n=8). *,**, *** indicated the significant difference (p < 0.05, p

< 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

NOR EtOH SL DMA-L DMA-H DFC-L DFC-H

0 1 2 3 4 5

***

* ** ***

% L iv er /B o d y we ig h t ra ti o

NOR EtOH SL DMA DMA DFC DFC -L -H -L -H

表 4-2 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標 AST、ALT 與 ALP 活性之影響

Table 4-2 The effects of DMA and DFC on serum AST, ALT and ALP activities in the ethanol-induced liver injury mice

groups AST (U/L) ALT (U/L) ALP (IU/L) NOR 42.6 ± 4.2 ^*** 16.9 ± 1.6 ^*** 65.8 ± 2.8 ^**

EtOH 56.5 ± 16.2 22.6 ± 5.8 76.4 ± 4.7 SL 41.0 ± 3.5 ^*** 17.5 ± 1.9 ^*** 73.0 ± 5.5 DMA-L 40.3 ± 3.6 ^*** 17.0 ± 2.0 ^*** 68.3 ± 3.7 ^* DMA-H 40.0 ± 3.0 ^*** 17.0 ± 1.9 ^*** 63.9 ± 4.9 ^***

DFC-L 39.4 ± 4.3 ^*** 15.6 ± 1.6 ^*** 68.1 ± 4.0 ^* DFC-H 42.9 ± 4.1 ^*** 17.3 ± 1.2 ^*** 63.8 ± 5.5 ^***

< 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

結果顯示於表 4-3。血清脂質測定結果發現 EtOH 誘導組之血清 TG 含量 明顯上升 (p < 0.001)，但 TC 方面則無差異。而 SL 正對照組則是顯著降低 TG 12.4% (p < 0.05)。低劑量 DMA、DFC 已具下降 TG 之趨勢，高劑量時則可達 顯著差異，分別能降低血清中 TC 12.8% 與 12.3% (p < 0.05)；降低 TG 達 13.2% (p < 0.01) 與 19.7% (p < 0.001)。肝臟部分，EtOH 組之肝臟 TC 為 3.81 mg/g，TG 為 4.95 mg/g，與正常組相比皆極顯著提升 (p < 0.001)。SL、DMA 與 DFC 組則呈現較 EtOH 組顯著較低 TC 和 TG 含量 (p < 0.001)。如上述數據 顯示 DMA 及 DFC 具有降低血清 TG 與肝臟中 TG 和 TC 含量，抑制酒精所提升之脂質含量，減少脂質於肝臟累積。

四、DMA 與 DFC 調節酒精性肝損傷小鼠之脂質過氧化程度

酒精造成之氧化壓力或促進肝臟脂質過氧化，而脂質過氧化是由於自由基大量產生所導致，因此利用低密度脂蛋白氧化後產物 MDA 為指標，並以 TBARS 方法測得此過氧化物，其數值可判定氧化之程度 (Rosmini et al., 1996)。

圖 4-2 結果證明，EtOH 誘導組之 MDA 濃度比正常組明顯高出 54%，正 對照組 SL 可使 MDA 降低至 90.72 μg/g (p < 0.001)。而低劑量之 DMA 及 DFC 也分別能使 MDA 濃度降低 55.6% 與 58.2% (p < 0.001)，顯示這兩個紅 麴抗氧化物質皆能有效降低酒精飲食所誘發之脂質過氧化作用。

五、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理變化之影響

C57BL/6J 雄性小鼠經餵食酒精液態飼料 6 周後，進一步將肝臟切片並進行 H&E 染色，評估肝臟受損情形。結果如圖 4-3 所示，NOR 組肝細胞結構完整並緊密排列，而經酒精誘導之 EtOH 組其肝細胞結構產生變化，並具有小泡型脂肪空泡 (microvesicula steatosis) 及肝細胞變性之情形，試驗組 DMA 與 DFC 於低劑量下雖依然有脂肪空泡，但已具有明顯改善效果。SL、DMA-H 與 DFC-H 切片結果則更趨近於 NOR 組型態，均未發現脂肪嚴重堆積於肝組織中，

