第四章 實驗的結果與討論
第二節 波葉山螞蝗與排錢樹生藥組織學研究
一、波葉山螞蝗
(1)性狀
乾燥莖呈黃褐色，圓柱形，長 100~200cm，表面具細微而明顯之縱走皺紋，
密披黃白色短絨毛，會黏人，質稍硬韌，折斷面具纖維性，呈淡黃白色~ 黃綠 色，氣味微甘清香。
葉多數脫落，少數殘存，往往皺縮或殘缺；黃綠~綠色，葉為羽狀三出複 葉，大形，頂生小葉卵形、菱狀卵形、長橢圓形，邊緣呈現波浪狀，5~10cm × 3~5cm。(圖 19)
(2)莖組織
①.莖之弱擴大圖
徑 0.3~0.5 cm，以放大鏡檢視其莖之橫切面，呈類四方形~類圓形。最 外層之表皮為黃褐色，皮部與木部之比例約為 1：1~1：3，中央髓部明顯，
約佔 1/2。(圖 19)
②.鏡檢
以顯微鏡檢視其莖之橫斷面，上表皮細胞一層，細胞呈類長方形，外 披角質層。皮層細胞約 5~7 層，呈類圓形或類長方形，細胞大小不一，皮 層內側具 4~6 層紅色連續性韌皮纖維層。篩部細胞呈不規則形，5~7 層，內 含黃棕色油滴樣物質。形成層不明顯。木部由木部纖維、導管群及木部薄 壁細胞組成。導管及木部細胞呈放射狀排列，導管成類圓形環繞著髓部排 列，以網紋、螺旋紋為主，直徑約 5~20μm。髓線寬狹不一，細胞呈放射 狀延長。中央髓部明顯，細胞呈類圓形。(圖 19)
(3)葉組織
以顯微鏡檢視其葉之橫斷面，上表皮細胞一層，細胞呈類方形、類圓形 或不規則形，外披角質層。葉肉組織係由一層柵狀細胞及數層海綿狀柔細胞
所組成。柵狀細胞一層，不通過中肋。木質部為螺旋紋導管，韌皮部細胞呈 不規則形，排列緊密。下表皮細胞一層，細胞較小，氣孔僅存於下表皮，5 × 10 μm。主脈向下凸出，厚 60~65 μm，約葉片的 2~2.5 倍，葉片厚 20~30μm。
葉的下表皮可以看到有非腺毛的組織。(圖 19)
二、排錢樹
(1)性狀
乾燥莖呈黃褐色~褐色，圓柱形，長 50~150cm，表面具細微而明顯之縱走 皺紋，質稍硬韌，折斷面具纖維性，呈淡黃白色~黃綠色，氣味平淡、清香。
葉多數脫落，少數殘存，往往殘缺；黃綠~綠色，初生的葉為三出複葉互 生，葉柄短，有鑽形托葉一片，中間小葉大，橢圓狀卵形或披針狀卵形，長 5.5
～11.5cm，寬 2.5～6.5cm，而成熟之後則成為單葉對生，葉柄短，有鑽形托葉 一片，葉片成倒卵圓形。(圖 20)
(2)莖組織
③.莖之弱擴大圖
徑 0.3~0.5 cm，以放大鏡檢視其莖之橫切面，呈類圓形。最外層之表 皮為黃褐色，皮部與木部之比例約為 1：2~1：3，中央髓部明顯，約佔 1/3。
(圖 20)
④.鏡檢
以顯微鏡檢視其莖之橫斷面，上表皮細胞一層，細胞呈類長方形，外 披角質層。皮層細胞約 5~10 層，呈類圓形或長橢圓形，細胞大小不一，皮 層內側具 3~4 層紅色連續性韌皮纖維層。篩部細胞呈不規則形，5~7 層。形 成層不明顯。木部由木部纖維、導管群及木部薄壁細胞組成。導管及木部 細胞呈放射狀排列，導管成類圓形環繞著髓部排列，以網紋為主，直徑約 20~80μm。髓線寬狹不一，較不明顯，細胞呈放射狀延長。中央髓部明顯，
細胞呈類圓形。(圖 20)
(3)葉組織
以顯微鏡檢視其葉之橫斷面，上表皮細胞一層，細胞呈類方形、多角形 或不規則形，外披角質層。葉肉組織係由一層柵狀細胞及數層海綿狀柔細胞 所組成。柵狀細胞一層，不通過中肋。木質部為螺旋紋導管，韌皮部細胞呈 不規則形，排列緊密。下表皮細胞一層，細胞較小，氣孔僅存於下表皮，5 × 20 μm。主脈向下凸出，厚 700~720 μm，約葉片的 3.0~4.0 倍，葉片厚 250~280 μm。業的下表皮可以看到有單晶，葉脈的外圍也有非腺毛的構造。(圖 20)
圖 19：波葉山螞蝗之組織切片圖
圖 20：排錢樹之組織切片圖
第三節 波葉山螞蝗與排錢樹植物中 rutin 的定量
