（一） 濾泡環境中的訊息分子對卵母細胞成熟、受精與發育的調控
卵巢中濾泡的生長發育對於卵母細胞的成熟是很重要的，原始尚未發 育的濾泡被稱之為始基濾泡，（primordial follicle），當濾泡開始生長之初，
形成初級或腔前濾泡（primary or preantral follicle）；之後，粒性細胞會增殖，
並分泌濾泡液，此時形成腔室，又稱次級或有腔濾泡（secondary or antral follicle）；之後便逐漸生長為排卵前濾泡（preovulatory follicle）。濾泡環境 內影響卵母細胞成熟的因子很多，其中重要的因子有激濾泡素（follicle stimulation hormone, FSH）、排卵素（luteinizing hormone, LH）、動情素
（estrogens）及助孕固酮（progesterone）等。FSH 由腦垂腺前葉所分泌，
的增生。助孕固酮主要由 LH 刺激濾泡膜細胞與粒性細胞而分泌，可影響卵 母細胞 GVBD 的發生與 MⅡ的停頓，除此之外，於懷孕期間幫助子宮的維 持（馬與楊, 1999）。
（二）卵母細胞內訊息分子對成熟與受精的調控 1. 細胞內訊息分子對卵母細胞成熟的調控
爪蟾蜍卵母細胞的成熟主要受到助孕固酮（progesterone）控制，助孕 固酮影響母源性的 mRNA 表現，此後分為兩條路徑如圖 2 所示，茲分述如 下：
（1）母源性 mRNA 表現 c-Mos 蛋白，此時 c-Mos 蛋白處於不穩定狀態，
被熱緊迫蛋白 90（heat shock protein 90, Hsp90）磷酸化之後才具有活性
（Schmitt and Nebreda, 2002）。有活性的 c-Mos 蛋白活化 Mitogen 活化蛋白 因子（Mitogen-activated protein factor, MAPK），造成 MAPK 磷酸化發生，
產生 90 KDa 核糖體 S6 蛋白激酶（90 KDa ribosome S6 protein Kinase, p90rsk），p90rsk 會抑制梅林轉錄因子 1（Myalin transcription facter 1, Myt1）
的產生。缺乏 Myt1 就無法有效抑制 preMPF 轉變為 MPF，因此卵母細胞可 以產生具有活性的 MPF。至於 c-Mos 會不會直接影響 pre MPF 轉變為 MPF，
目前尚無直接證據可以證明。
圖 2. 非洲爪蟾蜍卵母細胞成熟期間訊息分子之間的關係。（Castro et al., 2001）
Fig. 2. The interaction of signal molecules in maturing xenopus oocyte.
（2）母源性 mRNA 表現 Ringo/Speedy，配合細胞分裂蛋白激酶 2（cell
division protein kinase 2, Cdk2）及 Cdc2 的輔助，活化 MAPK，之後進入一 系列的反應，產生有功能的 MPF。卵母細胞內有足夠具有活性的 MPF，可 以刺激卵母細胞恢復減數分裂，發生 GVBD，最後停頓在第二次減數分裂 中期，完成卵母細胞核的成熟作用。
2. 細胞內訊息分子對卵母細胞受精的調控
如圖3所示，卵母細胞被受精之後，細胞內鈣離子濃度上升，導致 Ca2+-calmodulin kinase II（Ca2+MK II）被活化，藉此抑制MAPK的活性，使 APC（anaphase-promoting complex）無法被抑制，造成MPF被分解，MPF 一旦被分解，c-Mos除了不能進行磷酸化之外，已磷酸化的c-Mos將被去磷 酸化，最後所有的c-Mos都會被分解，MAPK也無法活化（Castro et al., 2001）。這一連串的過程將導致細胞週期的啟動，卵母細胞突破第二次減
Masui and Markert（1971）從Rana pipiens的蛙卵萃取出有活性的
圖 3. 非洲爪蟾蜍卵母細胞受精期間訊息分子之間的關係。（Castro et al., 2001）
Fig. 3. The interaction of single molecules in fertilizing xenopus oocyte.