表示 DMA 與 DFC 均能保護肝臟免於受到酒精傷害。

六、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酵素活性之影響

酒精會降低體內抗氧化酵素活性及抗氧化能力，促使過氧化物大量產生，而其代謝產物乙醛也會使抗氧化酵素含量降低，引起酒精性肝損傷 (Rouach et al.,

表 4-3 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中膽固醇及三酸甘油酯之影響

Table 4-3 The effects of DMA and DFC on serum and hepatic triglyceride and cholesterol content in the ethanol-induced liver injury mice

ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC. Data are presented as mean

± SD (n=8). *,**, *** indicated the significant difference (p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

groups

Serum Liver

TC (mg/dL) TG (mg/dL) TC (mg/g) TG (mg/g) NOR 65.0 ± 3.20 100.2 ± 11.55 ^*** 3.38 ± 0.05 ^*** 3.35 ± 0.49 ^***

EtOH 69.2 ± 9.91 126.5 ± 15.62 3.81 ± 0.13 4.95 ± 0.84 SL 63.7 ± 5.05 110.7 ± 7.80 ^* 3.47 ± 0.12 ^*** 3.06 ± 0.30 ^***

DMA-L 61.1 ± 5.09 ^* 111.4 ± 12.80 ^* 3.41 ± 0.12 ^*** 3.35 ± 0.42 ^***

DMA-H 60.3 ± 6.89 ^* 109.8 ± 4.40 ^** 3.45 ± 0.08 ^*** 2.65 ± 0.53 ^***

DFC-L 65.8 ± 6.46 111.7 ± 11.62 ^* 3.41 ± 0.09 ^*** 2.77 ± 0.30 ^***

DFC-H 60.6 ± 3.49 ^* 101.5 ± 10.91 ^*** 3.33 ± 0.10 ^*** 3.04 ± 0.65 ^***

圖 4-2 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠脂質過氧化之影響

Fig. 4-2 The effects of DMA and DFC on the liver lipid peroxidation of the ethanol-induced liver injury mice

NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, DMA-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DMA, DMA-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DMA, DFC-L: ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DFC, DFC-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC. Data are presented as mean ± SD (n=8).^***indicated the significant difference (p < 0.001) as compared with EtOH.

NOR EtOH SL DMA-L DMA-H DFC-L DFC-H

0 50 100 150 200 250 300

MDA content(μg/g liver tissue)

*** *** *** *** *** ***

NOR EtOH SL DMA DMA DFC DFC

-L -H -L -H

64 圖 4-3 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理變化之影響

Fig. 4-3 The effects of DMA and DFC on hepatic pathological changes of the ethanol-induced liver injury mice

NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, DMA-L:

ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DMA, DMA-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DMA, DFC-L:

ethanol induced liver injury mice fed 3 mg/kg/day of DFC, DFC-H: ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC.Yellow arrow and green arrow indicated the ethanol diet-induced macrovesicular steatosis and infiltration of leukocytes, respectively. Representative photomicrographs are shown. (×100X)

1997; Oh et al., 1998)。小鼠犧牲後取肝組織分析 CAT、SOD、GPx 和 GRd 以探討 DMA 與 DFC 對於酒精性肝損傷小鼠模式中之抗氧化作用。結果如表 4-4 所示，EtOH 組相較於 NOR 組其酵素活性因酒精之影響皆顯著下降，CAT 降 低 31.18% (p < 0.001)、SOD 降低 46.71% (p < 0.001)、GPx 降低 23.81% (p <

0.001)、GRd 則是達 13.81% (p < 0.001)。給予試驗物質則是能分別提高酵素活 性，DMA 能顯著提高 CAT (p < 0.001)，而 GRd 則於 DMA 高劑量時顯著提 升 (p < 0.05)，但 SOD 和 GPx 則有增加之趨勢但未與 EtOH 組達顯著差異 (p

> 0.05)。DFC-L 可提高 CAT 活性 (p < 0.05)，DFC-H 則對 SOD 和 GRd 具改 善效果，分別增加 1.33 倍 (p < 0.05) 和 1.15 倍 (p < 0.001)。

七、DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中發炎相關蛋白表現量之影響 已有研究明確指出酒精所造成之肝臟疾病會造成肝組織損傷，而其主因為巨噬細胞分泌之細胞激素如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等，這些細胞激素不僅啟動免疫反應，也參與發炎反應的過程 (Martinez et al., 1992)。此外，發炎路徑活化使得 NF-κB 進入核中活化轉錄因子，進一步釋放更多細胞激素例如 iNOS、COX-2 等，加速發炎反應進行 (Lawrence et al., 2001; Tsan and Gao, 2009)。

