第一章、 緒論
第四節、 雙酚化合物 (Biphenol compounds)
三、 和厚朴酚之衍生物
BBB) 與血腦脊液屏障(blood cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)，故能進到中 樞神經系統產生藥理作用達到治療效果 (Wang et al., 2011)。
和厚朴酚具有抗腫瘤的作用，相較於一般抗腫瘤藥物只能透過單一路徑使癌 細胞走向細胞凋亡(apoptosis)，和厚朴酚則可以透過抑制調控癌細胞生長的 p53、
Ras 以及 NF-kB 等多條路徑促使細胞凋亡(Dikalov et al., 2008; Fried and Arbiser, 2009; Xu et al., 2011)。和厚朴酚的抗發炎作用，是透過抑制 TNFα活 化的 NF-kB 與 NF-kB 下游的目標基因像是 VEGF、ICAM-1 與 COX-2(Tse et al., 與 MH111(Tripathi et al., 2012)，已發現具有神經保護的作用，得以對抗神經毒 素及氧化毒害。而本論文對於這些雙酚化合物神經保護作用與滋養作用做進一步 的探討
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一、 活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS)
活性氧是生物在代謝過程中的一種副產物，包括氧離子、過氧化物和含氧自
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酵素性抗氧化系統主要含有超氧化歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、
過 氧 化 氫 酶 (catalase) 與 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (Se-dependent glutathione peroxidase, GSH-Px)等，SOD 會促使超氧陰離子轉化成過氧化氫，使超氧陰離 子清除，過氧化氫酶與 GSH-Px 再將過氧化氫還原成水和氧，另外，GSH-Px 也可以將脂質過氧化物還原成無毒害產物(Kurata et al., 1993)。
非酵素性抗氧化物質，主要包括維生素 E (vitamin E)、維生素 C (vitamin C) 與穀胱甘肽(glutathione, GSH)等。維生素 E 是一種脂溶性維生素，可以直接與 自由基反應，與脂質共存並保護膜上的不飽和脂肪。維生素 C 為細胞內主要的
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第六節、 細胞外信號調節激酶 (Extracellular-signal-regulated kinases, Erk1/2)
Erk1/2 屬於 絲裂 原活 化蛋 白激 酶 (mitogen-activated protein kinases ， MAPKs)家族，ERK 1 與 ERK 2 分子量分別為 44kD 與 42kD，彼此有接近 85%
的相似程度(Miyata and Nishida, 1999)。常見 ERK 的活化路徑為：酪氨酸激酶 受體(receptor-linked tyrosine kinases)與細胞膜上的特異受體結合，形成二聚體 後啟動 Ras，再進一步啟動 Raf-1，Raf-1 將 MEK1/2 磷酸化，從而激活 Erk1/2，
活化的 Erk1/2 進入到細胞核作用於目標基因，例如：c-fos、c-Jun、 Elk-1、c-myc 和 ATF2 等，調控目標基因的轉錄與表達，進而調控細胞的增生或分化。
先前已有研究指出，在神經細胞 NGF 透過結合受體激活下游反應，活化 Erk1/2 作用於目標基因的表現，以達到促進神經突生長(Perron and Bixby, 1999;
Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b; Lee et al., 2009b)。在未分化 PC12 細胞，NGF 結合上 TrkA，活化 Ras 啟動 Raf 將 MEK1/2 磷酸化，進而活化 Erk1/2，
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第七節、 訊息傳遞轉錄活化基因-3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)
STAT3 屬於 STAT 家族的一員，由 STAT3 基因編碼出的轉錄因子(Akira, 1994)。已知 STAT3 可透過不同獨立的機制改變轉錄活性來調控細胞的功能，像 是增生與存活。STAT3 同樣在神經發育中扮演重要的角色，並在神經系統受損 反應中為主要的介質。STAT3 會經由不同的生長因子(growth factor)及細胞激素 (cytokine)活化，生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、肝細 胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)與神經生長因子(NGF)等，細胞激素 則包括白細胞介素(Interleukin-6, IL-6)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 與睫狀節神經營養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)(Hirano, 2000)。而 STAT3 被活化的位置會在羧基末端(C-terminal)的 Y705 與轉錄活化 區域(transactivation domain)的 S727。
在 PC12 細胞的研究，NGF 透過結合 TrkA 激活 STAT3，表明 STAT3 的活
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0.5 % trypsin-EDTA Sigma
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) Sigma 40 % Acrylamide/Bis solution (29:1) SERVA Aluminum persulfate (APS) Bio-red
Boric acid Sigma
Bovine serum albumin (BSA) Sigma
Bromophenol blue Sigma
Chemiluminescent HRP Substrate Millipore
