收集卵丘卵母細胞複合體，用 cycloheximide 處理 8 小時，利用顯微操 作技術將10 ρlc-mos siRNAs mix 注射到卵母細胞細胞質中，之後成熟培養 44 小時，進行精子顯微注射，繼續培養 16 小時，最後卵母細胞用 lacmoid 染色或 Hoechst 33258 螢光染色，並用螢光位相差顯微鏡觀察其受精。以上 試驗重複三次，形態學變化採用卡方測驗及葉氏連續校正進行統計分析。
肆、結果 或 Hoechst 33258 染色，於螢光位相差顯微鏡下觀察，判斷其核成熟情形，
即觀察卵母細胞的細胞核是否處於 GV、GVBD、MI 或 MII 等狀態，GV 時
A
B
圖 8. 生發泡期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 8. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of germinal vesicle. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 9. 生發泡瓦解期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 9. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of germinal vesicle breakdown. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 10. 第一次減數分裂中期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 10. Nuclear morphology of pig oocytes in stage of metaphase I. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
A
B
圖 11. 第二次減數分裂中期豬卵母細胞細胞核的形態學。用 Hoechst 33258 (A)或 Lacmoid(B)染色。
Fig. 11. Nuclear morphology of pig oocytes in stege of metaphase II. Oocytes panel A were stained with Hoechst33258, and Lacmoid(B).
卵母細胞到達 MII 期，培養 44 小時，有 76.37％的卵母細胞到達 MII 期。 增幅結束後執行 Melting Curve（dissociation curve）分析是必要的。圖 13 與圖 14 分別為 c-mos 與 β-actin 增幅後之增幅曲線與裂解曲線圖，可看出
圖 12. 豬卵母細胞 0–44 小時培養期間細胞核的成熟。
Fig. 12. Nuclear maturation of pig oocytes cultured for 0-44 h.
A
B
圖 13. 即時定量 RT-PCR β-actin 的增幅曲線(A)與裂解曲線(B)。
Fig. 13. Amplification(A) and melting(B) curve profileofβ-actin in real time RT-PCR.
A
B
圖 14. 即時定量 RT-PCR c-mos 的增幅曲線(A)與裂解曲線(B)。
Fig. 14. Amplification(A) and melting(B) curve profile of c-mos in real time RT-PCR.
圖 15. 卵母細胞成熟期間 c-mos 基因的 mRNA 表現量。
Fig. 15. Quantitative analysis of c-mos gene expression in pig oocytes during maturation.
下降，44 小時表現量達到最低。
二、被穿刺卵母細胞存活率提升試驗
未成熟卵母細胞直接進行顯微注射，穿刺的動作會造成卵母細胞的死 亡，卵母細胞死亡時細胞質有空洞化、瓦解的現象，螢光染色時會發現整 個細胞質都被染色，有時發現染色體會濃縮在一起(圖 16)。本試驗之目的 在於卵母細胞穿刺前，先經由 cycloheximide 處理，探討是否能提升卵母細 胞的存活率。本試驗分成兩部份，第一部份探討 cycloheximide 的添加對於 卵母細胞成熟的影響，而第二部份實地的對卵母細胞做穿刺的動作，探討 cycloheximide 的處理對被穿刺卵母細胞存活率與成熟率的影響。
結果如圖 17-A、C 所示，其分別為 cycloheximide 的添加對於卵母細胞 存活或成熟的影響，未經 cycloheximide 處理的卵母細胞(N)，其存活率為 94.3 ％，而經 1μg/ml(1C)或 10 μg/mlcycloheximide(10C)處理者的存活率分 cycloheximide 處理 8 小時再換到不含 cycloheximide 的成熟培養液中，仍然 造成大部分的卵母細胞停頓在 GV 期（data not show）。
A
B
圖 16. 死亡豬卵母細胞以 Hoechst 33258(A)或 lacmoid(B)染色的影像。
Fig. 16. Photomicrograph of dead pig oocyte stained with Hoechst 33258(A), and lacmoid(B).
