紅麴菌黃色素 MS、AK 進行預防酒精性肝損傷之動物試驗

第四章研究結果

第二節紅麴菌黃色素 MS、AK 進行預防酒精性肝損傷之動物試驗

一、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠體重與肝重/體重比值之影響

本次試驗以 Lieber-DeCarli control diet 或 ethanol diet 餵食 C57BL/6J 雄性小鼠誘發酒精性肝損傷，並同時管餵 silymarin 200 mg/kg 為正控制組，MS (0.615 和 3.075 mg/kg) 及 AK (0.3075 和 1.5375 mg/kg) 為試驗組，試驗期共六週。表 4-5 為小鼠於試驗期間之體重變化，各組起始體重 (第零周) 皆約 22 g，

並無顯著差異，而於第二周時 EtOH 誘導組已顯著低於正常組 (p < 0.05)。試驗 期間各組體重隨飼養週齡逐漸增加，於犧牲前正常組增加 12.7%、EtOH 誘導組增加 3.9%、SL 正控制組增加 8%、MS 低高劑量分別增加 5.8% 及 6.8%、AK 低高劑量則增加 7.4% 與增加 8.8%。肝重與體重比值結果如圖 4-11，正常組 (3.33%)、MS (3.71、3.75%) 與 AK (3.68-3.57%) 試驗組皆使肝重/體重比值顯著 低於 EtOH 組 (4.14%) (p < 0.001)。此結果顯示，紅麴黃色素 MS 與 AK 可改 善酒精所引起之體重減輕以及肝臟重量增加的情形。

二、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠血清中肝功能指標 AST、ALT 與 ALP 含 量之變化

小鼠試驗六周犧牲後，測定血清中 AST、ALT 與 ALP，探討酒精及試驗物質對肝功能指標之影響。從表 4-6 中得知，酒精會導致血清中這三項肝功能 指標顯著上升 (p < 0.05)，造成肝臟功能損傷。SL 正對照組雖能有效降低 AST 和 ALT 活性 (p < 0.05)，但對肝膽功能指標 ALP 並無顯著差異 (p> 0.05)；而 MS-L 組所呈現之效果趨勢與 SL 組相同，但 MS-H 之效果則是提升至能有效 減低三項指標數值 (p < 0.05)，且趨近於正常組。另一試驗物紅麴黃色素 AK，

於低劑量時已分別使 AST、ALT 與 ALP 下降 17.4%、23% 以及 10.4% (p <

0.01)，而於高劑量時，AK 能更加顯著降低 AST (p < 0.001)。根據上述結果，

表 4-5 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠體重之影響

Table 4-5 The effects of MS and AK on the body weight gain of the ethanol-induced liver injury mice

groups

body weight (g)

0th week 2nd week 4th week 6th week NOR 21.9 ± 0.83 23.3 ± 0.71 23.8 ± 0.89 25.1 ± 1.13 EtOH 21.9 ± 1.25 22.0 ± 0.93 ^# 22.5 ± 1.20 ^# 22.8 ± 1.28 ^#

SL 21.9 ± 0.83 22.9 ± 1.36 23.9 ± 1.25 23.8 ± 1.16 MS-L 21.8 ± 0.71 23.5 ± 1.31 24.0 ± 0.76 23.1 ± 1.36 MS-H 21.8 ± 0.89 23.5 ± 1.20 23.9 ± 0.99 23.4 ± 1.41 AK-L 21.9 ± 0.83 22.5 ± 0.76 23.8 ± 0.71 23.6 ± 1.06 AK-H 21.9 ± 0.83 22.8 ± 1.28 24.0 ± 1.85 24.0 ± 1.41 NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, MS-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.615 mg/kg/day of MS, MS-H: ethanol induced liver injury mice fed 3.075 mg/kg/day of MS, AK-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.3075 mg/kg/day of AK, AK-H: ethanol induced liver injury mice fed 1.5375 mg/kg/day of AK. Data are presented as mean ± SD (n=8).^# indicated the significant difference (p <0.05) as compared with NOR.

