國立臺灣大學工學院化學工程研究所 碩士論文
Graduate Institute of Chemical Engineering College of Engineering
National Taiwan University Master Thesis
合成酵素固定或化學酸官能化磁性中孔洞氧化矽奈米 粒子做為可回收式固體催化劑應用於纖維素-葡萄糖-
果糖-5-羥甲基糠醛序列式生質轉換
An Effective Cellulose-to-Glucose-to-Fructose-to-HMF Sequential Conversion Using Enzyme-Immobilized or Acid-Functionalized Fe3O4-Loaded Mesoporous Silica
Nanoparticles as Recyclable Solid Catalysts
李翊群 Yi-Chun Lee
指導教授：吳嘉文 博士
Advisor: Kevin Chia-Wen Wu, Ph.D.
中華民國 102 年 7 月 July, 2013
致謝
跟這間實驗室開始的緣分，是在大三的時候，那時候還是懵懵懂懂，不知道 自己未來研究的方向，看到了吳嘉文教授的研究領域，有點感興趣，跟老師聊了 之後就開啟了我對生質能源轉換的興趣，從那時到現在，經過老師的教導、和學 長姊的討論、同屆同學的互相扶持以及學弟妹的幫忙之下，我完成了這本論文，
不過我這四年來的收穫絕對不只是這樣而已。首先感謝的當然是我的指導教授—
吳嘉文老師，不論是實驗上的討論、實驗技巧的提點、做研究的精神、論文寫作 的要領以及口試簡報和口說的指導，老師總是很有耐心地與我對話和教導我；另 外也非常感謝老師對我生活上的關懷，之前有想去日本交換學生半年時也非常的 細心替我做安排，雖然之後因為有些事沒有去不過很感謝老師有把我的事情放在 心上替我安排周全，也非常貼心的關心我們每個人的狀況，用盡所有資源去支持 每個學生實驗上的想法或是對於未來的規劃，讓我們可以無憂無慮專心在我們自 己的研究上。謝謝能源組我的夥伴—靖天和瑜婷，靖天從我剛進實驗室沒多久就 以專題生的身分跟我做實驗，有他幫我一起做實驗還有一起討論如何解決難題，
使我的實驗得以順利進行；瑜婷的研究雖然和我大不相同，不過也是接續我的實 驗繼續研究下去，和她一起思考難題、一起做材料的研究合成，這些也都大大地 幫助了我，也使我的研究可以繼續下去。另外謝謝陪我走過來兩年的夥伴—亞東 和士翔，有你們的一起討論和互相扶持，使我順利了完成研究及論文；也謝謝實 驗室其他的夥伴—泓原、毓璞、霈恩、瑋玉、有衡、厚升、盈瑩，總是在我遇到 困難時可以跟我討論幫助我，並且把實驗室營造地這麼有和諧以及溫馨感，讓我 有深深地歸屬感，也讓我有實驗室是個大家庭的感覺，沒有一起吃中飯就是感覺 不對，實驗室出遊也讓大家的感情更深，讓實驗室更團結。
最後感謝我的家人，在我最無助的時候給了我避風港，時時給我鼓勵和正面 的回饋，謝謝你們陪我一路走到畢業。
李翊群謹致 民國 102 年 7 月
摘要
本研究主要致力於合成有磁性的中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)，利用它來固 定兩種酵素(纖維素水解酶、葡萄醣異構酶)做成可方便回收的催化劑，並使用架 接法接上磺酸官能基(SO3H)作為酸性催化劑。此三種催化劑應用於木質纖維素至 化學精緻品序列式轉換反應，以達到在水相和兩相(水相和有機相)中纖維素轉換 成 5-羥甲基糠醛的目的。
首先，我們合成了鑲嵌入氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子(Fe3O4-MSN)固定 化兩種酵素，也就是纖維素水解酶和葡萄醣異構酶，由於酵素昂貴，所以我們選 擇把它們固定化在基材上就可以利用磁鐵進行回收然後再次使用；此外，我們合 成了中孔洞氧化矽奈米粒子(MSN)，由於它表面上有很多的羥基(-OH)，可以利 用縮合反應和矽烷類形成化學鍵結使矽烷類被牢牢地固定在基材上，我們選擇的 矽烷尾端有硫氫酸根(-SH)，之後藉由氧化作用把官能基氧化成磺酸根(SO3H)，
就會形成酸度很高的固體催化劑，我們利用固態核磁共振儀定性且定量出有多少 磺酸根接上去；最後利用三種催化劑來做生質轉換，纖維素寡聚物為起始物，加 入已固定在基材上的纖維素水解酶，可以催化纖維素寡聚物水解成葡萄醣；回收 酵素調整 pH 值後，再加入固定在基材上葡萄醣異構酶催化葡萄醣異構化成果醣，
回收催化劑之後再加入有機溶劑二甲基亞碸(DMSO)使其形成兩相溶液，再加入 有修飾磺酸根的中孔洞氧化矽奈米粒子，催化果醣脫水成最終產物 5-羥甲基糠醛 (HMF)，此步驟為序列式反應。序列式反應的優點是可以藉由最佳化每個小步驟 的反應條件，使每個小步驟產物的產率達到最高，而上個步驟的產物是下個步驟 的反應物，如此下去可以讓最後的產物產率達到最大，而且藉由分開每個步驟也 可以使反應簡單化減少副產物的產生。在三種催化劑的催化下，可從果醣、葡萄 醣和纖維素寡聚物的轉化分別得到產率最高的 HMF 產率分別為 81.3%、46.1%
及 45.6%。這是第一次有研究報告利用序列式反應做纖維素的生質轉換。
關鍵字:纖維素水解酶、葡萄醣異構酶、氧化鐵、中孔洞氧化矽奈米粒子、5-羥 甲基糠醛、磺酸、二甲基亞碸、序列式反應
Abstract
This study focuses on the synthesis of magnetic mesoporous silica nanoparticles (MSN). We obtained two recyclable catalysts by utilizing magnetic mesoporous silica nanoparticles to immobilize two types of enzymes (cellulase and isomerase).
Furthermore, we functionalized mesoporous silica nanoparticles with sulfonic groups by a grafting method. By utilizing these three kinds of solid recyclable catalysts, we successfully converted cellulose to 5-hydroxymethylfurfural (HMF) in a bi-phase system via a sequential reaction.
First, because of the expensive price of enzymes, we tried to immobilize cellulase or isomerase on Fe3O4@MSN and recycle these catalysts using magnetic force. Second, we utilized mesoporous silica nanoparticles with many hydroxyl groups to functionalize them with sulfonic groups. We chose silane with thiol functional groups, and after performing a condensation reaction between the materials and silane, we oxidized the thiol groups to sulfonic groups. We could obtain acidic solid catalysts. Then we characterized functionalized the MSN by solid-state NMR to quantify how many sulfonic functional groups had been connected onto the solid materials. Finally, we utilized these three types of recyclable solid catalysts to conduct cellulosic bioconversion. We used pretreated cellulose as the reactant and immobilized cellulase on Fe3O4@MSN as the catalyst to hydrolyze cellulose to glucose. Then after recycling the solid catalysts using magnetic force and changing the buffer pH value, we added immobilized isomerase on Fe3O4@MSN as a catalyst to isomerize glucose to fructose. Finally, after recycling the recycle solid catalysts using magnetic force and adding an organic phase (DMSO), we added functionalized MSN (with sulfonic groups) as a catalyst to dehydrate fructose to HMF. This step-by-step reaction was called a sequential reaction. The advantage of this sequential reaction is that we can optimize the reaction conditions of each step, obtain
high product yields, and lower the production of by-products. By utilizing this sequential reaction, we were able to obtain a high yield of the final product. The HPLC results showed that the highest yield of HMF converted from fructose, glucose and pretreated cellulose were 81.3%, 46.1%, and 45.6%, respectively in the presence of the three solid catalysts. This is the first report on the generation of HMF from fructose, glucose, and pretreated cellulose via a sequential reaction with immobilized enzymes on magnetic mesoporous silica nanoparticles that are grafted with sulfonic groups.