A C
B D
圖 17. cycloheximide 的處理對卵母細胞存活與成熟的影響。
Fig. 17. Effect of cycloheximide treatment on the rate of survival and matured pig oocytes cultured for 44 hrs.
當進一步對經 cycloheximide 處理後的卵母細胞進行穿刺動作，並繼續 培養 44 小時，結果如圖 17-B、D 所示，分別為 cycloheximide 的處理對被 穿刺卵母細胞存活或成熟的影響，未經 cycloheximide 處理且未經穿刺動作 的卵母細胞(N)(對照組)存活率為 100 ％，顯著地高於另外三組穿刺的卵母 細胞，惟卵母細胞在穿刺前先經1 μg/ml cycloheximide處理者(1CI)，其存 活率為 78.5 ％，顯著地高於 10 μg/mlcycloheximide 處理者(10CI)(42.3 ％) 與未經 cycloheximide 處理者(I)(36.9 ％)，顯然被穿刺卵母細胞若預先經適 量 cycloheximide 處理，可以降低穿刺動作對卵母細胞的傷害。上述處理的 卵母細胞進一步成熟培養，對照組卵母細胞的成熟率為 82.5 ％，顯著地高 於預先經 10 μg/ml cycloheximide處理者（56.3 ％） ，惟與經 1 μg/ml cycloheximide 處理者（88.5 ％）或未經 cycloheximide 處理，僅穿刺動作者
（68.1 ％）比較，並無顯著差異，可見過量的 cycloheximide 會影響被穿刺 卵的成熟率，而穿刺的卵母細胞先前未經 cycloheximide 處理成熟率也有略 為降低的現象，但是並沒有顯著差異。因此穿刺前以 1 μg/mlcycloheximide 處理卵母細胞 8 小時，會提升存活率，而且不會影響卵母細胞的成熟。
三、注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞成熟的影響
使用 siRNA construction kit 合成四組 siRNA，圖 18 所示為 siRNA 合成 後之產物電泳圖，M 為 marker，A、B、C、D 為四組 c-mos siRNA，合成 的 siRNA 皆為 21 bp。卵丘卵母細胞複合體經由 1 μg/mlcycloheximide處理 8 小時，將 10 pl c-mos siRNAs mix 注射到卵母細胞細胞質中，成熟培養 44 小時，之後萃取 RNA，使用 realtime PCR（（SYBR Green ）技術進行 c-mos mRNA 的相對定量，比較試驗組（注射 c-mos siRNA）與偽注射對照組之間 的差異。試驗結果如圖 19 所示，將對照組平均表現量常數設為 100 時，得 到成熟培養 12 小時注射 c-mos siRNA 之平均表現量常數為 43.6，成熟培養 44 小時為 59.2，可見注射 c-mos siRNA 無論在成熟培養 12 小時或 44 小時，
確實使成熟卵母細胞的 c-mos mRNA 表現量下降，且有顯著差異（p＜
0.05）。至於研究卵母細胞注射 c-mos siRNA 後對核成熟的影響，逢機選取 成熟培養期間 12、24、36、44 小時的卵母細胞，以 Lacmoid 或 Hoechst 33258 染色，觀察各時間點卵母細胞的核成熟，部分卵母細胞在成熟培養後繼續
圖 18. 以 4 ％ 含溴乙錠的電泳膠顯示 c-mos siRNA(21 bp)。
Fig. 18. Four percent agarose gel stained with ethidium bromide showing the generation of c-mos siRNA(21 bp).
A B
圖 19. 注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞成熟 12(A)小時及 44 小時(B)c-mos 基因表現的影響。
Fig. 19. Effect of c-mos siRNA injection on the c-mos gene expression of pig oocytes matured for 12 hr(A) and 44 hr(B).
A
B
圖 20. 注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞成熟培養 12~44 hr 期間核成熟的影 響。(A) 誘發 GVBD，(B)成熟到達 MII。
Fig. 20.Effect of c-mos siRNA injection on the nuclear maturation of pig oocytes cultured for 12 to 44 hours. (A) Induced GVBD, (B) Matured to MII.