細胞質液，將其注射到 G2 期未成熟的卵母細胞，能夠啟動卵母細胞的成 熟，他們將這種有活性的物質稱為成熟促進因子 MPF。MPF 由兩個次單位 蛋白質所構成，分別是細胞分裂控制蛋白 2(Cell division control protein 2, Cdc2)與細胞週期素 B(Cyclin B)。Cyclin B 於卵母細胞中有 cyclin B1 與 cyclin B2 兩種型式，卵母細胞的成熟作用主要由 cyclin B1 控制，而 clyclin B2 只 是扮演輔助的角色（Kuroda et al., 2004）。MPF 原處於磷酸化狀態，稱之為 前 MPF（pre MPF），必須要藉著 Cdc 25 的幫助，使其去磷酸化，成為有功 能的 MPF。在 Dai et al.（2000）報告指出，Cdc25 mRNA 轉譯作用的停頓，
會抑制 GVBD 及紡垂體形成。比較卵母細胞成熟期間 MPF 量的變化，發現 都會上升（Tunquist et al., 2003）。受精卵開始進行有絲分裂時，MPF在有絲 分裂的三個時期扮演不同的角色。在G1期時，MPF藉由磷酸化Rb蛋白，使 Rb蛋白無法抑制轉錄因子E2F，讓進入S期所需的蛋白質表現。在G2期時，
MPF 功 能 與 減 數 分 裂 一 樣 ， 間 接 磷 酸 化 構 成 核 膜 的 重 要 蛋 白 質 lamine
（nuclear lamine），使lamins去聚合化（depolymerize），最後造成核膜瓦解。
MPF也會磷酸化染色體聚合蛋白質（chromosome-associated proteins），其中 包含組蛋白（histones）及其他染色體濃縮所需的蛋白質，驅動從G2期進入 讓姐妹染色體分體分離，進入到後期（Becker et al., 2003）。
2. MAPK
MAPK是一種磷酸化酶，對於卵母細胞成熟和隨後胚的發育都扮演重 要的角色。在卵母細胞成熟過程中，MAPK由上游激酶c-Mos蛋白所控制，
在GVBD時期開始被活化，之後都保持相當高的活性，直到卵母細胞停頓在 MⅡ 期 。 MAPK 分 為 兩 型 ， 分 別 是 胞 外 訊 息 調 控 激 酶 1 （ extracellular signal-regulated kinase 1, ERK1）及ERK2（Sun et al., 2001）。在非洲爪蟾蜍
（Xenopus）卵母細胞成熟期間，MAPK會活化MPF，導致GVBD發生，但 是在小鼠和海星這兩物種上，MPF的活化不需要MAPK的參與，因此MAPK 是否參與卵母細胞成熟期間減數分裂的恢復，有物種上的差異。當卵母細 胞有機會與精子完成受精作用，受精卵進步進行有絲分裂時，MAPK藉著
圖 4. MPF 於減數分裂期扮演的角色。
Fig. 4. The role of MPF in meiosis phase.
Ras 路徑調控轉錄因子，幫助細胞進行轉錄作用，促使細胞週期由G1期進 入到S期（Becker et al., 2003.）。
3. c-Mos蛋白
c-mos基因是一個原致癌基因（protooncogene），最早發現於鼠科的肉瘤 病毒（Moloney murine sarcoma virus），被認為是一個轉型基因（transforming gene）（Frankel and Fischinger, 1976 ; Vande Woude et al., 1980.）。Goldman et al.（1987）指出，c-Mos蛋白會特異性的表現在小鼠的雄性和雌性生殖細胞
（male and female germ cells）。於非洲爪蟾蜍，c-Mos 除了調控減數分裂的 起始（initiates）（Sagata et al., 1988）和過程（progression）（Kanki and Donoghue, 1991）外，也能活化細胞靜止因子（cytostatic factor, CSF），使減數分裂停 頓於MⅡ期，等待受精（Sagata et al., 1989），因此c-Mos在非洲爪蟾蜍卵的 成熟過程中扮演著重要的角色。但是在哺乳動物中，c-Mos的功能仍然是不 清楚，在c-mos基因剔除鼠的研究顯示，當c-Mos蛋白不存在時，MAPK不活 化，但是MPF仍然可以活化，而且GVBD仍然正常發生（Araki et al., 1996.）， 顯然哺乳動物c-mos的作用機制與非洲爪蟾蜍不同。
（四）c-Mos、MAPK 對卵母細胞成熟的影響
除了小鼠之外，許多哺乳動物的卵母細胞，其成熟過程是否需要 c-Mos 與 MAPK 的調控，仍然是有爭議的。使用更新的技術來解決這疑問是迫切 需要的。Ohashi et al.（2003）使用 antisense RNA 干擾技術，配合顯微操作，
希望能解決這個問題。其以豬為模式，注射豬 c-mos 蛋白的訊息 RNA
（mRNA）或反義股 RNA（antisense RNA）到豬卵母細胞，檢測 c-Mos 在 卵母細胞成熟期間扮演的角色。在 c-Mos mRNA 注射到卵母細胞後，發現 MAPK 的抑制劑 PD98059 及 U0126，可以抑制卵丘卵母細胞複合體及裸露 的卵母細胞 MAPK 的活性，也可抑制卵丘卵母細胞複合體 GVBD 的發生，
但是裸露的卵母細胞 GVBD 卻不被抑制 (Meinecke et al., 2003；Fan et al., 2003)。
2. 影響卵母細胞停頓在第二次減數分裂中期
進行第二次減數分裂中期的卵母細胞，高量的 MAPK 及 MPF 會促進細 胞靜止因子（Cytostatic factor, CSF）的活化，使卵母細胞再次停頓於 MII。
Fan et al. （2003）的研究指出，使用 U0126 抑制 MAPK 後，豬卵母細胞便 無法停頓在 MⅡ。Ohashi et al.（2003）研究顯示，將 c-mos 反義股 RNA 注
射到 GV 時期的豬卵母細胞，使 MAPK 不活化，部分的卵母細胞會從 M I 期
Napoli et al.（1990）首次在牽牛花（petunias）發現 RNA 干擾（RNA interference, RNAi）的現象，RNAi 為一種干擾基因表現的技術，主要目的 在於藉著抑制特定基因表現來探討此一基因之功能，並知道其對細胞或動 致分為五類型，分別是反義股 RNA（antisense RNA）、長片段雙股 RNA
（long-double stranded RNA, long-dsRNA）、micro RNA（miRNA）、short hairpin RNA（shRNA）及小干擾 RNA（small interference RNA, siRNA）。
表 1. c-Mos 對於各物種卵母細胞成熟期間 GVBD、MPF 活性及 MⅡ停頓的 影響。
Table 1. The effects of c-Mos on GVBD, MPF activity and MⅡ arrest of oocytes maturation in each species.