Keywords: cellulase, isomerase, iron oxide, magnetic mesoporous silica nanoparticles, 5-hydroxymethylfurfural, sulfonic groups, DMSO, sequential reaction
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目錄
第一章：介紹... 1
1.1 從地球暖化到生質能源 ... 1
1.2 孔洞奈米材料 ... 6
1.3 生質轉換 ... 8
1.3.1 纖維素的前處理(使用離子液體) ... 8
1.3.2 纖維素水解酶水解纖維素機制與應用... 10
1.3.3 葡萄醣異構酶異構化葡萄醣的機制與應用... 12
1.3.4 果醣脫水轉化成 5-羥甲基糠醛之機制 ... 15
第二章、文獻回顧... 18
2.1.酵素... 18
2.1.1 中孔洞氧化矽奈米粒子固定酵素... 18
2.1.2 固定纖維素水解酶... 19
2.1.3 固定葡萄糖異構酶... 21
2.1.4 纖維素轉換成果醣... 23
2.2 纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛 ... 24
第三章：動機... 26
第四章：實驗... 29
4.1 材料... 29
4.1.1 化學藥品... 29
4.1.2 分析儀器... 31
4.2 合成固體催化劑 ... 32
4.2.1 合成氧化鐵奈米粒子... 32
4.2.2 合成含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子... 32
4.2.3 基材的合成... 33
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4.2.3.1 中孔洞氧化矽奈米粒子之合成... 33
4.2.3.2 中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化-接上磺酸官能基 ... 34
4.2.4 含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化-接上氨官能基 ... 35
4.2.5 含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之表面官能化-接上羧酸官能 基... 36
4.2.6 酵素的固定化(物理吸附) ... 37
4.2.7 酵素的固定化(化學鍵結) ... 38
4.3 連續式反應操作 ... 38
4.3.1 纖維素的前處理... 38
4.3.2 酵素的反應條件最佳化... 39
4.3.3 纖維素寡聚物至果醣的連續式反應... 39
4.3.4 纖維素寡聚物至 5-羥甲基糠醛的連續式反應 ... 40
4.3.5 材料的回收性及穩定性測試... 40
4.4 高性能液相層析儀分析(HPLC) ... 41
4.4.1 檢量線及滯留時間... 41
4.4.2 計算... 42
第五章：結果與討論... 43
5.1 材料鑑定 ... 43
5.1.1 磁性材料的形貌... 43
5.1.2. 中孔洞氧化矽奈米粒子之形貌... 44
5.1.3 孔的特性... 44
5.1.4 催化劑的鍵結量... 45
5.2 反應... 48
5.2.1 酵素的最佳化條件... 48
iii
5.2.1.1 纖維素水解酶的反應最佳化... 48
5.2.1.2 葡萄醣異構酶的反應條件最佳化... 49
5.2.2 酵素吸附量以及反應測試... 51
5.2.2.1 纖維素水解酶吸附量以及反應測試... 51
5.2.2.2 葡萄糖異構酶吸附量以及反應測試... 52
5.2.3 緩衝液的選擇... 52
5.2.4 利用物理吸附法固定酵素做反應... 55
5.2.4.1 利用固定在載體的纖維素水解酶做纖維素寡聚物到葡萄醣的反 應... 55
5.2.4.2 利用固定在載體的酵素做葡萄醣到果醣的反應... 56
5.2.5 利用化學鍵結法固定酵素後做反應... 57
5.2.6 纖維素寡聚物轉化成果醣的兩步驟反應... 58
5.2.7 果醣至 5-羥甲基糠醛之轉換 ... 59
5.2.8 葡萄糖至 5-羥甲基糠醛的序列式反應 ... 65
5.2.9 纖維素寡聚物轉化至 5-羥甲基糠醛之序列式反應 ... 66
第六章、結論... 67
第七章、未來展望... 68
參考文獻... 69
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圖目錄
圖 1.1 我國所排放的二氧化碳之來源 ... 1
圖 1.2 木質纖維素的成分以及組成 ... 4
圖 1.3 5-羥甲基糠醛之衍生物 ... 5
圖 1.4 纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛的過程 ... 6
圖 1.5 常見的離子液體 ... 9
圖 1.6 纖維素的結構-結晶區與非結晶區 ... 11
圖 1.7 內切型纖維素水解酶之作用區域 ... 11
圖 1.8 內切型纖維素水解酶與 β－葡萄糖苷脢之作用區域 ... 12
圖 1.9 含有磷酸根的葡萄糖異構酶異構機制 ... 13
圖 1.10 葡萄糖異構酶之催化機制 ... 15
圖 1.11 有質子酸存在下，果糖脫水成 5-搶甲基糠醛的催化反應 ... 16
圖 1.12 在二甲基亞碸中,果糖脫水形成 5-羥甲基糠醛的機制 ... 17
圖 2.1 聚氨脂泡沫塑料聚合機制 ... 24
圖 3.1 實驗動機-利用鑲嵌入氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子(Fe3O4@MSNs)當 基材並修飾不同酵素及官能基後用來做纖維素至 5-羥甲基糠醛的序列式反應 ... 28
圖 3.2 利用磁鐵分離磁性催化劑以及溶液 ... 28
圖 4.1 合成含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子之流程圖 ... 33
圖 4.2 合成中孔洞氧化矽奈米粒子 ... 34
圖 4.3 中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾磺酸官能基之流程圖 ... 35
圖 4.4 氧化鐵中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾氨官能基之流程圖 ... 36
圖 4.5 氧化鐵中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾羧酸官能基之流程圖 ... 37
圖 4.6 纖維素前處理流程圖 ... 39
圖 4.7 纖維素寡聚物至果醣的連續式反應流程圖 ... 40
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圖 5.1(左)鑲嵌有氧化鐵的中孔徑氧化矽奈米粒子之掃描式電子顯微鏡圖(右) 鑲嵌有氧化鐵的中孔徑氧化矽奈米粒子之穿隧式電子顯微鏡圖 ... 43 圖 5.2 中孔洞氧化矽奈米粒子之形貌 ... 44 圖 5.3(a)有磁性的中孔洞氧化矽奈米粒子之氮氣吸脫附曲線 (b)中孔洞氧化矽 奈米粒子之氮氣吸脫附曲線 ... 45 圖 5.4(a)中孔洞氧化矽奈米粒子接上磺酸官能基的碳譜分析(b)中孔洞氧化矽 奈米粒子的矽譜分析(c)中孔洞氧化矽奈米粒子接上磺酸官能基的碳譜分析 . 46 圖 5.5 在檸檬酸緩衝液系統下，以 0.015 克的纖維素寡聚物為反應物，做(a)反 應溫度的最佳化(b)酵素投入量的最佳化(c)反應時間的最佳化 ... 49 圖 5.6 在磷酸鈉緩衝液系統下，以 0.015 克的葡萄糖為反應物，做(a)反應溫度 的最佳化(b)酵素投入量的最佳化(c)反應時間的最佳化(d)反應環境 pH 值的最 佳化 ... 51 圖 5.7 利用固定在含有氧化鐵中孔徑氧化矽奈米粒子的纖維素水解酶(物理吸 附)做反應的穩定性以及回收性實驗 ... 56 圖 5.8 利用固定在含有氧化鐵中孔徑氧化矽奈米粒子的葡萄醣異構酶(物理吸 附)做反應的穩定性以及回收性實驗 ... 57 圖 5.9 用固定在含有氧化鐵中孔徑氧化矽奈米粒子的酵素(化學鍵結)做反應的 穩定性以及回收性實驗(藍色部分為纖維素水解酶，紅色部分為葡萄醣異構酶) ... 58 圖 5.10 纖維素轉化製果醣的兩步驟反應(a)藍色部分-使用含有氧化鐵的無孔洞 氧化矽奈米粒子做基材(b) 紅色部分-使用含有氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒 子做基材 ... 59 圖 5.11 在不同條件以及不同溶劑下做果醣至 5-羥甲基糠醛之轉換 ... 61 圖 5.12 溫度對於果醣轉至 5-羥甲基糠醛試驗之影響 ... 62
