第三章 材料與方法
第五節 波葉山螞蝗與排錢樹植物的指紋圖譜研究
一、植物之層析圖譜
１、指紋圖譜樣品處理法
考慮仿照rutin定量所使用的樣品處理方法，來建立指紋圖譜。精密秤取植物 (波葉山螞蝗或排錢樹)全草的粉末1 g，以 10 ml methanol 超音波震盪加熱50℃
30分鐘，提取3次，靜置至室溫，合併三次濾液，濃縮至乾，加入 5 ml methanol 使其溶解，以 0.22 μm濾膜過濾後進樣 20 μl， 波長為 255 nm。
２、指紋peak 的選擇
我們打入波葉山螞蝗sample所得圖譜為圖8，我們選取的5個peak ，以rutin 的peak (peak 3)為基準。之後我們各選取rutin左右鄰近2個較高的peak (peak 1，2，
4，5)，計算這5個波峰的峰高百分比，繪製成折線圖（圖23），比較各波峰之間 的關係。排錢樹也與波葉山螞蝗相同，選取相同滯留時間的peak來做比較。（圖 24）
圖8. 波葉山螞蝗之HPLC層析圖
2.372.59 3.36 4.61 7.04 11.07 13.09 15.57 18.56 22.67 24.72 31.95 33.68
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Retention Time (min) 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
Absorbance (AU)
1 2 3
4 5
二、植物 PCR 之研究
１、植物材料與 DNA 之抽取
本實驗之材料採集臺灣產排錢樹及波葉山螞蝗植物新鮮葉子，標本存放在國 立自然科學博物館植物標本館(TNM)。 實驗所得 DNA 之序列登錄於 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene bank 中。
葉片組織在液氮中研磨粉碎後貯藏於 -20 ℃下備用。DNA 之抽取使用 Dellaporta method29。
(1) 磨碎萃取：
①. 取 1~4 g 幼嫩葉於研缽內，以液態氮研磨成粉末，移置於離心管中。
②. 加入 15 ml 之 Extraction buffer 及 1 ml 20 % SDS，強力搖晃 50 次 使之混合，接著以 65oC 水浴 10 分鐘。
③. 加入 5 ml 之 potassium acetate solution， 強力搖晃約 50 次後冰 浴 20 分鐘。
(2) 異丙醇沉澱：
①. 在 12 krpm（4 oC）離心 20 分鐘，取上清液至新離心管，加入 10 ml 之 異丙醇在–20 ℃下約 5~10 分鐘，使之沉澱。
②. 在 12 krpm（4 oC）離心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 10 分鐘，呈乾燥凝 膠。
③. 加入 0.5 ml 之 TE buffer，重新將凝膠溶出呈懸浮液。
(3) 酚清洗：
①. 將懸浮液倒入收集管，加入等量（0.5 ml）phenol（pH 8.0）混勻，在 10 krpm（4 ℃）離心 5 分鐘。
②. 將 上 清 液 倒 入 新 收 集 管 ， 加 入 0.25 ml chloroform （ chloroform ： isoamylalcohol=24：1）和 0.25 ml phenol 混勻，在 10 krpm（4 ℃）
離心 5 分鐘。
③. 將上清液倒入新收集管，加入 0.5 ml chloroform 混勻，在 10 krpm（4 ℃
下）離心 5 分鐘。
(4) 酒精沉澱：