現象，染色體形成雌原核(圖 21)。比較注射 c-mos siRNA 對卵母細胞孤雌致 組的雄原核形成率為 46 ％，比對照組（27％）高（P<0.05）。卵母細胞受 精後 2 天，用 Lacmoid 或 Hoechst 33258 染色，以螢光位相差顯微鏡觀察卵 裂，試驗組的卵裂率為 42.9 ％，對照組為 36.7 ％，兩者間無顯著差異，(表 3)。表 4 所示者為受精後 7 日，統計卵裂胚的細胞數，在 3 次重複的試驗中，
發現 c-mos siRNA 注射組與偽注射對照組兩者間，在細胞數大於 4 細胞與 6 細胞的卵裂胚比例上並無顯著差異，但是 c-mos siRNA 注射組有 3 顆胚
A
B
圖21. 致活卵母細胞以Hoechst 33258（A）或 lacmoid（B）染色的影像。
Fig. 21.Photomicropraph of activated pig oocyte stained with Hoechst33258(A), and lacmoid(B).
圖 22. 注射 c-mos siRNA 對卵母細胞致活的影響。
Fig. 22. Effect of c-mos siRNA injection on the activation of pig oocytes.
A
B
圖 23. 受精的卵母細胞以 Hoechst 33258(A) 或 lacmoid(B) 染色的影像。
Fig. 23. Photograph of fertilized oocyte stained with Hochast 33258(A) and lacmoid(B).
A
B
圖 24. 2 細胞期的胚以 Hoechst 33258(A) 或 lacmoid(B) 染色的影像。
Fig. 24. Photograph of 2 cell stage embryo stained with Hochast 33258(A) and lacmoid(B).
表 2. 注射 c-mos siRNA 對於豬卵母細胞受精的影響
Table 2. The effect of c-mos siRNA injection on fertilization parameters of pig oocytes. Experiments were repeated tree times.
abMeans ± S.D. in the same column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
表 3. 注射 c-Mos siRNA 對於豬卵母細胞體外受精後卵裂的影響
Table 3. Effect of injec c-mos siRNA injection on cleavage of pig oocytes fertilized in vitro.
Treatment No of oocytes examined No, (％) of oocytes cleavaged
c-mos siRNA injection 37 16(42.9 ± 8.6a)
puncture 47 17(36.7 ± 4.5a)
Experiments were repeated tree times.
aMeans ± S.D. in the same column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
表 4. 注射 c-mos siRNA 對於豬卵母細胞體外受精後胚發育的影響
Table 4. Effect of c-mos siRNA injection on the development of pig oocytes fertilized in vitro.
No, (％) of cells in embryos cleavaged Treatment No. of
oocytes examined
＞ 4 cells ＞ 6 cells ＞ 10 cells
c-mos siRNA injection
60 20(33.8 ± 16.3a) 5(8.4 ± 3.2a) 3(5 ± 0.3a)
puncture 65 24(37.4 ± 15.4a) 9(14.7 ± 9.8a) 0(0b) Experiments were repeated tree times.
abMeans ± S.D. in the same column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
（5 ％）的細胞數超過 10 細胞，顯著地高於對照組（0 ％）。
五、注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞精子顯微注射的影響
卵丘卵母細胞複合體用 cycloheximide 處理 8 小時，將 10 ρl c-mos siRNAs 注射到卵母細胞細胞質中，成熟培養 44 小時後，進行精子顯微注 射，培養 16 小時，以 Lacmoid 或 Hoechst 33258 染色，分別於螢光位相差 顯微鏡下觀察卵母細胞。結果如表 5 所示，卵母細胞致活率 siRNA 注射組 為 80.97 ％，與偽注射對照組（64.57 ％）比較有顯著差異，且雄原核形成 率 siRNA 注射組為 22.57 ％也比對照組高（0 ％），但是精子去濃縮率試驗 組與對照組間卻無顯著差異。
表 5.注射 c-mos siRNA 對豬卵母細胞精子顯微注射的影響
Table 5. Effect of c-mos siRNA injection on pig oocytes by intracytoplasmic sperm injection.