vi
表目錄
表一、IUPAC 分類孔洞材料 ... 7
表二、化學藥品 ... 29
表三、可能出現的化合物之滯留時間 ... 41
表四、轉化率、產率的定義以及計算方法 ... 42
表五、中孔洞氧化矽奈米粒子和接上磺酸根之後的性質 ... 47
表六、自由和固定在載體上的纖維素水解酶比較 ... 52
表七、自由和固定在載體上的葡萄醣異構酶比較 ... 52
表八、不同緩衝液對兩種酵素之影響 ... 54
表九、不同水相有機相體積比對果醣轉換至 5-羥甲基糠醛反應之影響 ... 63
表十、有無催化劑對果醣轉換至 5-羥甲基糠醛反應之影響 ... 64
表十一、催化劑投入量對果醣轉換至 5-羥甲基糠醛反應的影響 ... 64
表十二、葡萄醣轉換至 5-羥甲基糠醛之序列式反應 ... 66
表十三、纖維素寡聚物轉化至 5-羥甲基糠醛的序列式反應 ... 66
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第一章：介紹
1.1 從地球暖化到生質能源
自十八世紀工業革命以來，人們學會了怎麼從自然中獲取能源並作為動力的 來源。不過到了二十世紀來才發現，使用這些能源—如石油等等，獲取其中能源 的同時，也會排放出二氧化碳—也就是人們現在所熟知的溫室氣體。二氧化碳會 吸收太陽輻射到地球的紅外光，使地球保持一定溫度。不過因為排放了過多的二 氧化碳，會使地球的平均溫度漸漸升高。氣候變化政府間專家委員會(IPCC, 2001) 指出，全球平均表面溫度持續升高，氣候變遷跡象日趨顯著，若無法遏止，將嚴 重影響人類生存環境。美國太空總署也表示，北極和南極的冰層漸漸變小，消失 後海平面上升，地球恐怕面臨大災難。尤其是島嶼型國家的我們，如果海平面上 升恐怕會面臨國土被海水淹沒的危險，所以我們應該對於如何減少二氧化碳的排 放量有更多的對策才行。
從行政院環境保護署的資料顯示(圖 1.1)，大部分的二氧化碳來源是由於工 業所燃燒的石油為主，交通運輸方面，是因為燃燒汽油而產生的二氧化碳。燃燒 石油除了會排放對生物體來說不好的物質(一氧化氮等等)之外，也會對地球的環 境造成破壞。近年來，由於石油漸漸減少、利用石油所造成的氣候變遷的問題漸 漸被世人所重視以及世界對能源的需求越來越大，尋找替代能源是必要的。
圖 1.1 我國所排放的二氧化碳之來源
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替代能源很多，如太陽能、風力能、生質能、水力能、地熱能及海洋能……
等等。儘管如此，因為一些自然限制或者是地形風貌所影響，很多替代能源都沒 有辦法有效率地發展。替代能源中的其中一種—生質能，是一個非常有潛力且未 來是非常有前瞻性的一個替代能源。所謂生質—也就是生物質量(biomass)，它的 定義就是來自生命體的生物分子或有機物質，如農林業所產生的木屑、稻桿稻殼、
動物屍體、廢水所來的沼氣……等等。簡單地來說，生質能就是藉由燃燒以碳元 素為基礎的生質分子後所得到的能源，雖然過程中也會排放二氧化碳，不過這些 二氧化碳會經由周期循環再次回到生物體中(藉由植物的光合作用使二氧化碳再 被消耗)而產生生質質量，藉由這個消耗與產生的循環，對於二氧化碳的總排放 量為零，所以生質能是非常適合發展下去且一個乾淨的能源。
生質能源目前從材料取得來源分類分成第一代、第二代及第三代。第一代生 質能源指的就是利用玉米、大豆及甘蔗這些經濟作物來取得能源。由於玉米和甘 蔗主要的成分是澱粉，澱粉經過水解後產生葡萄醣後，再經由發酵作用轉化成生 質酒精；此外大豆可以取出油脂做成生質燃油。得到的這些生質酒精或生質燃油 可以跟目前汽車使用的汽油混和，這樣就可以減少汽油的使用量，此外燃燒汽油 產生的空氣汙染氣體(如硫化物)可以減少，燃燒酒精反而更乾淨，讓第一代生質 能源在十幾年前開始有了蓬勃的發展。
不過第一代生質能源卻衍生出許多問題。首先，第一代生質能源的來源主要 是玉米、大豆及甘蔗，這些東西本身就是人類可以吃的東西；由於世界人口數激 增許多，糧食需要量增加，拿這些糧食作物來做成能源使用確實是不太恰當的；
此外，根據經濟部能源局報導指出，種植這些作物需很大的耕種面積，巴西已經 要砍掉雨林增加耕地面積來種植這些作物，這反而是本末倒置，雨林本身可以使 二氧化碳量下降，砍伐掉會使二氧化碳的消耗率下降許多而且還會使生態環境遭 到破壞；另外因為要大量種植這些作物，會使用很多的化學肥料，其中化學肥料 的成分之一氮會形成一氧化二氮(N2O)排出，此氣體的全球增溫趨勢(GWP,global
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warming potential)為二氧化碳的 296 倍，是非常驚人的；最後一點就是所產出來 的生質酒精的能量密度不高(生質酒精:23 (MJ/L), 汽油:35 (MJ/L))。綜合以上這 幾點，第一代生質能源並不適合發展，目前取而代之的就是第二代生質能源。
第二代生質能源，使用的原料為廢棄的木材、稻桿稻殼……等等，構成這些 東西的主要成分為木質纖維素(lignocellulose)，木質纖維素的成分如圖 1.2 所示
1，木質纖維素主要是由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)以及木質素 (lignin)所組成。纖維素佔木質纖維素的含量約為 40~50%，是木質纖維素中佔大 部分的成分，由單體葡萄醣脫水形成 1,4-β 醣苷鍵(1,4-β-glycosidic bond)所聚合而 成的聚合物，可以藉由酸催化水解或是酵素分解纖維素來產生葡萄醣。纖維素是 一個非常巨大的結構，每一層的葡萄醣脫水聚合成鏈狀聚合物後，層和層之間還 會形成氫鍵，使其結構非常穩定且巨大。由於其單體非常單純，常常被拿來做有 關生質能源方面研究之起始物。
半纖維素，是由兩種或兩種以上的五碳醣及六碳醣脫水形成的聚合物，單體 主要為木醣(xylose)、阿拉伯醣(arabinose)、甘露醣(mannose)以及半乳醣(galactose) 等等，脫水形成鏈狀聚合物之後，層跟層之間也會形成氫鍵使半纖維素變成一個 巨大的分子，且非常穩定。由於其單體非常複雜，不常被拿來做為生質能的研究。
有 研 究 利 用 半 纖 維 素 水 解 成 單 體 並 拿 來 發 酵 成 生 質 酒 精 或 是 製 造 糠 醛 (furfural)2,3。
木質素佔木質纖維素中含量最少，約為 15~25%，是由苯基丙烷的衍生物所 聚合而成，這些衍生物主要是酚類，經由分子間互相脫水聚合而成。物性和化性 都非常穩定，也很難水解，就算用極端條件(高溫高壓)把它分解完之後也是含有 很多種分子，純化很困難，要拿來做生質能相關的研究也是非常稀少4。
綜合以上介紹可以知道，如果要拿木質纖維素做生質能源的研究，會先選擇 纖維素做起始物，除了它的含量佔大部分之外，主要也是因為它水解後的單體很
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單純，就是葡萄醣，不像半纖維素或是木質素水解之後單體非常的複雜，除了反 應很難單一化之外，產物也會趨向於複雜。
圖 1.2 木質纖維素的成分以及組成
第三代生質能源是利用藻類當作起始物，由於藻類很多油脂，可以利用這些 油脂做轉酯化(transesterfication)，形成脂肪酸酯類，也就是生質柴油，目前這項 技術很新，還在發展中，且由於各種藻類的來源關係，會造成油脂的含量有很大 的差異。
以纖維素為起始物，經由水解後得到葡萄醣，接著異構化成果醣之後，就可 以脫水形成呋喃(furan)衍生物，如 5-羥甲基糠醛(5-hydroxyMethylfurfural,
5-HMF)。5-羥甲基糠醛，是從木質纖維素得到的其中一種衍生物，被美國能源 總署(DOE)評為是最有價值的化合物。原因是它是生物質量和有潛力的化合物中 間的橋樑，只要生成 5-羥甲基糠醛，可以經由很簡單的步驟變成一些非常有經濟