①. 將上清液倒入新收集管，加入 0.9 ml absolute EtOH 和 0.15 ml ammonium acetate（7.5 M）。
②. 將混合液置於–20 ℃下 30 分鐘加強沉澱作用，在 10 krpm（4 ℃下）離 心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 5~10 分鐘。
③. 再以 70 % EtOH 清洗，置於室溫下 15 分鐘。
(5) 真空乾燥：
在 10 krpm（4 ℃下）離心 5 分鐘，去掉上清液，抽氣至完全乾燥。
(6) TE 溶解：
①. 加入 TE 緩衝液（10：1）0.2 ml 溶解產物。
②. 酌量加入 RNase A（10 mg/ml），分解及處理 RNA。
③. 保存於–20 ℃以供使用。
２、聚合酶連鎖反應( PCR )
DNA 通常為雙股，呈相反方向結合。其中一股為 5'（指核苷酸（Nucleotide）
分子中五碳醣的第五個碳的方位）→ 3'， 另一股為 3'→ 5'。DNA 係由核苷酸 包括：腺嘌呤（adenine）（A）、鳥糞嘌呤（guanosine）（G）與胞嘧啶（cytosine）
（C）及胸腺嘧啶（thymine）（T）所組成。且在配對氫鍵結合時均為 A 對 T，G 對 C。
選取特定引子 18D 和 28CC，利用 PCR 複製核糖體核酸基因間隔區(ITS)，這 組 ITS1-5.8S-ITS2 引子序列是：
18D（5'- CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）和 28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）
PCR 複製核糖體核酸基因間隔區的反應物及濃度如下：在 0.6 ml 的微量離 心管內加入：
(1)2.5 µl of 10 X reaction buffer (2)0.5 µl dNTP mix (8 mM)
(3)25 uM 18D 引子 2.5 µl (4)25 uM 28CC 引子 2.5 µl (5)0.5 µl Taq polymerase，
(6)最後加入 1 ul 的範本 DNA，
(7)加無菌去離子水使總體積成 25 ul，將微量離心管置入熱循環器。
反應的熱循環溫度及時間如下表 17：
表 17：PCR 反應溫度與時間
反應溫度 時間 循環次數
94 ℃ 5 分鐘
55 ℃ 1 分 30 秒
72 ℃ 3 分鐘
1
94 ℃ 1 分鐘
60 ℃ 1 分鐘
72 ℃ 1 分 30 秒
40
72 ℃ 10 分鐘 1
4 ℃ 持續保存
３、電泳分析
將 PCR 複製產物進行電泳分析,操作步驟如下:
(1) 取 1 g 瓊膠加入 100 ml 0.5 X TBE 緩衝液中。
(2) 在微波爐中加熱 2 分鐘。
(3) 迅速加入 2 ul ethidium bromide （7.5 mg/ml），小心振搖,倒入膠盤。
(4) 瓊膠在 10～15 分鐘內凝結。
(5) 加 Marker 5 ul（事先加入 2 ul dye）。
(6) 加 PCR 複製產物 5 ul。
(7) 在 50 V/100 V 電泳槽內進行電泳分離，約 30 分鐘。
(8) 以紫外燈箱上觀察，並拍照電腦存檔，以便作為判讀與分析之依據。
４、定序
在 UV 燈下觀察，以確定其 PCR 擴增長度正確，於 700～900 bps 下得一清晰環 帶，再將之交給源資國際生物科技股份有限公司定序。(圖 27，28)
第四章 實驗結果與討論
第一節 波葉山螞蝗與排錢樹植物的形態鑑定
一、外觀形態鑑定
