第四章 ：實驗
4.3 連續式反應操作
買來的纖維素都是有結晶的結構，而且都是交聯在一起的纖維素，如果直接 讓纖維素水解酶去反應的話，時間要拉的很長而且需要很多酵素量，所以我們選 擇用前處理過的纖維素來做反應。前處理的步驟如圖 4.6 所示，取 0.05 克的纖維 素加入 0.95 毫升的離子液體([BMIM]Cl)。接著在 120oC 的油浴裡反應一小時，
一小時後加入甲醇使反應中止並使前處理過的纖維素(纖維素寡聚物)沉澱出來，
同時利用離心的方法收集膠狀的纖維素寡聚物並且用甲醇還有去離子水洗五次，
最後放入低壓真空乾燥即可得到前處理過的纖維素。
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圖 4.6 纖維素前處理流程圖
4.3.2 酵素的反應條件最佳化
取前處理過的纖維素 0.015 克，接著放入檸檬酸緩衝液和纖維素水解酶。首 先我們先最佳化反應的溫度，先固定放入緩衝液以及酵素的比例，調整不同的溫 度，並固定一個反應的時間，可以得到在某個溫度下(Tmax)有最高葡萄醣的產率。
接下來固定溫度(Tmax)，改變緩衝液和酵素的比例，到達某一個比例也會達到最 高產率，這個比例就是放入酵素和緩衝液的最佳比例(Rmax)。最後一部分在最適 當的反應溫度及比例下(Tmax、Rmax)，調整反應時間，也會得到最高的葡萄醣產 率，所以得到最佳的反應時間(tmax)。另一方面如果要最佳化葡萄醣異構酶的話，
反應物改成葡萄醣 0.015 克，把緩衝液改成磷酸鈉緩衝液，並重複上述步驟即可 得知葡萄醣異構酶的反應最佳條件。
4.3.3 纖維素寡聚物至果醣的連續式反應
如圖 4.7 所示，取 0.015 克的纖維素寡聚物，放入 1 毫升的磷酸鈉緩衝液 (pH=4.8)(會在結果部分說明)，接著加入 0.05 克的含氧化鐵中空洞氧化矽奈米粒 子並有固定纖維素水解酶的固體催化劑，在最佳化的反應條件下反應，接下來使 用磁鐵把催化劑吸到瓶壁，就可以分離出固體催化劑和澄清液，澄清液包含未反 應完的反應物、產物，接下來再加入緩衝液清洗固體催化劑，使卡在孔洞中的反 應物及產物都洗出來，重複五次之後就可以洗乾淨，固體催化劑就可以再次使用。
接著澄清液收集起來，並加入含氧化鐵中空洞氧化矽奈米粒子並有固定葡萄醣異
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構酶的固體催化劑 0.05 克，以及調整反應環境至 pH 值為 7.5 之後(用氫氧化鈉調 整)，在最佳的反應條件下反應，利用磁鐵分離液體和固體催化劑，固體催化劑 可以再做下一次使用而澄清液收集起來，用高效能液相層析儀分析產物並計算產 率。回收過的固體催化劑則可以再繼續下一次的反應。
圖 4.7 纖維素寡聚物至果醣的連續式反應流程圖
4.3.4 纖維素寡聚物至 5-羥甲基糠醛的連續式反應
由 4.3.3 最後取出來的澄清液，接下來濃縮反應體積，並加入 DMSO(dimethyl sulfoxide)，使反應成為兩相的系統(有機相和水相都存在)，並加入 0.15 克的中孔 洞氧化矽奈米粒子並有磺酸官能基的固體催化劑，在適當的反應時間和反應溫度 下反應完後，如果要回收催化劑則用離心回收，如果沒有要回收催化劑則過過濾 膜把固體催化物濾掉。最後用高性能液相層析儀分析產物，並計算產率。
4.3.5 材料的回收性及穩定性測試
我們取反應物和固定在基材上的酵素或是修飾上官能基的基材做催化劑，在 最佳反應條件反應完時，用磁鐵把固體催化劑和溶液分開，就可以把液體取出，
剩下固體催化劑的部分。因為我們的基材是孔洞材料，有可能反應物或產物會殘
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留在固體催化劑內沒有被分離出來，所以我們會繼續加入反應時的溶劑做清洗的 動作，把上清液取出用高性能液相層析儀分析，直到沒有產物或反應物就代表催 化劑恢復到它原本的狀態。經過實驗得知清洗五次即可。
4.4 高性能液相層析儀分析(HPLC)