在2005年Pushpesh Kumar Mishra等人31從Desmodium gangeticum的植物中分 離出rutin這個成份，他們發現到rutin及其他Glycolipids的成分都具有抗利什曼原 蟲的效用，也具有免疫調節的功能。另外在2002年Khalid H.32等人的研究中指 出，rutin對於四氯化碳及paracetamol所以引起的肝臟毒性有保護的效用。當口服 給予老鼠20 mg/Kg 後再投與四氯化碳 1.5 ml /Kg或是paracetamol 640 mg/Kg，這 時候可以發現到對於四氯化碳或是paracetamol所造成的ALT和AST上升的情況 有明顯的改善。所以我們推測同屬植物中有rutin的成分，因此選取rutin來進行定 量，用以確定rutin在植物中的含量。
一、分析條件的選擇
我們以幾個方向來討論分析的條件：(1) 管柱種類；(2) 移動相；(3) UV 值；(4) 內部標準品（以下簡稱 I.S.）
首先，rutin的極性偏高，在逆向的管柱中較容易被洗脫，所以管柱的選擇以 RP-18 管柱為主，在參考有關於rutin的分離條件相關文獻之後，發現本實驗室 中即有RP-18（Merck LiChroCART 250-4）的管柱，故以此作為分析的管柱，不 需改變管柱的種類，所以在條件的選擇以朝向改變移動相條件及UV檢測波長為 主。
在UV 檢測條件的選擇上，rutin 的 UV 如圖 21 所示，在 255 nm 和 350 nm 附近有明顯的吸收峰，且相對上受到的干擾物質較少一些，在經由參考文獻33 之後，選擇以255 nm 為定量的波長。
移動相選擇的部分，在參考完文獻（表 18）後，可見Fang34等所用的方法，
們添加磷酸以降低 pH 值，使得 rutin 得以維持分子態。我們加入 1ml 的磷酸 再以1000 c.c.的定量瓶加水定容至 1000 c.c. 讓磷酸水的比例為 0.1%。
表18：不同條件下rutin的滯留時間 Column Mobile phase Flow rate
(ml/min-1) (40:15:45, v/v/v) containing 1.0%
acetic acid
Solvent A ：19% acetonitrile, 5%
methanol and 1% THF in water (pH 3.0) solvent B ：55% acetonitrile and 15%
methanol in water(pH 3.0)
1 10 360 34
Solvent A：0.1% formic acid Solvent B：acetonitrile 0.1% formic acid
1 20 370 37
Luna C18(2) 25 cm
methanol-buffer 1 11.7 38
RP－18
由表可見所用的移動相有使用 methanol 與水或是 acetonitrile 與水，經過我 們實際操作之後，發現使用acetonitrile 與水並沒有辦法將 rutin 的 peak 完全分離 出來，仍然會與其他的peak 夾雜，而選用 methanol 與水則可以將 rutin 完全的來 分離，所以我們就選擇以 methanol 和水來作為移動相，接下來在改變 methanol 和水之間的比例，尋求最佳的分離條件。
圖21：rutin 的 UV 吸收波長
我們由圖 6~7 可以發現到內標的選擇應選在滯留時間 28~31 分鐘之間，因此 我們選擇以ethyl 4-hydroxybenzoate 來作為內標，因為其滯留時間約在 30 分鐘左 右(圖 4)，正好符合我們的需求。
二、高效液相層析法系統定量
為了能夠確保定量的準確性，故使用下述的定量條件：
(1)、管柱種類：Merck LiChroCART 250-4 (2)、移動相：
使用 Methanol 與 0.1% phosphoric acid (pH= 2.43)為移動相溶媒，並以不 同比例之梯度變化作為移動相條件，其變化如表19 所示：