根據文獻1,12的描述，可以得知波葉山螞蝗是小灌木，高約 1~2 公尺，相 較於其他山螞蝗屬植物，波葉山螞蝗有較粗且堅軔的木質部。枝被淡黃色短柔 毛。葉為羽狀三出複葉，大形，頂生小葉卵形、菱狀卵形、長橢圓形，長 4 ~10 公分，寬 3~7 公分，先端銳尖或漸尖，基部寬楔形，葉緣呈明顯的波浪形，兩 面均被毛。而排錢樹則是半灌木，高0.5～1.5 公尺。根細而彎曲。莖直立，分枝 多而纖細，被有柔毛。三出複葉互生，葉柄短，有鑽形托葉1 片，中間小葉大，
橢圓狀卵形或披針狀卵形，長5.5～11.5cm，寬 2.5～6.5cm，先端稍鈍，基部寬 楔形，邊緣淺波狀，下面脈上被短柔毛，兩側小葉較小。
我們觀察實際植物的狀況，發現波葉山螞蝗確實是高1~2 公尺，葉為三出複 葉，表面及背面皆有短絨毛，不黏人，葉片呈現現波浪狀，不尖銳，頂生的小葉 比較大，總狀的花絮，果莢6~12 節，會黏人，且成熟之後容易斷裂，通常生長 在向陽的地方(圖 9)。
排錢樹植物的高度與波葉山螞蝗相差不大，也是1~2 公尺高左右，但其新生 的植株，其葉子為三出複葉，與波葉山螞蝗不同處為其沒有波浪狀，但其成熟後 的植株葉片會排列像錢幣狀，兩兩對生，排列成一串因此被取名為排錢樹。花的 生長在兩片葉子之間，成熟後果實只有2 節，不黏人，包藏在葉子中間，成熟後 也是容易斷裂，生長在紅土的區域(圖 10)。
圖9：波葉山螞蝗植物圖
圖10：排錢樹植物圖
二、種子形態鑑定
波葉山螞蝗的種子，形狀約為橢圓球形微彎(圖 11)，長約 400~500μm，直 徑約為 900~1000μm，種子有一端較鈍，另一端則較尖，較尖的部分略小，由種 子放大圖，可以看出其表面有非常明顯的稜紋，且稜紋是互相交錯的，形成七字 型或人字型，再放大來觀看，稜紋或凹處佈滿了類似魚鱗狀的突起。
100 倍放大圖 500 倍放大圖
2000 倍放大圖 5000 倍放大圖
圖 11：波葉山螞蝗種子電子顯微鏡圖
排錢樹的種子，形狀約為近圓球形先端微彎(圖 12)，長約 1400~1500μm，
直徑約為 1500~1600μm，種子頭部的部分有蒂略微彎進去，放大 500 倍之後可 以稍微看出表面有紋路，放大至 1000 倍時，則可清楚看見表面的網狀紋路，放 大至 2000 倍時可以看到紋路呈現不規則型，或人字型，或七字型，或十字型，
且有小小突起的點。
50 倍放大圖 500 倍放大圖
1000 倍放大圖 2000 倍放大圖
圖 12：排錢樹種子電子顯微鏡圖
三、花粉的形態鑑定
根據黃增泉30等對於台灣產的波葉山螞蝗花粉描述如下(圖 13)：
Pollen class：3-溝孔粒(3-colporate) Shape：
(1) 赤道面觀：長球形-類球形 ~ 扁長形-類球形(prolate-spheroidal ~ olate-spheroidal)
(2) 頂面觀：圓形(amb circular ) Size：22~27 × 22~26μ
Aperture type：在 colpus 中的內孔是平行橫過 colpus 的呈現橢圓形 (ora transversally elliptic)。
Tectum：在 tectum 之上的一層是光滑的或粗糙，沒有明顯的突起。
(psilate or with scabrate process) 。
Sexine：經由 OL-pattern 分析，是屬於網狀紋(finely reticulate，with OL-pattern)。
根據黃增泉30等對於台灣產的排錢樹花粉描述如下(圖 14)：
Pollen class：3-溝孔粒(3-colporate) Shape：
(1) 赤道面觀：半長球形 ~ 扁長形-類球形(subprolate ~ olate-spheroidal) (2) 頂面觀：半有角~圓形(semi-angular ~ circular )
Size：22~31 × 24~29μ
