第四章 ：實驗
4.2 合成固體催化劑
首先，1.349(g)的氯化鐵(III)和 0.781(g)的氯化鐵(II)放入 600 毫升的去離子水 中，攪拌至溶解。溶解後，慢慢滴入氨水(滴入的速度是 30mL/hr)至整杯溶液的 的 pH 值為 9，杯底放置在磁鐵上面，靜置一段時間後，會看到氧化鐵都被磁鐵 吸至杯底，上面是澄清的水溶液，把水溶液倒掉後再加入去離子水，靜置後又倒 掉，重複這些動作五次後，再加入 600 毫升的去離子水等待下一步驟的使用。
4.2.2 合成含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子
如圖 4.1 所示，首先，從 4.2.1 的氧化鐵溶液中取出其中的 180 毫升，利用 超音波震盪器振十分鐘讓氧化鐵粒子分散更好。接著放入界面活性劑 brij-O10 6.92 毫升，經過 1~2 小時攪拌均勻之後，再放入 APTMS 0.3 毫升及 DOP 0.08 毫 升做為孔的擴張劑，可以讓形成的孔徑稍微變大。半小時後，再加入 TEOS 6.7 毫升後，攪拌 24 小時，此時溶液的顏色為咖啡色。接下來所得溶液在 100oC 的 油浴下迴流一天就可以得到藉由共沉澱法得到的含氧化鐵中孔洞氧化矽奈米粒 子這個基材。最後用甲醇藉由抽氣過濾洗滌材料(使用甲醇量為一公升)，收進減 壓真空乾燥即可使用。另外，氧化鐵無孔氧化矽奈米粒子的做法幾乎都一樣，只 是沒有加入介面活性劑 brij O10。
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圖 4.1 合成含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之流程圖
4.2.3 基材的合成
4.2.3.1 中孔洞氧化矽奈米粒子之合成
由於含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子是使用共沉澱法合成，氧化鐵會在 中孔洞氧化矽奈米粒子裡面或者是覆蓋在表面，如果覆蓋在表面的話會使表面的 羥基官能基減少許多，導致以後利用接枝法(grafting method)在材料表面上修飾上 的官能基會非常少，為了解決這個問題，選擇了不修飾氧化鐵的 MSN。
我們選擇合成具有高表面積的中孔洞氧化矽奈米粒子來做另外一種基材。合 成方法如圖 4.2 所示。在 500 毫升的圓底瓶中放入 164 克的去離子水和 109 克濃 度為 4M 的鹽酸，並加入 7 克的 P104 作為介面活性劑，並在室溫下攪拌一天，
之後放入 55oC 的油浴中，並且使用針筒幫浦(syringe pump)來定速，以每小時三 十毫升的速度加入 TEOS 11.4 毫升，並攪拌一天；之後放入高壓釜中並在 150oC 下水熱一天，拿出來用甲醇和水清洗，原因是要洗掉多餘的介面活性劑；最後為 了讓介面活性劑清除得更乾淨，放入 550oC 的氮氣環境下高溫燒結 6 小時，即完 成中孔洞氧化矽奈米粒子合成之步驟。
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圖 4.2 合成中孔洞氧化矽奈米粒子
4.2.3.2 中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化—接上磺酸官能基
我們利用接枝法(grafting method)使基材表面修飾上官能基以便實驗之用。如 圖 4.3 所示，首先取出 1(g)的中孔洞氧化矽奈米粒子當作基材並放入雙頸瓶中，
其中一個頸用血清塞塞住防止漏氣。放入磁石後，另一個頸接上冷凝管並放入 110oC 的油浴中並固定。接著開始抽真空半小時，之後再灌入氮氣，重複這個動 作三次之後，已經去除反應容器內大部分的水氣(因為矽烷類很容易水解所以要 去 除 水 氣 ) 。 接 著 打 入 40 毫 升 的 無 水 甲 苯 進 去 ， 再 加 入 磺 酸 矽 烷 -MP(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane) 2.23 毫升，在 110oC 油浴下迴流攪拌 24 小時。一天之後，以甲苯當洗滌液(一公升)，用抽氣過濾的方式清洗材料，最後 放入低壓真空裡面乾燥即可得到基材表面上修飾硫氫根(-SH)的固體催化劑。接 下來拿出乾燥後的基材表面上修飾硫氫根(-SH)的催化劑，以 1 克的基材配上 20 毫升的雙氧水、20 毫升的甲醇以及 20 毫升的去離子水為比例，做官能基氧化的 動作。在室溫下攪拌一天後，以去離子水當洗滌液(一公升)，用抽氣過濾的方式
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清洗材料，最後放入低壓真空裡面乾燥即可得到基材表面上修飾磺酸根(-HSO3) 的固體催化劑。
圖 4.3 中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾磺酸官能基之流程圖
4.2.4 含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化—接上氨官能基