圖 4-11 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝重/體重比值之影響

Fig. 4-11 The effects of MS and AK on the liver weight/body weight ratio of the ethanol-induced liver injury mice

NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, MS-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.615 mg/kg/day of MS, MS-H: ethanol induced liver injury mice fed 3.075 mg/kg/day of MS, AK-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.3075 mg/kg/day of AK, AK-H: ethanol induced liver injury mice fed 1.5375 mg/kg/day of AK. Data are presented as mean ± SD (n=8).^***indicated the significant difference (p <0.001) as compared with EtOH.

NOR EtOH SL MS-L MS-H AK-L AK-H

0 1 2 3 4 5

***

*** ***

NOR EtOH SL MS MS AK AK -L -H -L -H

% L iv er /Bo d y w ei g h t ra ti o

表 4-6 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標 AST、ALT 與 ALP 活性之影響

Table 4-6 The effects of MS and AK on serum AST, ALT and ALP activities in the ethanol-induced liver injury mice

groups AST (U/L) ALT (U/L) ALP (IU/L) NOR 44.9 ± 4.9 ^* 17.3 ± 2.5 ^** 67.0 ± 3.1 ^**

EtOH 51.0 ± 9.8 22.1 ± 6.2 76.0 ± 5.5 SL 43.0 ± 4.7 ^** 18.5 ± 2.4 ^* 73.3 ± 5.9 MS-L 41.6 ± 3.7 ^** 16.8 ± 2.7 ^** 70.6 ± 4.1 MS-H 39.5 ± 3.4 ^*** 16.3 ± 1.9 ^** 68.6 ± 6.1 ^* AK-L 42.1 ± 4.3 ^** 17.0 ± 2.8 ^** 68.1 ± 4.3 ^**

AK-H 38.9 ± 3.2 ^*** 16.8 ± 0.5 ^** 69.5 ± 6.7 ^* NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, MS-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.615 mg/kg/day of MS, MS-H: ethanol induced liver injury mice fed 3.075 mg/kg/day of MS, AK-L: ethanol induced liver injury mice fed 0.3075 mg/kg/day of AK, AK-H: ethanol induced liver injury mice fed 1.5375 mg/kg/day of AK. Data are presented as mean ± SD (n=8). *,**, ***

indicated the significant difference (p <0.05, p

<0.01 and p <0.001, respectively) as compared with EtOH.

MS、AK 於低劑量下即具有降低肝功能指標之能力，減緩酒精誘發之肝損傷。

三、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中脂質之影響

本試驗藉由測定血清與肝臟中之 TC 和 TG 含量以探討酒精飲食是否造成脂質堆積於肝臟，並形成脂肪肝。結果如表 4-7，EtOH 組之血清 TC 雖有提 高趨勢，但未與正常組達顯著差異 (p> 0.05)。但 EtOH 組之 TG 含量則是顯著 提高 16.72% (p < 0.01)。而給予 silymarin 之正對照組其血清中 TG 明顯下降 (p

< 0.05)，但對 TC 濃度則只有降低趨勢。經餵食 MS 與 AK 之組別，高低劑 量組皆能降低血清 TC 與 TG 濃度 (p < 0.05)

EtOH 使肝臟中 TC、TG 含量明顯提高 9.55% (p < 0.001) 及 36.21% (p <

0.001)，SL 正對照組、MS 與 AK 試驗組，皆能夠預防酒精造成 TC、TG 累 積於肝臟中 (p < 0.001)，其中又以 AK 效果尤佳。根據實驗結果得知，本實驗 之試驗物質具降低 TC 及 TG 含量，能抑制酒精所誘導的脂質合成，並減低脂質在肝臟累積。