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價值的化合物。如圖 1.3 所示 5，只要經過簡單的氧化步驟就可以生成 2,5-呋喃 二甲酸，它常常被用在工業上來做聚酯類的聚合物；經過加氫和氫解作用則可以 形成 2,5-二甲基呋喃，它是目前最適合用來做生質燃料的化合物，它是液體、能 量密度高達 31.5(MJ/kg)，比生質酒精高出約 40%，約為現在汽油的 80%，基於 這些因素，目前有很多研究都在投入如何從木質纖維素量產 2,5-二甲基呋喃 6； 行水合反應的話會產生乙酰丙酸(levulinic acid)，可以做成顯影劑，或是加甲醇之 後可以形成酯類做高分子；加氫反應可以得到 2,5-呋喃二甲醇，應用在製造泡棉 或是聚脂類。
圖 1.3 5-羥甲基糠醛之衍生物
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5-羥甲基糠醛是由纖維素水解成葡萄醣，葡萄醣異構化成果醣之後脫水而得，
過程中需要很多勻相和非勻相的催化劑 7-10。過程如圖 1.4 所示，首先，纖維素 先藉由離子液體的作用打斷氫鍵，讓層跟層分離，形成鏈狀聚合物11；纖維素寡 聚物藉由酸催化或是酵素水解，打斷 1,4-β 醣苷鍵形成葡萄醣 12,13；葡萄醣藉由 酵素或是鹼催化異構化成果醣14,15；最後藉由果醣脫水成 5-羥甲基糠醛16。也有 研究團隊直接合成多官能基的催化劑使纖維素直接轉換成 5-羥甲基糠醛，這個反 應是個多步驟多路徑的催化反應。
圖 1.4 纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛的過程
1.2 孔洞奈米材料
自從二十世紀中葉開始，以氧化矽為基底的孔洞奈米材料已經被大家熟悉，
並大規模的生產及使用。因為它的高比表面積，常常被人們用來做吸附的基材來 吸附染料或一些催化劑；而且它有非常穩定的結構，對溫度、水氣還有物理機械 力都有一定的耐性；而且它非常容易做表面改質，可以賦予它親水性、疏水性及 酸鹼性等等。從國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)的分類來說，我們可以依照
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它們的平均孔洞半徑把它們分類為三種不同的範疇，分別是微孔(microporous)、
中孔(mesoporous)及大孔(macroporous)。分類的條件以及例子詳見表一
表一、IUPAC 分類孔洞材料
材料種類 孔洞大小(直徑) (nm) 例子
大孔洞 直徑>50 玻璃
中孔洞 2<直徑<50 氣凝膠、M41S
微孔洞 直徑<2 沸石、沸石型活性碳
第一個被發現並廣泛利用的孔洞材料是沸石。沸石在 1756 年首先為瑞典礦 冶學家克朗斯提（B. Cronstedt）發現，它是一種低密度軟性的礦石，由氧化矽、
氧化鋁與鹼在壓力下作用所形成的結晶性矽鋁酸鹽。它是孔洞性材料，孔洞性質 是微孔洞結構，因為其比表面積很大的原因，被人們廣泛用在吸附劑、淨水劑。
另外沸石是路易士酸，也常常被用來使用在有關酸的催化反應上；目前最新的應 用是拿沸石來當分子篩，可以過濾或吸附掉一些不純的物質。
1990 年代，在孔洞材料有一個很重大的突破，就是發現了有規律性的排列 以及比較大孔洞的中孔徑氧化矽材料，是由日本早稻田大學的黑田團隊17所合成 出來的材料，受到世界廣大的回響。在這之前，藉由形成介面活性劑的微胞以及 利用無機化合物這兩者之間的作用，合成了 M41S 系列的中孔洞氧化矽材料，如 有六角形結構的 MCM-4118、有立方體結構的 MCM-4819等等，之後利用不同的 矽來源和不同的介面活性劑所形成的中孔洞氧化矽粒子如雨後春筍般地冒出，研 究團隊也會利用這些材料來達到他們的各種目的。
到目前為止，由於它的高比表面積以及很容易修飾的表面和堅固的架構，在 催化領域中利用中孔洞氧化矽奈米粒子(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)當 作載體或是催化劑已經非常普遍，是一個非常有發展潛力的基材。最近的研究團
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隊甚至把氧化矽換掉，換成氧化鈦形成中孔洞氧化鈦奈米粒子(MTNs)拿來做酸 的催化反應或者是光觸媒的應用；也有團隊換成碳形成中孔洞 碳奈米粒子 (MCNs)，由於碳是疏水的，所以此材料可以用來做需要隔離水的反應，種種的 發展是具有展望性的。
1.3 生質轉換
1.3.1 纖維素的前處理(使用離子液體)
纖維素，是由葡萄醣分子間經脫水作用形成 1,4-β 醣苷鍵，藉由此鍵結連接 成鏈狀聚合物，接著再由各個鏈狀聚合物間形成分子間氫鍵，形成一個 3D 的網 狀固態結晶結構，性質非常安定20。纖維素可以藉由無機酸幫助水解成單體葡萄 醣，不過用無機酸水解的話，葡萄醣很容易再轉化成別的副產物或者是過反應，
產生糠醛類的副產物或是腐黑質(humin)；且纖維素為結晶結構也不易溶於水溶 液中；另外使用無機酸的話很容易腐蝕容器壁，對於工業化來說是非常不利的；
還有廢酸的排放也是一個嚴重問題，綜合以上來說，工業上並不適合利用無機酸 水解葡萄醣，會增加非常多的成本。為了解決以上的問題，利用酵素來催化分解 是一個非常好的解決辦法。然而卻發現幾個問題21，因為纖維素為生物性高分子 而且是結晶結構，它很不溶於溶液裡面，所以會大幅度地降低反應速率；另外酵 素是需要先吸附在纖維素上面，破壞纖維素的晶體結構，也就是打斷層和層之間 的氫鍵，之後才能繼續打斷葡萄醣和葡萄醣之間的 1,4-β 醣苷鍵，這個就是酵素 作用的機制，由於纖維素是個緊密的網狀結構以及疏水的特性，要酵素吸附上去 已經是難上加難，何況是進入纖維素層和層之間。根據以上這些難題，如果要使 用酵素當做催化劑，必須先把纖維素做前處理，先把層和層的氫鍵先打斷，這樣 纖維素會比較易溶於水，溶於水後酵素就很容易地擴散到表面進行打斷 1,4-β 醣 苷鍵的作用，讓單體葡萄醣釋放出來21。
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纖維素難溶於水溶液及有機溶液中，能稍溶解的溶液屈指可數，例如；銅銨 溶液(Cu(NH3)4(OH)2)，這個溶液可以使纖維素稍稍膨脹，待膨脹後再加入電解質 讓它們解離並滲入層與層之間破壞氫鍵，此過程非常緩慢，這個非常難解的課題 到離子液體被發現且被應用在溶解纖維素後才解決。離子液體(ionic liquid)，就 是在室溫或是室溫附近呈現液態且由離子所構成的分子。普通的離子化合物因為 陰離子和陽離子體積甚差不遠，導致陰陽離子間的庫侖力很大，要在很高溫的溫 度才可以迫使離子化合物變成液態(800 度以上)；如圖 1.5 所示(舉出常見的兩個 例子)，離子液體因為陽離子大部分為有機之陽離子，結構非常大，然而陰離子 大部分是小離子，如氯離子，兩者結合成的離子化合物因體積相差甚遠而導致其 庫侖力降低許多，故可以在室溫或是約 100 度附近就可溶解22。離子液體只要稍 微加熱就會解離成離子，由於離子的半徑很小，所以可以穿梭至纖維素層和層之 間。以[EMIM]Cl 離子液體為例，在水中會解離成[EMIM]+和氯離子，氯離子很 小可以穿進纖維素的層與層之間利用靜電吸引力把氫鍵破壞，讓層和層之間的作 用力消失，使纖維素變成鏈狀聚合物，也就是纖維素寡聚物，它在水中的溶解度 比纖維素還要大，且酵素就可以只做破壞 1,4-β 醣苷鍵這件工作，而釋放出單體 葡萄醣出來。
圖 1.5 常見的離子液體
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綜合以上說明，我們可以知道，如果要使用酵素來當催化劑的話，纖維素做 前處理是必要的，可以節省下非常多的反應時間。雖然離子液體剛被發現時因為 稀少而價格很貴，可是現在已經可以由自己合成出離子液體23或者是已經合成出 常溫下就可以解離成離子態的離子液體24，此部分對於要工業化來說是非常有利 的，省下不少成本。
1.3.2 纖維素水解酶水解纖維素機制與應用
纖維素水解酶本來是細胞體內的酵素，用來分解纖維素變成單體葡萄醣，在 1960 年代後被發現可以製作成細胞外酵素後，被視為可以將固體廢棄物轉換成 食物來源的重要媒介 25。本研究的纖維素水解酶由 Trichoderma reesei 這個菌種 所產生且提煉出來的。纖維素水解酶它是由三種不同的水解酶群所構成，包含了 內切型纖維素水解脢（Endo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.4.）、外切型纖維素水解脢
（Exo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.91）與 β－葡萄糖苷脢（β-glucosidase, E.C.