表19：HPLC 移動相之條件
(3)、內部標準品（以下簡稱 I.S.）： Ethyl-4-hydroxybenzoate (4)、 UV 波長：255 nm
圖22：24 小時內 rutin 在 methanol 中的穩定性
2、rutin 檢量線製作
rutin 檢量線製作是以不同濃度 rutin（X）對 rutin 與 I.S.之層析峰面積比
（Y）的反應值（圖 5，表 16）。所得到的檢量線方程式為 y = 0.006x - 0.0493 R2 = 0.9976
此圖可顯示當 rutin 濃度在 25.85~517 μg/ml 之間時具有良好的線性關係。
3、 rutin 回收率試驗
由實驗結果可知 rutin 在經過和植物定量相同的步驟後，回收率分別為 94.25 %及 95.49 %，顯示回收率良好（表 13）。
4、rutin 精密度試驗
由實驗的結果顯示，利用此種 HPLC 定量條件的再現性良好，同一天的 面積比相對標準差介於0.16~1.23 % 之間，以及異日間的面積比相對標準差 介於0.60~1.15 % 之間，均在可以接受的範圍以內（表 12~15）。
5、LOD（limit of detection）和 LOQ（limit of quantitation）探討
在 USP 2828,41中，把LOD 定義在規定的實驗條件下，分析方法能夠檢測
（但不需要定量）的樣品中分析物的最低濃度。LOQ 的定義則是在規定的實 2
2.5 3 3.5 4
0 3 6 9 12 15 18 21 24
時間(小時)
rutin/I.S.
驗條件和具有可接受的精密度和準確度前提下，分析方法能夠測定樣品中分 析物的最低準確濃度。
USP 2828中使用儀器分析，我們同時測定已知分析物含量的樣品和空白 樣品，得到儀器的數值分別為S（信號）和 N（雜訊），我們將能得到的 S/N 比在2：1 或是 3：1 時樣品中的分析物濃度定為 LOD；而當 S/N 比在 10：1 的時候，我們把樣品中的分析物濃度定為LOQ。
我們經由實驗所得LOD 的濃度為 3.34 μg/ml，而 LOQ 的濃度為 10μ g/ml。
三、植物rutin 之定量
臺灣產波葉山螞蝗及排錢樹植物全草的 rutin 含量，列於表 20。
表20： rutin 含量
植物 重量(μg) 含量( ﹪)
波葉山螞蝗 40.20 0.004
排錢樹 260.73 0.026
四、討論
1、rutin 提取方法之選擇
在樣品處理方法的選擇上，我們分別以下列方法提取：
(1) methanol 萃取
(2) 0.1% phosphoric acid 和 methanol 萃取 (3) methanol 和 H2O
(4) H2O 萃取
(5) 0.1% phosphoric acid 萃取
比較上述提取方法，發現以 methanol 萃取所得 rutin 含量最高，因此我 們選擇以methanol 作為樣品處理的溶媒。
另外，選擇好溶媒之後，接下來便是萃取方法，我們以下列四種方法來 提取：
(1) 超音波萃取法 30 分鐘
(2) 冷浸法（並用磁石攪拌）在室溫下，18 小時
(4) 超音波加熱 50 ℃，30 分鐘
2.372.593.12 17.25 34.35
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Absorbance (AU) 2.593.12 3.95
0 5 10 15 20 25 30 35 40
第四節 波葉山螞蝗與排錢樹植物的指紋圖譜研究
一、 植物之層析圖譜
如圖8，我們選取的5個 peak（表21） ，以排錢樹的rutin之波峰為基準，當 作100%，計算波葉山螞蝗與排錢樹這5個波峰的高度和rutin波峰的高度比，得其 比值（表22~23），繪製成折線圖（圖23~24），比較各波峰之間的關係。