四、MS 與 AK 調節酒精性肝損傷小鼠之脂質過氧化程度

從圖 4-12 分析結果發現，酒精所誘導之 EtOH 組其 MDA 濃度高於正常 組 51% (p < 0.001)，顯示酒精會導致肝臟嚴重脂質過氧化。SL 正控制組及實驗 組 MS-L、MS-H、AK-L 和 AK-H 組能分別較 EtOH 組顯著降低 58.32% (p <

0.001)、61.43% (p < 0.001)、61.49% (p < 0.001)、74.26% (p < 0.001) 與 78.74% (p

< 0.001)，且趨近於正常組。MS 與 AK 於低劑量時即對於改善酒精所引起之肝 臟脂質過氧化具有非常顯著之效果。

五、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理變化之影響

動物犧牲後取肝組織切片進行 H&E 染色，觀察肝臟病理變化。如圖 4-13 所示，從切片圖中可發現 NOR 組織肝細胞內部結構清晰、均勻散佈、排列完整，並無任何空泡或細胞浸潤之情形。EtOH 組之切片則是肝細胞內充滿著氣球樣變性 (ballooning degeneration)，並呈不規則排列，血管周圍也有因發炎而產生細胞浸潤之現象。SL、MS-L、MS-H、AK-L 和 AK-H 組別其結果皆趨近於 NOR 組型態，均未有脂肪嚴重堆積之情形，顯示 MS 與 AK 可避免酒精性脂肪肝及肝損傷的發生。

表 4-7 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠血清與肝臟中膽固醇及三酸甘油酯之影響 Table 4-7 The effects of MS and AK on serum or hepatic triglyceride and cholesterol content in the ethanol-induced liver injury mice

indicated the significant difference (p <0.05, p

<0.01 and p <0.001, respectively) as compared with EtOH.

groups

Serum Liver

TC (mg/dL) TG (mg/dL) TC (mg/g) TG (mg/g) NOR 65.62 ± 4.73 99.61 ± 10.39 ^** 3.41 ± 0.05 ^*** 3.10 ± 0.56 ^***

EtOH 68.82 ± 10.40 119.61 ± 14.32 3.77 ± 0.16 4.86 ± 0.84 SL 63.74 ± 5.11 110.33 ± 8.78 ^* 3.43 ± 0.14 ^*** 3.01 ± 0.39 ^***

MS-L 58.35 ± 7.39 ^* 94.85 ± 10.50 ^** 3.43 ± 0.11 ^*** 2.95 ± 0.38 ^***

MS-H 60.72 ± 7.09 ^* 88.45 ± 4.89 ^*** 3.19 ± 0.08 ^*** 2.52 ± 0.21 ^***

AK-L 59.32 ± 4.45 ^* 106.48 ± 8.48 ^* 3.22 ± 0.15 ^*** 2.85 ± 0.53 ^***

AK-H 60.49 ± 5.72 ^* 96.88 ± 9.56 ^** 3.10 ± 0.09 ^*** 2.44 ± 0.18 ^***

圖 4-12 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠脂質過氧化之影響

Fig. 4-12 The effects of MS and AK on the liver lipid peroxidation of the ethanol-induced liver injury mice

NOR EtOH SL MS-L MS-H AK-L AK-H

0 50 100 150 200 250

*** ***

***

M D A c o n te n t (μ g /g liv er tis su e)

NOR EtOH SL MS MS AK AK

-L -H -L -H

84 圖 4-13 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟病理變化之影響

Fig. 4-13 The effects of MS and AK on hepatic pathological changes of the ethanol induced liver injury mice

NOR: normal group, EtOH: ethanol induced liver injury mice SL: ethanol induced liver injury mice fed 200 mg/kg/day of silymarin, MS-L:

ethanol induced liver injury mice fed 0.615 mg/kg/day of MS, MS-H: ethanol induced liver injury mice fed 3.075 mg/kg/day of MS, AK-L:

ethanol induced liver injury mice fed 0.3075 mg/kg/day of AK, AK-H: ethanol induced liver injury mice fed 1.5375 mg/kg/day of AK. Yellow arrow and green arrow indicated the ethanol diet-induced ballooning degeneration and infiltration of leukocytes, respectively. Representative photomicrographs are shown. (×100X)

