當雙股 RNA（dsRNA）超過 30 個鹼基對時，會啟動非專一性干擾系統
（ interferon system, IFN），IFN 在體內扮演著對抗病毒感染的角色，藉此 抑制胞內轉譯作用。當 dsRNA 與雙股 RNA 結合蛋白（dsRNA binding protein）結合，會誘導 IFN 系統啟動，使蛋白激酶 R（protein kinase R）磷
酸化真核啟始因子2α（eukaryoticinitiation factor2α,eIF2α），eIF2α便失去 活性，以此非特異性的抑制蛋白質合成，導致細胞死亡（Matsumoto et al., 2005）。經過持續的研究改良，最近已發展出短片段的 RNA，除可以以避開 上述 IFN 的機制外，仍然具有抑制基因表現的特性。這種短片段 RNA 又稱 小干擾 RNA，其結構是小的雙股 RNA，長度大約 21-25 個核醣核酸，兩股 的3’端具有 2-3 個鹼基的突出（overhang）。Caplen et al.（2001）指出，siRNA 能抑制不同物種特定基因表現，如：無脊椎動物的 elegans 和脊椎動物的人 類及小鼠。除此之外，已經成功用於植物、果蠅及線蟲等物種（Bantounas et al., 2004），在哺乳動物卵母細胞方面，Lisa（2005）報告指出，其將 Gpr3
siRNA 顯微注射打入小鼠未成熟卵母細胞中，成功抑制 Gpr3 基因的表現。
可見 siRNA 能廣泛用於各物種。
siRNA 與其餘四種干擾 RNA 比較，發現 siRNA、antisense RNA 與 long-dsRNA 屬短暫抑制基因表現的系統，antisense RNA 是單股 RNA 容易 被分解，antisnse RNA 與 long-dsRNA 鹼基對的數量超過 30 bp，有造成非 特異性抑制的風險，而 siRNA 鹼基對小於 30 bp，可避開 IFN 系統所引發的 問題。miRNA 基因默化機制與 siRNA 不同，miRNA 抑制基因的轉譯作用，
而不是將 mRNA 降解，因此無法使用 RT-PCR 檢測出 miRNA 抑制基因表 現的效率，且 miRNA 不像 siRNA 可以自行設計，必須從該物種之基因組 DNA 搜尋而來。以 siRNA 與 shRNA 比較，shRNA 經過 Dicer 修飾後與 siRNA
極為相似，shRNA 的表現由核內的轉殖基因進行轉錄作用，要有較長的反 應時間，適用於需要長期或永久抑制基因變現的試驗，然而 siRNA 由體外 合成，直接送入細胞質中，因此可以馬上產生抑制的效果，適合用於短期，
且需要快速達到抑制效果的試驗。siRNA 迅速而有效率的抑制基因，適合 用於研究卵或胚生長過程中，細胞內分子間訊息傳導的變化。以豬卵母細 胞為例，從 GV 期到成熟的 MII 期只需兩天的時間，在這段期間內若要抑 制某分子基因的表現，並觀察其對於卵母細胞造成的影響，則需要迅速而 有效率的工具，siRNA 是最好的選擇。雖然將 siRNA 技術用於研究豬卵母 細胞成熟、受精與發育的研究目前尚無人發表，但是在其他的物種上，包 括多種哺乳動物已證實是可行的，因此建立 siRNA 技術運用於研究豬卵母 細胞的研究平台勢在必行，這也將是未來研究的趨勢。
参、材料與方法 一、 siRNA 的設計與製備
豬 c-mos 基 因 序 列 由 美 國 國 家 衛 生 研 究 院 NCBI 網 站
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜尋而來， 其序號為X78318，序列總長為 2052 bp，其mRNA序列由226到1900，長度約1674 bp，其間沒有內顯子 (intron) 。 將 其 序 列 置 於 Ambion 網 站 (http://www.ambion.com/techlib /misc/siRNA_finder.html/)搜尋c-mos siRNA的鵠的序列（target sequence），得 到4組鵠的序列為:
5’-AAGTGTCTCAAGTATTCCCTG-3’、 5’-AAGAAACTGGAGGACATCATC-3’、 5’-AAGCATTTGTCTTTGTTGCTG-3’、 5’-AAATCTAGTGGTGTCTCTCCT-3’
，分別位於第930 bp、1326 bp、1457bp、1621 bp。之後分別設計siRNA模板
（ template ）， 有 反 義 股 模 版 和 意 義 股 模 板 兩 組 ， 長 度 為 29 個 寡 核 苷 酸
（ologonucleotide），其5’端有八個寡核苷酸的領導序列（leader sequence），
為5’-CCTGTCTC-3’，後面分別接著意義股與反義股的鵠的序列。siRNA合成 與純化採用siRNA構築商業套組（Silencer siRNA construction kit, Ambion, U.S.A.），前述領導序列的功能在於與T7啟動子引子（T7 promoter primer）結 合, 之後添加Klenow DNA 聚合酶，使模板變為雙股DNA，再加入T7 RNA
聚合酶，結合T7啟動子順利在體外（in vitro）進行轉錄作用，合成意義股與
把反義股及意義股siRNA模板的濃度調整至100 μM。之後將T7 promoter primer與siRNA模板進行雜交，此時分成兩管，每管分別加入2μlT7 promoter primer、6μlDNA hybridizebuffer及2 μl 反義股或意義股siRNA模板於200μl PCR tube中混勻，使用聚合酶連鎖反應器將混合物加熱至70℃維持5分鐘，再 降至室溫等待5分鐘。5分鐘後，兩管分別加入 2 μl 10× klenow reaction buffer、2 μl 10× dNTP mix、4 μl nuclease-free water及2 μl klnow DNA polymerase並混勻，置於37℃培養箱（2720 thermal cycler, Applied Biosystems, Singapore ）中培養30分鐘，雙股的DNA模板便製備完成。
（二）雙股RNA的合成
將4 μl去核酸酶水、10 μl2×NTP mix、2 μl10× T7 reaction buffer、2 μlT7 enzyme mix、反義股或意義股的雙股DNA模板分別加入兩管PCR tube中混 勻，於37℃培養箱中培養兩個小時，之後將兩管混合成一管，於37℃培養 箱中隔夜培養。
圖6. siRNA構築流程。（siRNA construction kit protocol）
Fig. 6. siRNA construction procedures.