Aperture type：在 colpus 中的內孔是平行橫過 colpus 的呈現橢圓形或圓形 (ora transversally elliptic or circular)。
Tectum：在 tectum 之上的一層是光滑的或粗糙，沒有明顯的突起。
(psilate or with scabrate process) 。
Sexine：經由 OL-pattern 分析，是屬於網狀紋(finely reticulate，with OL-pattern)。
在我們的實驗中，利用掃描式電子顯微鏡觀察花粉，如圖 13~14，由頂面觀，
可以看出波葉山螞蝗花粉的形狀約略為類圓形或些微近似三角形，而排錢樹花粉 的形狀則有點近圓形，我們可以明顯看出兩者的不同，但相同的皆是具有 3-溝 孔粒的形狀。若由赤道面觀察，可以看出波葉山螞蝗花粉形狀約略為長球形至扁 長球形，而且可以看出為 3-溝孔粒，且其形狀為類圓形，而排錢樹則為半長球
形誌扁球形，有些近似橢圓，但仍可看出半有角的形狀。而兩種植物皆是具有網 紋，但是我們可以發現排錢樹的網紋較波葉山螞蝗稍大一些，而兩者的網紋上面 都是呈現光滑的情況，都沒有明顯的突起。另外我們觀察到在 coplus 中央位置 有一個明顯的孔狀結構，波葉山螞蝗的部分我們可以看到是類似圓形的形狀，在 排錢樹的部分是圓形或是橢圓形的形狀。
綜合以上所提，可以知道我們所採集到的波葉山螞蝗和排錢樹，在花粉的鑑 定上，與文獻30所描述相符。
頂面觀 赤道面觀
頂面觀放大 赤道面觀放大
colpus colpus 放大
圖 13：波葉山螞蝗花粉電子顯微鏡圖
頂面觀 赤道面觀
頂面觀 赤道面觀放大圖
colpus colpus 放大
圖 14：排錢樹花粉電子顯微鏡圖
四、果的形態鑑定
根據文獻1, 12所述，台灣產的波葉山螞蝗莢果線形，稍彎，4~5 公分，暗褐
色，沿上縫線有較淺的向內凹，下縫線則向內凹至寬的1/4 左右處，有 6~12 節，
密生黃色鉤毛，節易斷落，但不裂開。成熟後斷裂，可沾附在動物身上，代為傳 播種子(圖 15)。而台灣產排錢樹莢果僅 2 莢節，莢節處緊縮，長約 6mm，先端 有長喙，邊緣被毛。種子細長，近矩形(圖 16)。
經過實際上觀察我們採集到的植物之後可以發現到，波葉山螞蝗的果莢上面 確實密佈著鉤毛，且顏色為淺綠~黃褐色，每一節的長度比排錢樹小，大約 2~3mm；而排錢樹果莢則是具有網狀的紋路但不具有鉤毛，顏色看起來則是黃褐 色~褐色，每一節的長度比波葉山螞蝗長，大約 3~4mm。另外我們也可以發現到，
波葉山螞蝗植物的果莢確實有6~12 節，而排錢樹的果莢則只有 2 節，長度的話 自然是波葉山螞蝗的果莢較長，約有3~4 公分，排錢樹的果莢則約為 6~7mm，
而兩者果皮的內面在光學顯微鏡下都是呈現光滑的形狀。而去掉果皮之後看到裡 面的種子，我們可以觀察到，波葉山螞蝗的種子較小，大約0.5mm；而排錢樹的 種子則有1~2mm 大小。
本研究亦將乾燥果皮經由鍍金處理，再以掃描式電子顯微鏡觀察其內外側，
由圖 17~18 可以發現，波葉山螞蝗果皮的外側部分具有鉤毛，我們由放大的圖也 可以看出鉤毛的形狀，我們仔細看也可以看出外側的果皮表面上也具有網狀的紋 路，分布較不規則，果皮內側也是具有網狀紋路，分布較為規則。排錢樹果皮正 面則可以看到不像波葉山螞蝗一樣具有鉤毛，但仍有網狀的紋路，但騎網狀紋路
由圖 17~18 可以發現，波葉山螞蝗果皮的外側部分具有鉤毛，我們由放大的圖也 可以看出鉤毛的形狀，我們仔細看也可以看出外側的果皮表面上也具有網狀的紋 路，分布較不規則，果皮內側也是具有網狀紋路，分布較為規則。排錢樹果皮正 面則可以看到不像波葉山螞蝗一樣具有鉤毛，但仍有網狀的紋路，但騎網狀紋路