3.2.1.21）26。內切型纖維素水解酶的作用是切除纖維素內部的非結晶區、隨機切 斷 1,4-β 醣苷鍵後產生長鏈或短鏈的寡醣27；外切型纖維素水解脢用於分解纖維 素的結晶區，可以把纖維素有規律地切成纖維雙醣，此兩種酵素群互相配合把纖 維素大分子切成小碎塊 28,29；β－葡萄糖苷脢的作用對象是纖維雙醣或是短鏈的 寡醣，切斷 1,4-β 醣苷鍵後產生單體葡萄醣30。
纖 維 素 水 解 酶 水 解 纖 維 素 鏈 狀 聚 合 物 ( 已 前 處 理 過 的 纖 維 素 ) 機 制 如 圖 1.6~1.8 所示26。圖 1.6 描繪出了纖維素的結晶區和非結晶區，之後如圖 1.7 所示，
首先是內切型纖維素水解酶先將非結晶區打斷成長鏈或短鏈寡醣，接下來到圖 1.8，外切型纖維素水解酶進來破壞掉結晶區的纖維素或剛剛已形成的長鏈或短 鏈的寡醣切成纖維雙醣，最後再由β－葡萄糖苷脢把纖維雙醣切成單體葡萄醣。
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圖 1.6 纖維素的結構-結晶區與非結晶區
圖 1.7 內切型纖維素水解酶之作用區域
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圖 1.8 內切型纖維素水解酶與 β－葡萄糖苷脢之作用區域
目前主要對於纖維素水解酶的研究是關於用很多模型去模擬纖維素水解酶 和結晶型纖維素如何作用以用來設計更好的反應條件31；如何大量生產纖維素水 解酶或是如何用基因改造讓纖維素水解酶的效率更高或是有多重功能性 32,33 以 及使用不同菌種生產纖維素水解酶並互相比較其效率34,35。目前也已有工廠可以 生產大量纖維素水解酶，使製造生質能的成本可以降低並使其工業化。
1.3.3 葡萄醣異構酶異構化葡萄醣的機制與應用
異構酶，是一種催化同分異構物互相轉換的酶，有催化消除旋光度的消旋酶、
催化順反異構物轉換的順反異構酶、催化分子內氧化還原的氧化還原酶……等等。
葡萄醣異構酶(glucose isomerase)，是一種催化葡萄醣異構化成果醣的異構酶，全 名叫做 D-木醣-醛醣-酮醣異構酶(D-xylose aldose-ketose-isomerase)，本來此酵素 是用來催化木醣(xylose)變成木酮醣(xylulose)，之後發現也可以用來催化葡萄醣 (醛醣)異構化成果醣(酮醣)而被人們廣泛的使用。
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本研究所使用的葡萄醣異構酶是由 Streptomyces rubiginosus 這個菌種提煉 出來的，雖然從各菌種提煉出的葡萄醣異構酶主要催化性都差不多，不過所透過 的機制卻完全不同，所以導致每種酵素的催化效率也不一樣。
葡萄醣異構酶通常需要的反應條件為中性至微鹼性，且有金屬二價離子的環 境會更好，通常需要的是鎂離子、鈷離子或錳離子36,37。這些離子都可以幫助葡 萄醣異構酶的維持構型，藉由離子的正電和酵素形成吸引力來穩定酵素的構型以 維持酵素的活性，鎂離子還有活化葡萄醣異構酶的功用38；另外，如果溶液裡面 含有鈣離子、鋅離子……等等這些，則會降低葡萄醣異構酶的活性，甚至使葡萄 醣異構酶失去活性39。
葡萄醣異構酶把葡萄醣異構化成果醣的機制，會因為酶的種類不同而有很大 的差異。如其中一種含有磷酸官能基的葡萄糖異構酶，它會催化葡萄醣進行烯二 醇(enediol)機制之後轉變成果醣 38。如圖 1.9 所示，此種葡萄醣異構酶中的組胺 酸(histidine)會參與催化的機制，首先在鹼性的溶液中有氫氧根離子(OH-,圖中代 號為 B)，會先取走下方氫離子，而鍵結電子會形成孤對電子，會被迫推到中間 的碳-碳鍵中形成烯類，上方尾端醛基氧的雙鍵被迫推出去形成氧離子(O-)，會把 鄰近葡萄醣異構酶中，組胺酸的氫離子取過來形成尾端羥基，這樣就形成中間體，
也就是順式的烯二醇類；接著組胺酸會催化把下方羥基的氫離子拿走，孤對電子 跑到碳-氧鍵中形成雙鍵，而碳-碳雙鍵的電子就會被擠壓到上方的碳形成孤對電 子，此孤對電子會把水中的氫離子搶回來，形成最右邊的酮醣。
圖 1.9 含有磷酸根的葡萄糖異構酶異構機制
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本研究使用的葡萄醣異構酶在催化葡萄醣異構化成果醣時所經過的機制是 另外一種，叫做氫陰離子轉移機制(hydride shift mechanism)。根據文獻的研究，
結果圖 1.10 所示40，可以看到的是，酵素分子中間有二價錳離子(錳離子存在於 緩衝液中，鎂離子也有此功用)，和酵素分子內產生吸引力而穩定酵素結構；首 先水分子和錳離子、葡萄醣異構酶中含羧酸離子(COO-)的部分以及葡萄醣分子產 生氫鍵，以固定葡萄醣分子；羧酸離子會搶走水分子的氫離子產生氫氧根離子，
接下來氫氧根離子又會把葡萄醣上的羥基之氫離子搶回來形成水分子，葡萄醣分 子上就形成氧離子(O-)，氧離子的孤對電子不穩定，直接下移形成碳氧雙鍵；而 這個碳上就會多一鍵形成五鍵，瞬間氫陰離子就會脫離出去到尾端醛基的碳上，
而尾端醛基的雙鍵就會被推出去形成孤對電子在尾端的氧上，此時酮基產生而尾 端有氧離子；接下來氧離子就會搶走水的氫離子形成羥基，而水形成氫氧根離子，
然後氫氧根離子搶走葡萄醣異構酶上羧酸(COOH)的氫離子形成水分子，羧酸回 復成羧酸根離子(COO-)。
由此兩種催化機制我們可以看到，如果反應環境下有在鹼性下，也就是溶液 中含有氫氧根離子，可以幫助尾端的氫被取走，接著一連串的異構化反應就會發 生；另外從第二個機制也可以看到，二價陽離子可以和酵素中的分子有吸引力可 以固定酵素構型，同時也可以抓住水分子和葡萄醣分子。
目前葡萄醣異構酶已經被固定在基材上，並大量生產應用到工業上。現在食 品工業都用以固定在基材上的葡萄醣異構酶生產高果糖糖漿41；另外也看到有研 究用葡萄醣異構酶來異構化很多不同的醛醣至酮醣的反應並討論其效率42。
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圖 1.10 葡萄糖異構酶之催化機制
1.3.4 果醣脫水轉化成 5-羥甲基糠醛之機制
果醣在酸性環境的催化下會脫水成 5-羥甲基糠醛，其催化機制非常複雜，而 且也有另外一些催化劑會走不同的催化路線到最終產物。酸催化的機制如圖 1.11 所示43，果醣分子在水中成五圓環結構，藉由一個質子酸催化，鍵結在一個羥基 上，形成 H2O+這個不穩定結構，會脫去水分子而使正電留在分子內轉移，最後 都會跑到羥基上，和氫原子一起轉移到另一個羥基上再次形成 H2O+的結構，一
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樣脫去水，此動作三次之後，到環內形成兩個雙鍵後才會把正電給中和掉並形成 穩定結構的 5-羥甲基糠醛。
圖 1.11 有質子酸存在下，果糖脫水成 5-搶甲基糠醛的催化反應
由以上結論我們可以知道，果醣脫去三個水之後會形成 5-羥甲基糠醛，所以 我們對於反應系統選擇是非常重要的。既然是脫水反應，所以我們應當選擇有機 溶劑作為反應時的溶劑，脫水之後水和有機層會分相，5-羥甲基糠醛會傾向於溶 在有機相。另外我們選擇的溶劑可能也有幫助催化此反應的功用，例如選擇二甲 基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)當作溶劑，由於此分子有硫的孤對電子對，有
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很強吸引力的原子存在，就可以引發電子對的轉移而促進果醣分子脫水產生 5- 羥甲基糠醛。二甲基亞碸當作催化劑的機制如圖 1.12 所示 44，溶劑分子的硫和 羥基發生作用產生鍵結，之後脫去氫離子和氫氧根離子(脫去水)，接著利用溶劑 分子中的雙鍵氧分子和羥基的氫原子發生作用，電子對的轉移，接著在脫去兩個 水也同時形成環狀中的兩雙鍵。
圖 1.12 在二甲基亞碸中,果糖脫水形成 5-羥甲基糠醛的機制
綜合以上論點可以得到結論，如果在二甲基亞碸系統下再加上酸的催化，果 糖轉換成 5-羥甲基糠醛的反應將會進行得很順利且很快速；不過在這個系統我們 很難得知到底是溶劑的影響還是催化劑的影響；另外常用在此脫水反應的溶劑有 四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)、1-丁醇等等這些有機溶劑，使用這些溶劑我們可 以知道酸催化劑對此反應的影響及貢獻。
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第二章、文獻回顧
2.1.酵素
2.1.1 中孔洞氧化矽奈米粒子固定酵素