（三）siRNA的純化
取6 μldigestion buffer、48.5 μl去核酸酶水、3 μlRNase及4 μlDNase加 到雙股RNA的混合液體中，混合均勻後置於37℃培養箱中培養2小時。將混 合液置入1.5 ml 離心管中並加入400 μlsiRNA binding buffer，室溫培養5分 鐘，此時先將去核酸酶水75℃預熱。將過濾匣（filter cartridge）放入2 ml 離心管中，把100 μlsiRNA wash buffer與siRNA混合液加到過濾匣中，10000 rpm離心1分鐘，去除過濾液，加入500 μlsiRNA wash buffer，同樣的離心 10000 rpm 一分鐘，之後再重複上述步驟一次。將過濾液丟棄，換上新的2 ml 離心管，加入100 μl先前75℃預熱的去核酸水，室溫等待兩分鐘後12000 rpm 離心兩分鐘，離心下來液體即為siRNA。之後進行4％agarose gel/ 0.5× TBE 電泳分離確認，並用核酸分光光度計（Biotech Photometer UV-1101, WPA, U.K.）測定RNA濃度。
二、 豬卵母細胞體外成熟、受精與發育的培養
（一）體外成熟
於屠宰場取得雌性肉豬的卵巢，置於含有50 μg/ml Penicillin G與60 μ g/ml Streptomycin的生理鹽水（附錄1）中，一小時內帶回。於室溫下卵巢 浸漬於D-PBS（Dulbecco’sphosphatebuffered saline）操作液中（附錄2），於 解剖顯微鏡（SZ-3060, Olympus, Japan）下操作，將血水擠出，選擇卵巢上 3~5 mm的濾泡，使用解剖刀片逐一將其刺破，並使用刀背將卵丘卵母細胞
複合體（cumulus-oocyte complexes, COCs）擠出，於解剖顯微鏡下選取含有 緻密細胞質，且卵丘緊密包覆於卵的COCs，收集於D-PBS中。將COCs用含 有5 IU/ml排卵素（luteinizing hormone, LH）、2.5 μg/ml激濾泡素（follicle stimulating hormone FSH）、20 ng/ml表皮生長因子（epithelium growth factor, EGF）、非必須胺基酸（non-essential amino acid）、10％豬濾泡液（porcine follicular fluid, PFF）、100 μg/mlcystein之NCSU-23成熟培養液清洗三次（附 錄3），並置於NCSU-23成熟培養液，於二氧化碳培養箱39℃ 、5 ％CO2下 培養44小時。
（二）體外受精
取5ml靜置16小時以上的稀釋精液加入5 ml精子洗滌液（附錄4）於15 ml 離心管中，小心混勻，離心3分鐘（500 rpm）。從混勻精液中取5 ml上層液 加入5 ml精子洗滌液，混勻後離心3分鐘（2000 rpm）。之後將所有上層液丟 棄，留下沉澱物於離心管中，加入10 ml精子洗滌液，與沉澱物混勻後離心3 分鐘（2000 rpm）。移除上層液，加入2 ml豬精子體外獲能培養液（附錄5），
將沉澱物混勻後於位相差顯微鏡（BX-50, Olympus, Japan）下計算精子濃 度，並將濃度調整至2×108cell/ml，置於37℃二氧化碳培養箱中等待受精。
受精前將已成熟卵母細胞的卵丘去除，放置於含有1900 μl豬精子體外受精 培養液（附錄6）之培養皿中，並同時取2×108cell/ml的精液100 μl，加入900 μl的受精培養液，將其稀釋成2×107 cell/ml。最後取 100 μl2×107 cell/ml獲
能精液，將其放入含有成熟卵母細胞之受精培養液中，精子最終濃度為2×106
Paradis et al. (2005)發現在卵母細胞注射前，經由cycloheximide的藥物 處理，會增加牛卵母細胞的存活率，降低注射對於卵母細胞所造成的傷害，
但是在豬這個物種上，沒有相關的研究。本試驗在注射前，卵母細胞先培 養在添加cycloheximide的培養液中8小時，研究其對豬卵母細胞的影響。使 用微電腦可程式拉針器（Tlaming/Brown Micropipetter Puller Model P-97, Sutter Instrument CO., U.S.A.）與斷燒器（Micro Forge MF-900, Narishige, Japan）將顯微注射holding pipette製作成外徑約130 μm，內徑約20 μm；