如圖 4.4 所示，首先取出 1(g)含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子當作基材 並放入雙頸瓶中，其中一個頸用血清塞塞住防止漏氣。放入磁石後，另一個頸接 上冷凝管並放入 110oC 的油浴中並固定。接著開始抽真空半小時，之後再灌入氮 氣，重複這個動作三次之後，已經去除反應容器內大部分的水氣(因為矽烷類很 容易水解所以要去除水氣)。接著打入 40 毫升的無水甲苯進去，再加入氨基矽烷 -APTMS(3-Aminopropyltrimethoxysilane)5 毫升，在 110oC 油浴下迴流攪拌 24 小 時。一天之後，以甲苯當洗滌液(一公升)，用抽氣過濾的方式清洗材料，最後放 入低壓真空裡面乾燥即可得到基材表面上修飾氨根(-NH2)的固體催化劑。
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圖 4.4 氧化鐵中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾氨官能基之流程圖
4.2.5 含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化—接上羧酸官能基 如圖 4.5 所示，首先取出 1(g)的含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子當作基 材並放入雙頸瓶中，其中一個頸用血清塞塞住防止漏氣。放入磁石後，另一個頸 接上冷凝管並放入 110oC 的油浴中並固定。接著開始抽真空半小時，之後再灌入 氮氣，重複這個動作三次之後，已經去除反應容器內大部分的水氣(因為矽烷類 很容易水解所以要去除水氣)。接著打入 40 毫升的無水甲苯進去，再加入酸酐矽 烷-TESPSA(3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride)0.37 毫升，在 110oC 油浴下 迴流攪拌 24 小時。一天之後，以甲苯當洗滌液(一公升)，用抽氣過濾的方式清 洗材料，最後放入低壓真空裡面乾燥即可得到基材表面上修飾酸酐官能基的固體 催化劑。
接下來拿出乾燥後有接上酸酐官能基的基材，以 1 克的基材配上 30 毫升的 99%酒精為比例，加熱到 90oC，一小時後，再加入去離子水(比例為 1 克的基材 配上 2 毫升的去離子水)，在 90oC 油浴下再反應一小時，做酸酐開環變成兩個羧 酸基的反應。最後以去離子水(一公升)當作洗滌液，用抽氣過濾的方式清洗材料，
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放入低壓真空裡面乾燥即可得到基材表面上修飾羧酸官能基的固體催化劑。
圖 4.5 氧化鐵中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾羧酸官能基之流程圖
4.2.6 酵素的固定化(物理吸附)
要固定纖維素水解酶的話，首先，取含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子 50 毫克當作固定酵素的基材，接著加入 2 毫升的檸檬酸緩衝液(10mM,pH=4.8)。
粒子攪拌均勻分布在緩衝液之後，再加入纖維素水解酶 1 毫升進去，並在 4oC 的 環境下攪拌一天。一天之後，取出並利用磁鐵分離固體催化劑和液體，重複三次 之後並保留上清液待測試。另外一方面，要固定葡萄醣異構酶的話，一樣取含有 氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子 50 毫克當作固定酵素的基材，接著加入 2.5 毫 升的磷酸鈉緩衝液(磷酸鈉 20mM/氯化鈉 0.15 M/硫酸鎂 5mM, pH=7.5)。粒子攪 拌均勻分布在緩衝液之後，再加入葡萄醣異構酶 0.5 毫升進去，並在 4oC 的環境 下攪拌一天。一天之後，取出並利用磁鐵分離固體催化劑和液體，重複三次之後 並保留上清液待測試。上清液經過紫外光-可見光光譜儀測定(280nm)之後，藉由 檢量線並經過計算之後，可以得知上清液中酵素有多少，加入的酵素量為已知，
只要兩個相減之後並可以知道固定上基材的酵素有多少。
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4.2.7 酵素的固定化(化學鍵結)
利用化學鍵結把酵素固定在基材上的原理是利用材料上面修飾上的氨基(或 羧酸基)和酵素分子內的羧酸基(或氨基)形成穩定的醯胺鍵(peptide bond)後，酵素 和基材形成鍵結而不容易脫落。要利用化學鍵結固定纖維素水解酶的話，首先先 取 鑲 嵌 入 氧 化 鐵 的 中 孔 洞 氧 化 矽 奈 米 粒 子 表 面 修 飾 羧 酸 官 能 基 (Fe3O4@MSNs-(COOH)2)0.05 克，加入 2 毫升的檸檬酸緩衝液中，再加入 EDC 12.4 毫克和 NHS 7.5 毫克，這兩種化學藥品的作用是幫助醯胺鍵能夠更快的形成。接 下來加入 1 毫升的纖維素水解酶，在 4oC 的條件下反應一天。一天之後，取出並 利用磁鐵分離固體催化劑和液體，重複五次之後並保留上清液待測試。要利用化 學鍵結固定葡萄醣異構酶的話，首先先取鑲嵌入氧化的中孔洞氧化矽奈米粒子表 面修飾氨官能基(Fe3O4@MSNs-NH2)0.05 克，加入 2.5 毫升的磷酸鈉緩衝液中，
再加入 EDC 12.4 毫克和 NHS 7.5 毫克，接下來加入 0.5 毫升的葡萄糖異構酶，
在 4oC 的條件下反應一天。一天之後，取出並利用磁鐵分離固體催化劑和液體，
重複五次之後並保留上清液待測試。利用上清液測紫外光-可見光光譜儀再經過 計算後可以知道鍵結多少酵素上去。
4.3 連續式反應操作