中孔洞氧化矽奈米粒子(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)由於它擁有堅 固的結構、高比表面積以及適合的孔洞半徑這些優勢，常常用於負載催化劑45、 分子篩46、藥物釋放47,48、生物醫療49以及吸附劑50,51等等。但是最近它多半被 用來做酵素的載體52，原因是之前多半是用溶膠類來固定酵素，而它沒有孔洞且 會因為加入交聯劑(crosslink agent)而使酵素失去活性；利用中孔徑氧化矽奈米粒 子的話則可以讓酵素被吸附在孔洞裏面而保護酵素，而且也可以固定構型不會讓 酵素因為外力變形而失去活性，甚至可以使中孔洞氧化矽奈米粒子表面修飾不同 的官能基來鍵結不同的酵素上去；綜合以上原因53，中孔洞氧化矽奈米粒子是非 常適合來做酵素載體。
有關中孔徑氧化矽奈米粒子用來做酵素固定的文章最早是 2000 年發表在化 學材料期刊上 54，Takahashi 團隊比較三種不同製程所得到的中孔徑氧化矽奈米 粒子，並有各種不同的孔洞半徑，用來吸附辣根植物所提煉出來的過氧化酶 (horseradish peroxidase)。此種酵素的作用是放大某些目標分子的偵測訊號，就算 是很弱的訊號也可以藉由酵素催化後訊號變強以至於偵測得出來，是個非常有用 的酵素；得到的結論是大概約五奈米的孔洞大小可以利用物理吸附法固定最多此 種酵素(因為太大孔洞會很容易脫附；而太小孔洞則根本固定不上去)；這種酵素 在基材裡面一樣可以維持很高的活性及增加了對熱的穩定性。雖然此篇文章的內 容沒有討論到多次實驗的回收性或是其他固定方法，不過得知酵素固定在中孔徑 氧化矽奈米粒子裡面卻可以維持高活性以及提高耐熱性這兩件事，是非常重要的，
也為之後利用此基材固定酵素的研究奠定了重要的里程碑。
之後的研究就在如何固定更多酵素上去、如何讓酵素不脫落以及如何讓酵素 在載體上更穩定，漸漸固定不同種酵素上去，研究其特性也變的很多；在文獻中
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使 用 過 的 酵 素 例 如 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶 55(subtilisin, 蛋 白 質 水 解 酵 素 ) 、 溶 菌 酶
56(lysozyme) 、 細 胞 色 素 C56(cytochrome C) 、 超 氧 化 物 歧 化 酶 57(Superoxide Dismutase)、纖維素水解酶 12,58(cellulase)……等等；上述方法都是使用物理吸附 方法，也有研究使用表面修飾官能基的中孔洞氧化矽奈米粒子來當基材化學鍵結 酵素 59、利用交聯法(crosslinking)來固定酵素 60……等等。最近有關於酵素和中 孔徑奈米矽材的主要應用則是用在生物感測器上居多61,62。
目前沒有人做過利用中孔洞氧化矽奈米粒子來固定葡萄糖異構酶的實驗，雖 然已經有市售固定在基材上的葡萄醣異構酶，如果可以比較市售的酵素和我們的 固體生物催化劑就是一個非常值得研究的客題。
2.1.2 固定纖維素水解酶
纖維素水解酶是一個廣泛被利用的酵素，同時它也被視為生質能源實現的重 要鑰匙，因為它可以把龐大的纖維素組織水解成單體葡萄醣，這個步驟看似簡單 卻是最重要的步驟，纖維素水解酶的重要性可見一般；不過很明顯的就是，如果 要發展生質能源的話，必須大量使用纖維素水解酶，在這個觀念剛開始出現的時 候酵素的生產是非常昂貴的，所以必須要固定酵素在基材上，盡量讓它可以回收 並做有效地利用。
第一個研究纖維素水解酶固定化在基材上的是 Frein 團隊63，它是利用暗紅 色的海藻提煉出來的海藻膠(kappa-carrageenan)當作基材來固定纖維素水解酶，
此研究做了一些基本的測試，都可以保持酵素的活性可是效率卻不高；另外 Kashiwagi 團隊研究利用已活化的瓊脂膠(接上 CNBr, cyanogen-bromide activated sepharose)，和纖維素水解酶產生交聯，並做其活性及回收率的探討 64，可以推 測到的是，利用交聯法固定的酵素一定會部分失去活性；Kumakura 團隊65直接 把生產纖維素水解酶的菌種和聚合物的單體混合在一起並泡在培養液中，由於這 個單體是屬於輻射聚合型，也就是只要照射一定的強度的輻射，就會開始產生聚
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合物，聚合物就是菌種的固定基材，而菌種只要給一定的養分和環境就會開始產 生纖維素水解酶，此方法有個很大的優點，就是產生的纖維素水解酶或許不會因 為聚合作用而失去活性而且如果纖維素水解酶脫附的話還可以補充新的，是個不 錯的想法，不過缺點是菌種可能因為聚合作用或是輻射照射而死亡，而且由結果 可以知道葡萄醣的產率大概只有 20%，雖然結果並沒有很好不過卻是創新的點 子。
Takeuchi 團隊66利用麩胺酸聚合物(Poly-glutamic Acid)當作基材來固定纖維 素水解酶，此基材有一個優勢，就是它是水溶性的，可以在中性或鹼性環境之下 溶於水中，此反應就變成勻相反應可以增加催化劑和反應物的碰觸以提高反應效 率，反應完如果要回收催化劑則把溶液調整成酸性，此基材就會沉澱出來方便回 收，此方法是利用化學鍵結的方法固定酵素，也就是和酵素形成鍵結以確保酵素 在基材上，可惜葡萄醣產率還是不夠高而且定酵素的量偏少；Jain 團隊把基材換 成尼龍(nylon)，一樣用形成醯胺鍵(peptide bond)的方法來固定酵素並做測試，結 果也是差不多67；也有團隊利用甲殼素(chitosan)68、矽晶圓上69等等。
綜合以上幾點，纖維素水解酶被固定在很多種不同的基材上，由於那些都是 沒有孔洞的材料，所以物理吸附是不可能的；此外，也都只在基材上表面修飾官 能基或是利用交聯法來和酵素形成化學鍵結固定，除了酵素可能會受到化學藥物 影響而失去活性之外，也有可能因為固定在基材的表面沒有任何保護而很容易失 去活性，所以本研究會使用中孔洞氧化矽奈米粒子做研究就是因為有孔洞的話可 以提供酵素一個環境讓它受到保護不至於構型被破壞；而且有孔洞的話大大提高 表面積使可以鍵結上去的酵素或是吸附上去的酵素多更多，這些都是孔洞材料比 起以前的基材好用的地方。
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2.1.3 固定葡萄糖異構酶
自從研究上發現葡萄醣異構酶這個酵素之後，大家就把焦點放在這個酵素的 使用上，因為它可以使葡萄醣部分異構化成果醣，但是果醣產率通常只有 50~60%
，主要是因為葡萄糖和果醣互為異構物，熱力學上的平衡使它們最多可以有約一 半同分異構物存在，就算有酵素的催化頂多也是到 70%的果醣產率70，在工業是 則是為了要節省成本，把反應溫度下降，使果醣產率為 50%即可，而且 50%產 率果糖和 50%葡萄醣混合物即為高果醣醣漿，甜度夠已經可以作為食品添加劑，
所以從很早開始就有研究致力於如何把葡萄醣異構酶固定在基材上以方便做回 收再利用。
目前文獻中最早固定化葡萄醣異構酶的研究是 Gerald.W 團隊71在 1971 年所 發表的論文中，可以看到他們先最佳化葡萄醣異構酶的反應條件，接著把它固定 化在聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)這個聚合物膠上，首先他們先把丙烯酰胺單體和 交聯劑還有葡萄醣異構酶的單體混和均勻，接著只要照射遠紅外光就可以使單體 聚合並同時把酵素固定下來，此方法就是交聯法或是叫共沉澱法，接著還測試了 鎂離子和鈷離子對酵素的影響，由圖表可以看出，果糖的產率大概為 54%，不過 由內文可以得知，雖然有部分葡萄糖異構酶鍵結上去，不過保留活性的酵素卻只 有 30%，表示了雖然接很多酵素上去但是大部分去處於失去活性狀態，果醣產率 雖然有維持在一半以上不過這個結果卻不是我們所樂見的；由此可得知此方法並 不太適用於固定化酵素。
Yokote 團隊 72則利用酚甲醛樹脂作為基材做葡萄醣異構酶固定化之研究。
由於酚甲醛樹脂是個孔洞材料，所以只要利用物理吸附原理就可以吸附葡萄醣異 構酶上去，此篇研究有計算出吸附上去量多少、並對此固體催化劑做反應的最佳 化條件及離子的影響，探討動力學並計算出動力學的常數，此篇研究已經開始在 對孔洞材料固定葡萄醣異構酶這件事有很多的著墨，發現利用物理吸附似乎可以
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保持酵素很高的活性，不過此研究並沒有做回收固體催化劑的實驗，雖然不知道 其效果如何，不果此篇研究開啟了孔洞材料吸附酵素的領域。
接著有學者就有想法，我們需要的是孔洞材料、並有孔洞可以提供酵素吸附 且有堅固的架構，很多學者就想到了利用二氧化矽來做基材73,74，這些研究團隊 或者是利用有孔洞的玻璃、或者是無孔洞的氧化矽當作固定酵素之基材，並利用 戊二醛這個交聯劑，使材料和酵素產生化學鍵結，之後再做利用；此方法已經改 良了很多以前不好的缺點，不過還是有稍嫌不足的地方，例如孔洞材料的選擇，