injection pipette尖端小於0.1 μm。於倒立顯微鏡顯微操作系統（IX 71, Olympus, Japan）下進行穿刺的動作，穿刺後於39℃、5 ％ CO2的培養箱中 成熟培養44小時，進行形態學觀察。試驗分成六組，如圖七所示，分別是 未添加cycloheximide且未穿刺的對照組（N）、添加1 μg/mlcycloheximide且
未穿刺的實驗組（1C）、添加10 μg/ml cycloheximide且未穿刺的實驗組
（ 10C ）、 未 添 加 cycloheximide 且 穿 刺 的 對 照 組 （ I ）、 添 加 1 μg/ml cycloheximide且穿刺的實驗組（1CI）及添加10 μg/mlcycloheximide八小時 後穿刺的實驗組（10CI）。
四、 c-mos siRNA 顯微注射
Mehlmann et al. (2002)報告指出，若鼠卵內的siRNA濃度為50 nM，對 抑制基因表現有最好的效果。因此本試驗將siRNA於豬卵母細胞內的濃度設 為50 nM，豬卵母細胞半徑約為75 μm，估算其體積約為1324 pl，而本試驗 將顯微注射量設為10 pl，兩者相差132倍，經過計算siRNA注射的濃度約為 6.6 μM。未成熟卵丘卵母細胞複合體經由1 μg/mlcycloheximide處理8小時之 後，進行顯微注射siRNA打到卵母細胞細胞質中的顯微注射，製作顯微注射 的holding pipette與injection pipette（方式如前所述），首先將4組si RNA混合 在一起，經由TL-HEPES（附錄8）稀釋，每組siRNA濃度調整至6.6 μM。卵
圖 7. 被穿刺卵母細胞存活率提升試驗設計圖。
Fig. 7. The design chart of survival rate increased in puncture oocyte.
五、 精子顯微注射 拉針器與斷燒器將顯微注射 holding pipette 製作成外徑約 130 μm，內徑約 20 μm，injection pipette 內徑約 8 μm。設定完成後便進行注射的動作，將精 液與 PVP 注射液（附錄 9）混合，最終精子濃度為 1×105cell/ml， 以 injection pipette 吸取精子，使用壓電脈衝顯微操作儀（piezo micro meter PMAS-CT150, Prime Tech, Japan）將精子注射入成熟卵母細胞的細胞質。注射完成後，將 已注射的卵母細胞置於胚培養液中培養 16 小時。
六、 卵母細胞的形態學觀察
觀察卵母細胞形態學變化使用兩種染劑，分別是 Hoechst 33258 與 Lacmoid。
（一）Hoechst 33258 螢光染色
Hoechst 33258（Sigma b-2883）激發波長為 365 nm，放射波長為 465 00 μg/ml（溶於 PBS），Hoechst 33258 能將染
色質或染色體染色，可判斷卵母細胞的發育情形。進行卵母細胞染色前，
先將10 μl濃縮液加到 990 μlPBS中，於 39 ℃ 二氧化碳培養箱下回溫，回 溫後將其滴在培養皿上，每滴50 μl，並蓋上礦物油。將欲染色的卵母細胞 取出，於解剖顯微鏡下操作，將其置於 50 μlHoechst 33258 培養液，一滴 放十顆卵母細胞，並於 39 ℃ 5 ％ CO2 二氧化碳培養箱內培養 15 分鐘， 滅菌水，蓋上錶玻璃，用加熱攪拌器（Stirrer/Hot Plat, Corning, U.S.A.）加 熱，煮沸 30 分鐘後，等待冷卻，用濾紙過濾，最後置於棕色瓶內保存，即
七、 RNA 萃取
（一）藥品配製 1. Denature solution
將 250 g Guanidine thiocyanate 溶於 293 ml DEPC（diethylpyrocarbonate）
水中，加入 17.6 ml 之 0.75 M Sodium citrate(pH7.0)、26.4 ml 10%sarcosyl，
水中，加入 17.6 ml 之 0.75 M Sodium citrate(pH7.0)、26.4 ml 10%sarcosyl，