Collagen Sigma
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T.Baker
Dithiothreitol (DTT) Fermentas
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) Sigma Fetal bovine serum (FBS) Gibco
Glycerol Sigma
Glycine J.T.Baker
H2O2 Sigma
Horse serum heat inactivated (HS) Gibco
KCl Sigma
KH2PO4 J.T.Baker
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Methanol Merck
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma
Na2HPO4 Riedel-de Haën
NaCl J.T.Baker
Nerve growth factor (NGF) Sigma
Nonident P-40 Sigma
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Penicillin-Streptomycin Gibco Poly-L-lysine hydrobromide (30000-70000 DA) Sigma Polyvinylidene difluoride (PVDF) Transfer membrane Millipore Protease inhibitor (PI) Calbiochem Phosphatase inhibitor cocktail set IV Merck
Protein Assay Dye Bio-Rad
Sodium bicarbonate 島久藥品
Sodium tetraborate Riedel-de Haën
Stripping buffer Bio-East
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma
Tris J.T.Baker
TWEEN® 20 Calbiochem
脫脂奶粉 安佳
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100 mM boric acid 75 mM NaCl 25 mM sodium tetraborate 再以孔徑 0.22 μm filter 過濾。
抗體名稱 廠牌 型號
p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell signaling technology 4695S Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)
(T202/Y204) antibody
Cell signaling technology 4377S
STAT3 antibody Cell signaling technology 12640S Phospho-STAT3 (Y705) antibody Cell signaling technology 9145S Phospho-STAT3 (S727) antibody Cell signaling technology 9134S
Actin antibody Millipore MAB1501
Goat anti-Rabbit IgG antibody Millipore AP132P Goat anti-Mouse IgG Antibody Millipore AP124P
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10% Running gel Stacking gel
ddH2O 4.8 ml 2.1 ml
Running/stacking buffer 2.5 ml 833 μl 40 % Acrylamide/Bis (29:1) 2.5 ml 333 μl
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18.2 MΩ·cm ultra-pure water Rephile 分光光度計(Spectrophotometer) BOECO S-30
水浴槽 (Water bath) COCONO laboratory equipment BH-200I
加熱攪拌器 CORNING
平面震盪器 (Orbital shaker) Digisystem laboratory instruments 多孔式乾浴器 (Dry bath) CLUBIO CB1503
多功能微量盤分析儀 (Microplate reader)
Perkin Elmer VICTOR X4
封膜機 (Impulse sealer) MERCIER corporation
倒立光學顯微鏡 Motic
桌上型吸引器 (Portable suction) Doctor’s friend DF-506
迷你離心機 Cubee
培養箱 (Incubator) ESCO CCL-170B-9 超音波震盪器 (Sonicator) HEAT SYSTEMS 試管震盪器 (Vortex mixer) FINEPCR
電泳槽 Amersham Biosciences
電泳膠影像系統 AVEGENE
電源供應器 Major Science
酸鹼度計 (pH meter) Denver Instrument
螢光顯微鏡 Leica
濕式轉漬槽 (Trans-blot cell) Bio-Rad
擺盪式震盪器 (3D shaker) KANSIN instruments RS01
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離心機 BECKMAN COULTER Allergra
X-15R/KUBOTA 1300
鑄膠器具 Amersham Biosciences
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pheochromocytoma) 選殖而成 (Greene and Tischler, 1976)。此細胞株來源由 國立清華大學陳令儀老師實驗室提供。 bovine serum)、1 % 抗生素 (penicillin-streptomycin) 的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) 培養液中，培養環境為溫度 37 ℃、5 % CO2的恆溫‧