TNF-α 為導致發炎的主要因子之一，存在於多種細胞中 (McClain et al., 2004)，且目前也被認為與 ALD 之發展有關 (Kitazawa et al., 2003)。紅麴抗氧化物質 DMA 及 DFC 對肝臟中 TNF-α 蛋白表現之影響如圖 4-4 所示，EtOH 組因長期攝入酒精導致其發炎蛋白表現高於 NOR 組 6.5 倍 (p < 0.001)，正對 照組 SL 則能顯著降低 35.16% (p < 0.001)，而 DMA 低、高劑量分別使其下降 20.83% (p < 0.01) 與 28% (p < 0.001)，DFC 於低劑量時其降低幅度便與 SL 組 有相同效果 (p < 0.001)，高劑量更降低 69.97% (p < 0.001)，顯示 DMA 與 DFC 皆能抑制酒精造成 TNF-α 含量提升，達到抗發炎效果。

小鼠肝臟中之發炎因子 IL-1β 含量結果顯示於圖 4-4，EtOH 組表現量提高 2.35 倍 (p < 0.001)，而餵食試驗物質後，DMA-L 與 DFC-L 分別可降低 32.58%

(p < 0.001) 及 22.23% (p < 0.01)，表示試驗物質皆能保護肝臟不受酒精所造成之 發炎反應傷害，而其中又以抗氧化物 DMA-H 降低幅度為最大。

紅麴抗氧化物質 DMA 與 DFC 對肝組織中 IL-6 蛋白表現之影響如圖 4-4 所示，餵食酒精液態飼料之 EtOH 組，其發炎蛋白 IL-6 顯著提升 2.44 倍 (p < 0.001)，而同時給予 silymarin 之 SL 組可降低 23.92% (p < 0.001)，紅麴抗

表 4-4 DMA 與 DFC 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酵素活性之影響

Table 4-4 The effects of DMA and DFC on antioxidant enzyme activities in the liver of ethanol-induced liver injury mice

ethanol induced liver injury mice fed 15 mg/kg/day of DFC. Data are presented as mean

± SD (n=8). *,**, *** indicated the significant difference (p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

groups CAT activity (U/mg protein)

SOD activity (U/mg protein)

GPx activity (U/mg protein)

GRd activity (U/mg protein) NOR 0.57 ± 0.07 ^*** 4.70 ± 0.64 ^*** 776.08 ± 56.01 ^*** 64.91 ± 3.65 ^***

EtOH 0.39 ± 0.06 2.51 ± 0.22 591.25 ± 56.18 55.91 ± 5.32 SL 0.40 ± 0.04 3.11 ± 0.58 642.39 ± 58.63 61.08 ± 5.58 ^* DMA-L 0.49 ± 0.04 ^** 2.94 ± 0.36 618.74 ± 99.01 59.66 ± 3.08 DMA-H 0.52 ± 0.08 ^*** 2.80 ± 0.59 614.31 ± 74.67 61.51 ± 1.89 ^*

DFC-L 0.47 ± 0.08 ^* 2.92 ± 0.53 602.86 ± 49.58 52.52 ± 3.03 DFC-H 0.45 ± 0.08 3.32 ± 0.95 ^* 600.92 ± 75.33 64.10 ± 4.54 ^***

67 subsequently quantitated by densitometric analysis with that of control being 100 %.

Data are presented as mean ± SD. *,**, *** indicated the significant difference (p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

(A)

氧化成分 DMA 和 DFC 於低劑量時已經能夠減少 22.64% (p < 0.001) 及 20.64% (p < 0.001)。結果表明，DMA 與 DFC 具良好之降低肝臟中的發炎蛋白 IL-6 效用，且低劑量之降低幅度就已趨近於正對照組。

NF-κB 除了調控免疫及發炎反應之相關基因外 (Kumar et al., 2004)，也控制細胞激素、化學激素的釋放，並扮演著細胞週期及細胞凋亡的調控角色 (Friedman, 2003)。圖 4-4 為肝組織中 NF-κB 蛋白表現測定結果，酒精使其蛋 白提升 2.39 倍 (p < 0.001)，試驗物 DMA 及 DFC 於低劑量下即可顯著降低

在文檔中 monascin 與 ankaflavin 預防酒精性肝損傷之研究 (頁 70-90)

第四章 研究結果

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