物種 影響 GVBD 影響 MPF 活性 影響 MⅡ的停頓
豬 ＋＊ ＋ ＋
鼠 － － ?
非洲爪蟾蜍 ＋ ＋ ＋
牛 ＋ ＋ ?
海星 － － ?
+：有影響、－：沒影響、＊：非必要條件（Ohashi et al., 2003）
（一） RNAi pathway
無論是 antisense RNA、dsRNA、shRNA 及 siRNA，其干擾機制都與 RNAi 訊息傳導路徑（RNAi pathway）有關，如圖 5 所示。一些重要的因子 在 RNAi pathway 扮演關鍵性的角色，如：Dicer、RNA 誘導默化複合體
（RNA-induced silencing complex, RISC）、RNA-dependent RNA polymerase
（RdRP）等。
Antisense RNA 與鵠的 sense RNA 雜交，形成 dsRNA，之後便進入 RNAi pathway，此時，Dicer 將扮演重要的角色。Dicer 具有 RNase III 酵素的功 能，藉著兩種蛋白因子 RDE-1 與 RDE-4 的輔助，及 ATP 的能量供給，使 dsRNA 裂解為 siRNA。之後 RISC 會找到被裂解的 si RNA，並黏附於反義 股端，RISC 具有 ATP-dependent helicase 的活性，能將 siRNA 解旋成單股。
RISC 也具有 RNase 的活性，當形成 RISC - 短片段反義股 RNA 複合體
（RISC-small antisense RNA complex）後，會找到標的基因之 mRNA，與之 結合，並分解鵠的 mRNA。
某些物種，如：真菌、植物及一些無脊椎動物等，在其 RNAi pathway 中 具有 RdRP。當 dsRNA 裂解成 siRNA，RISC 黏附於 RNA 反義股端，將 siRNA 裂解成單股，此時反義股片段會與鹄的 mRNA 結合，此片段如同引子的作 用，使 RdRP 黏附於此區，合成新的 dsRNA，進行一次新的 RNAi pathway，
提高鵠的基因的默化作用。
圖 5. RNAi 路徑。（Bantounas et al., 2004） Fig. 5. RNAi Pathway.
（二）干擾 RNA 的類型及對卵母細胞的應用性 乳動物卵母細胞反義股 RNA 技術的應用，Ohashi et al.（2003）顯微注射豬 c-mos 蛋白的訊息 RNA（mRNA）或反義股 RNA（antisense RNA）到豬卵 母細胞，藉著促進或抑制 c-mos 基因的表現，研究 c-Mos 蛋白對於豬卵母 中被稱為轉錄後基因默化（posttranscriptional gene silencing, PTGS），在這些 物種的基因默化研究中，證實了雙股RNA作為默化基因的工具比反義股 RNA來的有效率（Sharp, 2001）。至於在哺乳動物卵母細胞，Paradis et al.
（2003）將long-dsRNA用於牛卵母細胞上，顯微注射cyclin B1 dsRNA到牛 卵母細胞，發現能降低cyclin B1 mRNA及蛋白質的表現量。
3. miRNA
microRNA（miRNA）由 Lee et al. (1993)所發現，但是 2000 年之後才 被重視，生物體內就存有 miRNA 基因，有些基因位於染色體中較纖細
（fragil）的部位，有些處於 primary mRNA 的 intron 中。在人類與小鼠的基 因組 DNA 中，約有 200-300 個 miRNA 基因（Lim et al., 2003），除此之外，
在果蠅、線蟲等物種中發現，miRNA 參與基因表現的調控。起初 miRNA 由細胞核內表現而來，為一髮夾結構的 RNA（pre-miRNA），是一個 70 nt 的 RNAs，包含有 1-4 nt 突出端(overhands)，25-30 bp 的莖（stem），莖上 方形成一小環（small loop）。pre-miRNA 輸送至細胞質後，經過 Dicer 的加
在果蠅、線蟲等物種中發現，miRNA 參與基因表現的調控。起初 miRNA 由細胞核內表現而來，為一髮夾結構的 RNA（pre-miRNA），是一個 70 nt 的 RNAs，包含有 1-4 nt 突出端(overhands)，25-30 bp 的莖（stem），莖上 方形成一小環（small loop）。pre-miRNA 輸送至細胞質後，經過 Dicer 的加