選擇了孔太大的材料，因為孔太大會使酵素很容易的脫附，這樣會使物理吸附酵 素無法達到有效的應用；另外還有使用戊二醛這個交聯劑，雖然它可以讓材料表 面和酵素之間做鍵結，不過材料表面如果沒有氨基的話是無法跟戊二醛產生鍵結；
此外利用戊二醛最大的缺點就是此分子的兩頭都是一樣的醛基都可以和酵素做 鍵結，一定會出現戊二醛兩頭都接上葡萄醣異構酶這種分子，難保戊二醛分子都 是一頭接基材另一頭接上酵素。此兩個研究都固定葡萄糖異構酶上去，不過葡萄 醣異構酶的活性卻只保留一半，這也是說明了戊二醛這個交聯劑的缺陷。
還有一些研究團隊是想做出連續反應的固體生物催化劑，就拿氧化鋁的孔洞 管柱吸附酵素 75；另外還有利用二乙氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose)這個基材
76，因為此基材表面有氨基會帶正電，利用靜電吸引力可以吸引葡萄醣異構酶中 帶負電的結構，使其固定化，此方法的回收次數可以達到 3~4 次，而且如果酵素 脫附的話還可以再利用新的一批自由酵素做靜電吸引力的吸附，所以可以達到再 生催化劑的效果；也有利用幾丁質(chitin)做基材，並加入戊二醛當作交聯劑固定 葡萄糖異構酶77。
現在工業上用的固定化葡萄醣異構酶是叫做 Sweetzyme IT，最近目前的研究 就是集中於利用現有的市售酵素來研究它的動力學性質78、如何利用改變外在條 件來使葡萄醣異構酶達到更高的效率79、如何找到一個基材是可以減少固定酵素
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上去之後失去活性的數量 14 以及用數值模擬方法來達到最高葡萄醣異構酶的效 率80。
綜合以上文獻內容，可以得知葡萄醣異構酶雖然可以被固定化，不過因為可 能利用物理吸附可能很快會脫附、利用靜電吸引力力量會不足、利用戊二醛法固 定會使酵素失去活性以及利用共沉澱法會使酵素失去活性的這些缺點，本研究選 擇利用中孔洞氧化矽奈米粒子來作為基材，它具有適當的孔洞半徑，可以讓物理 吸附上去的酵素好好地留在孔洞中；加入氧化鐵則可以改良一些回收的缺失。
2.1.4 纖維素轉換成果醣
有關於纖維素一步驟轉換成果醣的文獻非常的少，其中大部分是利用化學方 法把纖維素水解之後再利用鹼催化把葡萄糖異構化成果醣(序列式反應)81。有關 於利用酵素把纖維轉化成果醣的文章目前只有在 1990 年 Kenneth B.團隊的研究
82，此研究固定纖維素水解酶、纖維雙醣水解酶以及葡萄醣異構酶三種酵素再聚 合物的基材上，基材是利用二異氰酸脂(methylene diphenyl diisocyanate)的異氰基 (isocyanate group,N=C=O)和乙二醇的醇基脫水形成氨脂鍵後形成的聚氨酯泡沫 塑料(polyurethane foam)，此聚合物的聚合機制以及化學式如圖 2.1 所示。接著二 異氰酸酯也可以和酵素中的氨基形成醯胺鍵，接著另一頭再和另一個單體聚合，
藉由這些聚合反應，我們可以得到含有三種酵素的聚氨脂泡沫塗料，藉由化學鍵 結可以確定酵素不容易脫落。此方法固定了三種酵素在基材上並利用此固體生物 催化劑做纖維素到果糖的轉換。結果如論文所示，首先可以得知酵素利用此化學 方法固定在上面可以維持一半的活性，也就是說有 50%的酵素在固定化過程中失 去活性；另外如果只固定葡萄糖異構酶的話，葡萄糖轉換至果糖的產率約有 53%，
隨著溫度提高可以達到 65%，之後由於摻入另外兩種酵素，溫度降低至 50oC 反 應，利用此複合酵素固體催化劑做纖維素至果糖的產率最好達到 25%，雖然最後 果醣產率不高，卻利用一步驟反應使纖維素轉換至果糖，是個跨時代的里程碑。
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本研究從此篇文章中得到一些啟示，首先由於聚合物不是一種比表面積很大 的基材，所以固定上去的酵素有限，加上此研究又固定三種酵素上去，每種酵素 固定上去的量一定不多；另外，纖維素水解酶和葡萄醣異構酶的反應條件相差太 多，前者需要酸性環境和較低溫(50oC)，後者卻需要鹼性環境、較高溫(70oC)以 及二價離子的存在，條件相差太多；最後想要一步驟地把纖維素轉換至果醣，其 中酵素量不足以致於果醣的產率並不高。綜合以上幾點，本研究利用同一種基材 固定兩種不同的酵素，再利用回收的手法做序列式兩步驟反應，也就是利用纖維 素水解酶先把纖維素水解成葡萄醣，回收酵素之後再加入葡萄糖異構酶使葡萄醣 異構化成果醣，此方法雖是兩步驟，不過可以讓每個酵素在最適當的環境下反應，
使每個步驟的產物達到最高，促使最終產物果醣的產率達到最高。
圖 2.1 聚氨脂泡沫塑料聚合機制
2.2 纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛
有關於此方面的研究非常晚才起步，主要是因為前面都先研究出纖維素到 5-羥甲基糠醛中經過的各種中間物以及機制，才有辦法統合出一步驟轉換的模式。
Yu 團隊 8利用離子液體([EMIM]Cl)當作溶劑溶解起始物纖維素之後，並加入氯 化銅或氯化鉻當做催化劑，並在 80~120 度的反應溫度之下做實驗，得到最高的
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5-羥甲基糠醛的最高產率為 54%，且溶劑和催化劑還可以再利用；或是利用幾乎 相同的反應條件，只在反應條件下加入微波輻射，可以使 5-羥甲基糠醛的產率達 到 60%83；Daorattanachai 團隊 84利用磷酸鈣和磷酸鍶當做催化劑，做纖維素至 5-羥甲基糠醛在水溶液的轉換，此研究有個很重大的突破就是在水相中做這個生 質轉換，我們都知道果糖要脫三個水才能形成 5-羥甲基糠醛，所以在有機相中反 應會比較好，不過此研究做了最大的突破就是水相做反應，雖然最後 5-羥甲基糠 醛的最高產率為 12%，不過卻讓在水中作生質反應有了重大的突破；目前最新的 研究 50 是利用另一種離子液體當溶劑和氯化銦做催化劑，得到了最高產率為 84%。
從文獻中可以得知，做纖維素至 5-羥甲基糠醛的反應都是需要昂貴的離子液 體以及重金屬或稀土金屬氯化物當做催化劑，這些東西除了貴以外重點就是會傷 害自然環境；另外這些反應牽涉到很多複雜的機制，所以副產物產生很多；溶劑、
催化劑和 5-羥甲基糠醛要透過很多分離程序才能各自分離出來。現在的研究致力 於如何在水相及溫和的反應條件下且副產物產生最少的情形下做出 5-羥甲基糠 醛，本研究使用酵素的話，專一性高且副產物很少，反應條件也很溫和，最後在 水相轉換成果醣之後只要添加一個有機相溶液和酸性催化劑就可以在雙相溶液 系統中得到 5-羥甲基糠醛，而且本研究之催化劑是具有磁性的，所以只要簡單外 加磁場就可以分離催化劑和產物。
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第三章：動機
很多團隊都是利用化學方法將纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛，如利用強酸迫使 纖維素降解成單體葡萄醣，再經由一些催化劑(如:氯化鉻)把葡萄醣轉化成 5-羥甲 基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)。使用上述方法有一些缺點，例如強酸(硫 酸)雖是一個非常適合用來降解纖維素的東西，不過它容易腐蝕器壁，而且還會 有廢酸排放問題所以在工業上也很難實行；在葡萄醣轉化成 5-羥甲基糠醛的催化 反應中，大部分也使用重金屬催化劑，除了價格昂貴外排放也是一個大問題；最 後這些反應的條件都非常地極端(例如；高溫高壓)；由於果醣在溶液中會形成五 圓環的結構，此結構和 5-羥甲基糠醛的結構比較類似，所以通常用果醣來轉換成 5-羥甲基糠醛產率會比較高而且比較沒有一些副反應，用葡萄醣直接轉換成 5- 羥甲基糠醛的反應，除了反應不專一和產率較低之外，也需要比較嚴苛的反應條 件來執行；綜合以上幾點，這些方法雖然是非常好的但是都卻很難應用在實際的 工業上。
本研究所利用的是酵素系統，利用酵素可以有效地把纖維素降解成單體葡萄 醣；再經另一酵素異構化成果醣之後行脫水反應轉化成 5-羥甲基糠醛。酵素有專 一性、反應條件溫和、少副產物……等等非常好的特性，而且不會有廢棄物排放 的問題。酵素的唯一缺點就是價格昂貴，所以本實驗把它固定在基材上讓它非常 有效率地使用。為了達成這個目的，選擇含有磁性粒子的中孔洞氧化矽奈米材料 (mesoporous silica nanoparticles,MSNs)來做酵素的載體。中孔徑氧化矽奈米材料 的優點主要是高比表面積、合適的孔徑大小、堅定的架構以及容易接上官能基的 特性，所以我選擇它來做我的載體。它雖然可以直接利用物理吸附或化學鍵結的 方法固定酵素，做多次的回收利用，可是有一個缺點就是回收率的問題。一般都 是利用過濾或離心的方式分離固體，不過會殘留在離心管管壁或是濾紙上，無法 百分之百地回收。所以在載體裡再鑲嵌入氧化鐵磁性粒子，使材料變得有磁性，