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(圖 3)
於神經突生長 (Neurite outgrowth) 實驗，藥物處理流程如(圖 4)，首先不給 予任何血清，讓細胞處於飢餓的環境(starvation)下，4 小時後，以分化用的培養 液(含有 1%FBS 與 1%抗生素)，同時給予不同濃度的雙酚類化合物( 0.1, 0.3, 及 1μM)與 25ng/ml 或 50ng/ml 的神經生長因子(NGF)，促使 PC12 細胞神經突的 生長，每兩天更換一次含有雙酚類化合物與 NGF 的培養液。
(圖 4)
第四節、活性氧檢測試驗 (reactive oxygen species detection assay)
DCFH-DA 全名為2’,7’ –dichlorodihydrofluorescin diacetate，一種常用 來測量細胞內活性氧(ROS)含量的螢光試劑。 DCFH-DA 本身沒有螢光，可以 自由穿過细胞膜。進入細胞後， DCFH-DA 會被細胞內的酯解酶 (esterase) 去 乙醯化，形成同樣不具螢光的 DCFH。DCFH (dichlorodihydrofluorescin) 無法 通透細胞膜，因此會堆積聚集在细胞內。而细胞內的 ROS 會將 DCFH 氧化，
生成具螢光的 DCF (dichlorofluorescin)。 DCF 的螢光光譜的最大激發光為波 長 485 nm，最大發射光為波長 530 nm，使用螢光顯微鏡偵測螢光強度，觀察 藥物處理後细胞內 ROS 的變化。
配置與使用 DCFH-DA 的過程中必須避光，DCFH-DA 先以 DMSO 溶成
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還原，將 tetrazolium 環打開，並形成藍紫色的結晶 formazan，而在死細胞中琥 珀酸脫氫酶消失，無法將 MTT 還原。因此，結晶 formazan 的生成量與活細胞‧
第六節、神經突生長 (Neurite outgrowth assay)
PC12 細胞以 5 × 104 的密度種在 24 孔盤中，每格 1 ml 的培養液，置放 抑制劑 (protease inhibitor) 與磷酸酶抑制劑 (phosphatase inhibitor) 的裂解緩 衝液 (lysis buffer)，放在速度為 100 rpm 的平面震盪器 5 分鐘。將細胞混合 液收集至微量離心管，於溫度 4℃ ，速度 14000 rpm ，離心 10 分鐘，除去 細胞殘骸。只取上清液，避免吸到沉澱物，保存於 -80 ℃ 冰箱。
二、蛋白質濃度測定
本實驗使用 Bradford 測定法測定蛋白質濃度，Protein Assay Dye 含有 Coomassive Brilliant Blue G-250 染劑與蛋白質結合後，顏色由紅棕色轉變為藍 色， O.D. 值在波長 595 nm 有最大吸收值，藉此測量樣本蛋白質濃度。首先，
‧ polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
將完成膠體裝置在電泳槽，小心地移除齒梳，倒入預冷的電泳緩衝液 (tank buffer) ，電泳緩衝液需要蓋過膠體及電泳槽。將配置完成的20 μl 蛋白質樣本注 入至膠體的膠孔中，PageRuler Prestained Protein Ladder 與 5X loading dye、
滅菌 ddH2O 混合後加至樣本旁的膠孔，以便觀察不同分子量大小的蛋白質分離 情形。架設完成的電泳槽放在冰上，將電源供應器設定最大電壓 300 伏特 及 每片膠體固定電流 30 mA，進行不同分子量的蛋白質分離。等待樣本跑至底部 後，再將膠體取下。
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70 rpm 的轉速清洗 10 分鐘，將 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) 膜剪適當大小後，浸泡在 100 % 甲醇 (methanol) 中，輕輕搖晃 30 秒，接著 (1:100000)、rabbit anti-Phospho-Erk1/2 antibody (1:1000)、rabbit anti-Erk1/2 (1:1000)。裁剪的 PVDF 膜用無氯塑膠膜封起，加入一級抗體，放置在轉速為 20 peroxidase conjugated antibody (1:10000)、goat anti-rabbit IgG horseradish‧ 國
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peroxidase conjugated antibody (1:10000)。完成反應後以 0.1 % TBST 清洗，
放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分鐘、 10 分 鐘、 10 分鐘。以 immobilon Western chemiluminescent HRP substrate 完全 覆蓋於 PVDF 膜上，使用電泳膠影像系統擷取影像。所得到之影像以 ImageJ 軟 體進行量化分析。
若是同一張 PVDF 膜需要進行其他抗體免疫轉漬，將 PVDF 膜浸泡在約 15 ml 的 stripping buffer 中，放置於轉速為 70 rpm 的平面震盪器上，室溫下 反應 15 分鐘。完成反應後，先以 ddH2O 沖洗掉 stripping buffer，再以 0.1 % TBST 清洗，放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分 鐘、 10 分鐘、 10 分鐘。
第八節、實驗數據分析
實驗結果的數據取得資料之平均值以平均值 ± 標準誤差 (means ± S.E.M) 表示。統計上的差異以單向變異分析 (one way analysis of variance) 來建立，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測，將 p < 0.05 視為有統計上的顯著 差異。
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第三章、實驗結果
第一節、過氧化氫引起嗜鉻性細胞瘤細胞 PC12 之氧化壓力
本實驗以過氧化氫處理 PC12 細胞，使細胞直接產生氧化壓力。細胞密 度 4 × 105種於 24 孔盤，以濃度 100、200、400、800 及 1000 μM 的 H2O2