Treatment No of oocytes
Experiments were repeated tree times.
abMeans ± S.D. in the same column with different superscripts differ significantly (P < 0.05).
伍、討論
在 GVBD 發生之前，matenal mRNA 於 GV 之核網期大量製造，供 GVBD 發生之後，至 embryonic mRNA 開始表現之前使用，Heikinheimo et al.（1998）
指出，人類卵母細胞由成熟期間至受精後分裂至四細胞期間 maternal mRNA 逐漸下降，四細胞之後 embryonic mRNA 開始表現。c-mos mRNA 於卵母細 胞成熟期間由 maternal mRNA 而來，本試驗結果顯示，0-12 小時期間 c-mos mRNA 表現量處於上升的狀態（圖 11），於 12-24 小時期間 GVBD 發生（圖 9），因此在 12 小時之後開始消耗 c-mos mRNA，導致 c-mos mRNA 表現量 逐漸下降。豬卵母細胞中 c-mos mRNA 與其他 maternal mRNA 一樣，以 polyadenylation mRNA 及 deadenylation mRNA 兩種形式存在（Dai et al., 2005）。polyadenylation mRNA 具有多聚 A 尾（Poly A），Poly A 可使 mRNA 結構穩定，讓 mRNA 在細胞內維持較長的時間，除此之外，Poly A 能輔助 mRNA 由 細胞核傳送到細胞質 ，並且能增加 mRNA 的轉譯效率，而 deadenylation mRNA 無 Poly A，只能短暫的在細胞內表現，且轉譯效率極 低，可見 polyadenylation mRNA 對於細胞內的影響較大。本試驗 RNA 進行 反轉錄合成 cDNA，採用隨機引子（random primer），可測出 c-mos total mRNA（polyadenylation + deadenylation mRNA）表現量，但是無法單獨測 出 c-mos polyadenylation mRNA 的變化。Alizadeh et al.（2005）於小鼠研究 顯示， c-mos polyadenylation mRNA 表現量在 GV 時期最高，MII 次之，受
精之後達到最低，卵裂到囊胚期間則無 c-mos polyadenylation mRNA 的表 現。本試驗應用 real time PCR 測定 c-mos 基因表現，選擇 β-actin 基因表現 量為內部對照組，蓋β-actin 為 house keeping gene 。Bettegowda et al.（2006）
研究顯示，牛卵母細胞成熟期間，在 GV 與 MII 期，β-actin total mRNA 表 現量沒有差異，但是 β-actin polyadenylation mRNA 卻有下降的情形，而 β-actin polyadenylation mRNA 從卵裂期到桑葚胚期都穩定的表現，到囊胚期 表現量才明顯上升。豬卵母細胞在成熟與早期胚胎發育期間，從 GV、MI、 et al. (2003)於牛卵母細胞核轉殖過程中，以cycloheximide處理，的確能增加 核轉殖後囊胚的形成率。除此之外，未成熟豬卵母細胞先經cycloheximide
處理，之後進行成熟培養，能使未成熟卵母細胞的細胞週期同步，獲得]較 高的成熟率，以此提高卵母細胞的品質（Le Beux et al., 2003；Ye et al., 2002）。Paradis et al. (2002)穿刺未成熟牛卵母細胞，發現卵母細胞存活率 下降，若在顯微注射前，先以cycloheximide處理，發現在穿刺的過程中，卵
早在1988年Sagata et al. 將c-mos mRNA注射到未成熟非洲爪蟾蜍卵母 細胞，成熟培養期間不給予progesterone，會使卵母細胞減數分裂恢復。Sagata
早在1988年Sagata et al. 將c-mos mRNA注射到未成熟非洲爪蟾蜍卵母 細胞，成熟培養期間不給予progesterone，會使卵母細胞減數分裂恢復。Sagata