最後只要利用磁鐵就可以輕易地分離固體催化劑和液體的產物，不會使固體催化
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劑有減少，達到最有效率地利用。
通常做生質能源的研究，都會傾向一步驟反應，例如做出一個催化劑可以直 接把纖維素轉換成 5-羥甲基糠醛，它的優點就是很方便，不過缺點就是反應太複 雜、可能產生很多個副產物、最終產物產率太低……等等；我選擇的方法是多個 步驟的序列式反應，也就是先研究出纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛的反應中需要經 過哪些步驟轉換，把這些步驟一個個的切開，讓每個步驟的產物產率達到最高，
上個步驟的產物就是下個反應的反應物；藉由序列式反應我們可以最佳化每個步 驟的實驗條件以及產率，最後得到最好的最終產物產率。
綜合以上的描述，本研究是把纖維素轉換至 5-羥甲基糠醛的反應；本研究的 優點是，利用的是酵素系統，它在反應條件相對溫和的情況下，還可以發揮酵素 的專一性讓產物達到最大的產率，酵素作用是在水相，所以可以減少很多昂貴的 有機溶劑使用；有磁性的基材可以更方便做序列式反應，只要使用磁鐵回收催化 劑就可以進入下一步驟反應；序列式反應的優點就是可以把每個反應的小步驟都 分開做且使每個步驟的產物達到最高，最後藉著串連這些小步驟來讓最終產物的 產率達到最大，讓每個步驟簡單化，而不像一步驟反應，雖然很簡單可是裡面牽 扯到的副產物、機制太多，間接導致最終產物的產率不會太高，而且純化最終產 物出來也需要經過很多繁瑣的步驟(因為很多副產物)。
本研究如圖 3.1，先利用固定在基材上的纖維素水解酶(cellulase)把纖維素降 解成單體葡萄醣；再利用固定在基材上的葡萄糖異構酶(glucose isomerase)把葡萄 醣異構化成果醣；最後再藉由修飾上磺酸官能基的基材為催化劑，做果醣到 5- 羥甲基糠醛的反應。所有的固體催化劑皆可回收(如圖 3.2 所示)，並最佳化各個 反應步驟的最佳反應條件使各步驟的產物產量達到最大，以求最終產物產量的最 大；並討論所有催化劑的回收再使用次數以及相關的產物產量變化，而得知所有 催化劑的最大可使用次數已及耐性和穩定性。
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圖 3.1 實驗動機-利用鑲嵌入氧化鐵的中孔洞氧化矽奈米粒子(Fe3O4@MSNs)當基 材並修飾不同酵素及官能基後用來做纖維素至 5-羥甲基糠醛的序列式反應
圖 3.2 利用磁鐵分離磁性催化劑以及溶液
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第四章：實驗
4.1 材料 4.1.1 化學藥品
在所有實驗中我們用的化學藥品如下表二所示
表二、化學藥品
化學藥品名稱 化學式 廠商
Brij® O10 C36H76O11 Aldrich
3-Aminopropyltrimethoxysilane,97%, APTMS
H2N(CH2)3Si(OCH3)3 Aidrich
Dimethyl phthalate, 99+%, DOP
C10H10O4 Aldrich
Tetraethyl orthosilicate(TEOS), reagent grade,98%
Si(OC2H5)4 Aidrich
Methyl alcohol,anhydrous CH3OH
Mallinckrodt Chemicals Toluene, 99.8%, extra dry,over
molecular sieves, AcroSeal®
C6H5CH3 Acros
5-Hydroxymethyl-2furaldehyde,98+%
5-Hydroxymethylfurfural
C6H6O3 Alfa Aesar
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane,95%
MP
HS(CH2)3Si(OCH3)3 Alfa Aesar
Hydrogen peroxide solution, 30% H2O2 Sigma-Aldrich
Sulfuric acid H2SO4 Shimakyu’s
30
pure chemicals Ammomia hydroxide, ACS reagent,
28-30%
NH4OH Sigma-Aldrich
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% HCl Sigma-Aldrich Iron(II) chloride tetrahydrate
ReagentPlus® , 98%
FeCl2 · 4H2O Alfa Aesar
Cellulase
Trichoderma reesei ATCC 26921
Sigma
1-Butyl-3-methyl-imidazolium chloride [BMIM]Cl
C8H15ClN2 Aldrich
Cellulose
microcrystalline, powder, 20μm
(C6H10O5)n Aldrich
D-(+)-Glucose, minimum 99.5% C6H12O6 Sigma D-(-)-Fructose, minimum 99% C6H12O6 Sigma
Sodium phosphate tribasic, anhydrous, ≥94%
Na3PO4 Sigma-Aldrich
Magnesium sulfate heptahydrate, ACS reagent, ≥98%
MgSO4 · 7H2O Sigma-Aldrich
Sodium chloride, BioXtra, ≥99.5% NaCl Sigma-Aldrich Citric acid, anhydrous C6H8O7 Sigma
Sodium hydroxide
reagent grade, ≥98%, anhydrous
NaOH Sigma-Aldrich
Iron(III) chloride hexahydrate, ACS reagent, 97%
FeCl3 · 6H2O Alfa Aesar
Glucose isomerase Hampton
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research N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcar
bodiimide hydrochloride ≥99.0%
EDC
C8H17N3 · HCl Sigma
N-hydroxysuccinimide, 98%
NHS
C4H5NO3 Aldrich
3-(triethoxysilyl)propylsuccinic anhydride, 95%
TESPSA
C13H24O6Si gelest
Ethanol, absolute, ≥99.8% C2H5OH Sigma-Aldrich
Pluronic® P 104 BASF
Dimethyl sulfoxide, 99.7%, pure DMSO
C2H6OS Aldrich
4.1.2 分析儀器
固體催化劑的孔洞特性，是藉由 Micromeritics ASAP2010 這台儀器，得到氮 氣吸脫附曲線而得知；而比表面積和孔洞大小分別是用 BET 和 BJH 法計算得知。
固體催化劑的形貌則藉由掃描式電子顯微鏡可以看到(JEOL JSM-5310 SEM)。固 體催化劑接上多少官能基是利用固態核磁共振儀來測定，得到的 13C-譜和 29Si- 譜可以計算出接上多少的官能基。固體催化劑接上多少酵素是利用紫外光-可見 光光譜儀來測定(Jasco V-670)。纖維素到 5-羥甲基糠醛的連續式反應下所有的產 物 都 是 由 高 性 能 液 相 層 析 儀 (high-performance liquid chromatography, HPLC ASI500 System)配上 HPX-87H 的管柱並在衝提液是 0.005(M)硫酸、流速為 0.6(mL/min)的條件下分析(管柱溫度為 45oC)。
![HPSH [ 氧化數平衡反應式係數 ]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)