處理 1 小時，使用 ROS 檢測試驗法檢測 H2O2對於 PC12 細胞株產生氧化壓 力的程度。
由圖 5 觀察到，H2O2對於 PC12 細胞株所產生的 ROS 隨著 H2O2濃度增加 而加劇，在統計上達到顯著差異 (F5,12 = 62.35, p < 0.001)，H2O2在濃度 100μM 及 200μM 與對照組相比，ROS 的產生增加至對照組的 4 倍；H2O2在濃度 400μM 與對照組相比，顯著增加 ROS 的產生至對照組的 6 倍(p < 0.001)；濃度 800 μM 的 H2O2，ROS 增加至對照組的 12.97 倍；1000 μM 的 H2O2更加強烈，ROS 增加至對照組接近 15 倍 (p < 0.001)。
後續的實驗選擇 H2O2具有較顯著差異(p < 0.001)的濃度 400μM，作為實驗 濃度。
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(G)
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圖 5、H2O2對於 PC12 細胞 ROS 生成之影響。
PC12 細胞密度 4 × 105種於 24 孔盤，分別以不同濃度的 H2O2處理 1 小時後，
使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 100 μM H2O2、 (C, c) 200 μM H2O2、(D, d) 400 μM H2O2、(E, e) 800 μM H2O2、(F, f) 1000 μM H2O2、(G) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E, F)為明視野下所擷取之影 像，圖(a, b, c, d, e, f) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數 皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實驗結 果 以 單 因 子 變 異 數 分 析 (one-way ANOVA) 方 法 進 行 統 計 分 析 ， 並 以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001 與對照組比較。圖中比例尺為 100μm。
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物(MH101、MH102、MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111) 預先處 理 30 分鐘後，再加入濃度 400 μM 的 H2O2 處理 1 小時，以 DCFH-DA 螢‧
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圖 12 結果顯示隨著 MH111 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS (F4,10 = 22.834, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與 對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍 (p < 0.001)。預先處理 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH111 將 ROS 的生成量降至對照組的 2.58 倍，顯著 地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而濃度 10 μM 的 MH111 降至對照組的 1.72 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而預先處理 30 分鐘濃度 1 μM 的 MH111 並沒有降低 ROS 生成的效果。
表 3 為雙酚化合物對於 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長情形之比較。比 較結果顯示 MH102 與 MH103 在濃度 1 μM 即可降低因 H2O2所產生的 ROS。
其餘雙酚化合物則濃度需要達到 3μM 以上才能達到顯著降低 ROS。
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(F)
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圖 6、MH101 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。
PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2處理 1 小時後，使用 ROS 檢 測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH101 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH101 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH101 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷 取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光 波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣
PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2處理 1 小時後，使用 ROS 檢 測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH101 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH101 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH101 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷 取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光 波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