六、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酵素活性之影響

文獻指出酒精會影響體內一些抗氧化酵素活性 (Balasubramaniyan et al., 2003)，引起代謝相關之疾病，並誘發為酒精性肝臟疾病 (Altamirano and Bataller, 2011; Quertemont, 2004)。實驗分析肝臟中之 CAT、SOD、GPx 和 GRd，探討 MS 和 AK 之抗氧化作用。表 4-8 為小鼠肝臟酵素分析結果，EtOH 組因受酒精影響，導致酵素皆被大量抑制，CAT 降低 22.37%，SOD 降低 41.45%，GPx 降 低 24.18%，GRd 為降低 15.89%，與 NOR 組皆達極顯著差異 (p < 0.001)。而 MS-L 組之 CAT (p < 0.001) 和 GRd (p < 0.05) 已有顯著回升之現象，而 SOD (p < 0.01) 和 GRd (p < 0.05) 則於高劑量下才與 EtOH 組達顯著差異。低劑量 之 AK 具增加 CAT (p < 0.001)、SOD (p < 0.01) 和 GRd (p < 0.01) 之能力，

GRd 則於高劑量時有明顯提升作用 (p < 0.05)。以上結果證實 MS 與 AK 可有 效提升被酒精所影響之酵素活性，具良好之抗氧化效果。

七、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中發炎相關蛋白表現量之影響

發炎相關蛋白表現取肝臟組織均質液以 western blot 分析後進行定量，探討紅麴之 MS 和 AK 是否可透過調控發炎蛋白 TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、iNOS 以及 COX-2 達到抗發炎之效果。

TNF-α、IL-1β、IL-6 和 NF-κB 蛋白結果如圖 4-14 所示，酒精作用後會使 上述四種蛋白大幅增加，相較於正常組 NOR 酒精使其提升 5.79 倍 (p < 0.001)、

4.08 倍 (p < 0.001)、2.91 倍 (p < 0.001) 及 2.06 倍 (p < 0.001)。低劑量之 MS 與 AK 可分別降低 45.32% (p < 0.01)、54.02% (p < 0.001) 之 TNF-α；IL-1β 分 別減少 31.04% (p < 0.001) 與 36.38% (p < 0.001)；IL-6 結果為 32.83% (p <0.001) 和 35.57% (p < 0.001)；NF-κB 則是 15.99% (p < 0.01) 及 22.6% (p < 0.001)。

上述結果表明餵食 MS 和 AK 後，皆有明顯抑制發炎因子之現象，並呈現劑量關係。

圖 4-15 為 iNOS 與 COX-2 蛋白表現結果，EtOH 組之肝臟 iNOS 含量 明顯提升至 235.19% (p < 0.001)，MS-L 與 AK-L 則可有效降低 23.74% (p <

0.05) 和 28.04% (p < 0.01)，並於高劑量下達到極顯著差異 (p < 0.001)。酒精除 了會提高 iNOS 外，也會大幅提升 COX-2 含量 (p < 0.001)，給予 MS-L 後減 少 21.04% (p < 0.01)，而 AK-L 之結果則更加顯著，減少 39.55% (p < 0.001)。

酒精使肝臟中發炎相關蛋白含量大幅提升，而紅麴之 MS 和 AK 於低劑量時已

表 4-8 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酵素活性之影響

Table 4-8 The effects of MS and AK on antioxidant enzyme activities in the liver of ethanol-induced liver injury mice

groups CAT activity (U/mg protein)

SOD activity (U/mg protein)

GPx activity (U/mg protein)

GRd activity (U/mg protein) NOR 0.54 ± 0.06 ^*** 4.43 ± 0.65 ^*** 807.02 ± 60.02 ^*** 68.67 ± 6.02 ^***