表21：波葉山螞蝗各peak 之滯留時間 波峰標號 Retention Time（min）
1 13.39 2 15.57 3 18.56 4 24.72 5 33.68
表22：波葉山螞蝗在HPLC中各peak高度與排錢樹rutin peak之高度比 Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5
7.90% 25.80% 44.90% 4.10% 3.00%
表23：排錢樹在HPLC中各peak高度與排錢樹rutin peak之高度比 Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 6.40% 1.70% 100% 3.10% 11.60%
我們選擇以排錢樹的rutin來當作標準將其含量定做100%，因為其含量在波 葉山螞蝗及排錢樹中最高的peak，而後算出其他peak的百分比。經過計算之後，
我們發現peak 1的含量都相差不多，但peak 2則是在波葉山螞蝗中有較多的含
量，peak 3也是我們欲定量的rutin，在排錢樹中的含量非常高，波葉山螞蝗中的 量大約只有排錢樹的45%，明顯排錢樹中rutin量高出波葉山螞蝗許多，而peak 4 兩個的含量都非常少，peak 5則是以排錢樹的量較為高，由這兩張指紋圖譜，可 以觀察出不同植物中的成分、含量各有不同，可以作為鑑定的依據。
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
1 2 3 4 5
peak
與排錢樹rutin peak之高度比
圖23： 波葉山螞蝗之HPLC指紋圖譜
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
1 2 3 4 5
peak
與排錢樹rutin peak之高度比
圖24： 排錢樹之HPLC指紋圖譜 rutin
rutin
二、植物 PCR 之研究
真核生物細胞核醣體DNA 在細胞核中重複數目(copy number)多，在植物基 因組中以一基本單元序列重複排列(tandem arrays) 於一條或多條染色體核仁 組成區中，可達數百至數千次，每一個重複單位是由18S、5.8S 及28S 之rDNA 基 因編碼區、及其間隔序列 ITS (internal transcribed spacer)和基因之間的序 列IGS (intergenic spacer) 所組成，在18S rDNA 與5.8S rDNA 之間的轉錄區 序列稱為ITS1，而5.8S rDNA 與28S rDNA 之間的轉錄區序列稱為ITS2；IGS 由 啟動子(promoter) 與18S rDNA 基因間的ETS (external transcribed spacer) 及無法進行轉錄的NTS (nontranscribed spacer) 所組成42, 43。在DNA 進行轉錄
真核生物細胞核醣體DNA 在細胞核中重複數目(copy number)多，在植物基 因組中以一基本單元序列重複排列(tandem arrays) 於一條或多條染色體核仁 組成區中，可達數百至數千次，每一個重複單位是由18S、5.8S 及28S 之rDNA 基 因編碼區、及其間隔序列 ITS (internal transcribed spacer)和基因之間的序 列IGS (intergenic spacer) 所組成，在18S rDNA 與5.8S rDNA 之間的轉錄區 序列稱為ITS1，而5.8S rDNA 與28S rDNA 之間的轉錄區序列稱為ITS2；IGS 由 啟動子(promoter) 與18S rDNA 基因間的ETS (external transcribed spacer) 及無法進行轉錄的NTS (nontranscribed spacer) 所組成42, 43。在DNA 進行轉錄