EtOH 0.42 ± 0.07 2.59 ± 0.23 611.87 ± 53.06 57.76 ± 3.84 SL 0.43 ± 0.08 3.55 ± 0.52 ^** 666.49 ± 52.95 65.11 ± 4.25 ^**

MS-L 0.62 ± 0.03 ^*** 3.12 ± 0.35 604.53 ± 64.00 63.31 ± 5.92 ^* MS-H 0.56 ± 0.06 ^*** 3.60 ± 0.61 ^** 678.79 ± 52.78 ^* 71.39 ± 4.82 ^***

AK-L 0.54 ± 0.04 ^*** 3.36 ± 0.63 ^** 653.51 ± 37.76 66.05 ± 7.38 ^**

AK-H 0.58 ± 0.07 ^*** 3.82 ± 0.68 ^*** 685.66 ± 71.14 ^* 73.18 ± 3.35 ^***

ethanol induced liver injury mice fed 0.3075 mg/kg/day of AK, AK-H: ethanol induced liver injury mice fed 1.5375 mg/kg/day of AK. Data are presented as mean ± SD (n=8). *,**, ***

indicated the significant difference (p <0.05, p <0.01 and p <0.001, respectively) as compared with EtOH.

87 subsequently quantitated by densitometric analysis with that of control being 100 %.

Data are presented as mean ± SD. *,**, ***

indicated the significant difference (p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

(A)

圖 4-15 MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝組織 iNOS 和 COX-2 之影響 Fig. 4-15 The effects of MS and AK on hepatic iNOS and COX-2 expressions of the ethanol-induced liver injury mice. (A) iNOS and COX-2 were detected by western blot analysis. (B) The levels of the proteins were subsequently quantitated by densitometric analysis with that of control being 100 %. Data are presented as mean ± SD. *,**, ***

indicated the significant difference (p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.001, respectively) as compared with EtOH.

iNOSproteinexpression (%)

具良好改善效果，且於高劑量下效果更優於 SL 組，可預防酒精所造成之發炎反應。

酒精增加腸道通透性後便啟動 ERK1/2 與 p38 磷酸化，產生發炎反應，因此本研究分析紅麴之 MS 和 AK 是否具調控 ERK1/2 以及 p38，達到抗發炎作用。圖 4-16 為 ERK1/2 表現量結果，從圖中可得知酒精與試驗物質並非直接調控 ERK1/2 總量，而是透過抑制其進行磷酸化，預防下游發炎因子產生。

EtOH 組之 pERK1/2 含量為 NOR 組 4.18 倍 (p < 0.001)，MS-L 與 AK-L 分 別下降 17.28% (p < 0.05) 和 37.57% (p < 0.001)，低劑量之 AK 降低程度與 MS-H 相同。而 p38 結果顯示於圖 4-17，長期攝入酒精會造成 p-p38 表現量顯著提升 5.99 倍，而同時餵食試驗物質之組別 MS-L 與 AK-L 組可明顯降低 21.66% (p < 0.01) 及 48.13% (p < 0.001)，預防酒精透過 p38 造成發炎反應。

八、MS 與 AK 對酒精性肝損傷小鼠肝臟中抗氧化發炎相關蛋白表現量之影響 當肝臟出現發炎反應時，具抗發炎作用之 PPAR-γ 便會發揮作用，減緩發炎反應所造成之損傷。其結果如圖 4-18 所示，酒精會使小鼠肝臟中抗發炎蛋白 下降 54.95% (p < 0.001)，而 SL 組、MS-L 組和 AK-L 組與 EtOH 組相比可分

在文檔中 monascin 與 ankaflavin 預防酒精性肝損傷之研究 (頁 90-109)

第四章 研究結果

第二節 紅麴菌黃色素 MS、AK 進行預防酒精性肝損傷之動物試驗