第一章、 緒論
第三節、 神經生長因子 (Nerve growth factor, NGF)
NGF 基因所轉譯出的蛋白(Ebendal, 1992)。NGF 對於周圍神經系統(peripheral
nervous system, PNS)的神經細胞發育與存活扮演重要的角色，尤其是作用在交 感神經元以及感覺神經元，PNS 的表型特徵和 NGF 密切相關，像是神經分佈的 密度、細胞體的大小、軸突終端的 出芽、樹突的分枝、誘導或抑制神經肽 (neuropeptides)和神經傳遞物質，或製造傳遞物質的蛋白酶(Aloe et al., 1997)。
在中樞神經系統(central nervous system, CNS)，NGF 除了在皮層(cortex)、海 馬迴(hippocampus)和腦垂體(pituitary gland)大量表現外，在其他區域像是基底 節(basal ganglia)、丘腦(thalamus)、脊髓(spinal cord)和視網膜(retina)同樣有顯 著的表現(Dreyfus, 1989; McAllister, 2001)。NGF 調控基底前腦(basal forebrain complex, BFC)膽鹼能神經(cholinergic neuron)的發育與維持，而影響的功能包 括注意力、覺醒、動機、記憶和意識(Dreyfus, 1989)。因為在 BFC 的神經元高 度影響阿茲海默症（Alzheimer’s disease, AD），且 NGF 已被指出可以調控阿茲 海默症β 類澱粉蛋白質(beta-amyloid, Aβ)的生成與堆積，因此 NGF 對於神經退 化疾病具有潛在保護性或療效 (Allen and Dawbarn, 2006; Matrone et al., 2008)。
NGF 的功能會通過結合上神經細胞表面的受體，啟動訊號傳遞至細胞內。
而 NGF 蛋白可以結合兩種不同的受體，一個是 tropomyosin kinase receptor A (TrkA)，另一個是 non-selective p75 pan-neurotrophin receptor (p75NRT)。這兩 種受體皆被發現在感覺神經元及其他類型的神經細胞表面。TrkA 是一種典型酪 氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor) (Huang and Reichardt, 2003)，NGF 透 過 TrkA 激活的訊號主要為促分裂原活化蛋白激酶(ras-mitogen activated protein kinase, MAPK)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷酸肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)以及 C 型磷脂酶
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
Na tiona
l Ch engchi University
4
(phospholipase C, PLC) (Klesse and Parada, 1999; Chao et al., 2006;
Reichardt, 2006)。而 p75NRT 是一種跨膜糖蛋白，可以調節 TrkA 的傳遞訊號 (Friedman and Greene, 1999; Schor, 2005; Reichardt, 2006)。但當 TrkA 與 p75NRT沒有同時表現時，NGF 結合 p75NRT會傳遞細胞凋亡(apoptosis)的訊號使 細胞走向死亡(Friedman and Greene, 1999; Miller and Kaplan, 2001; Schor, 2005)。p75NRT所激活的訊號為 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 、 核 因 子 活 化 B 細 胞 κ 輕 鏈 增 強 子 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB) 以 及 神 經 醯 胺 (ceramide)的產生(Levi-Montalcini, 1987)。
‧
及 4-O-methylhonokiol 等，其化學分子結構式如圖 1。已有研究發現這些雙酚類 物質在活體外實驗，除了具抗氧化、抗發炎、抗微生物活性等作用外，對於神經 細胞在毒性的環境下同樣具有保護作用，並且加強神經細胞的存活率(Ogata et al., 1997; Ho et al., 2001; Lee et al., 2005; Hoi et al., 2010a)。厚朴酚與和厚朴 酚在大鼠皮層神經元與神經幹細胞的具有神經滋養作用(Fukuyama et al., 2002;Zhai et al., 2005a)，4-O-methylhonokiol 可避免受Aβ 誘導的神經細胞死亡(Lee et al., 2009a)，也可以促進大鼠胚胎幹細胞神經突的生長(Lee et al., 2009a)。亦 有 研 究 指 出 厚 朴 類 化 合 物 是 透 過 活 化 細 胞 外 信 號 調 節 激 酶 (extracellular signal-regulated kinases, Erk1/2)蛋白調節神經細胞的分化、神經突增長以及神 經元存活(Perron and Bixby, 1999; Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b;
Lee et al., 2009b)。在活體上厚朴類化合物對於神經退化疾病模式的小鼠，像是 帕金森氏症和阿茲海默症等，可以預防老鼠的學習能力及記憶的損害(Matsui et al., 2009)，而在癌症小鼠的研究上可以抑制腫瘤生長(Bai et al., 2003)。
(圖 1)
Honokiol Magnolol 4-O-methylhonokiol
‧
BBB) 與血腦脊液屏障(blood cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)，故能進到中 樞神經系統產生藥理作用達到治療效果 (Wang et al., 2011)。和厚朴酚具有抗腫瘤的作用，相較於一般抗腫瘤藥物只能透過單一路徑使癌 細胞走向細胞凋亡(apoptosis)，和厚朴酚則可以透過抑制調控癌細胞生長的 p53、
Ras 以及 NF-kB 等多條路徑促使細胞凋亡(Dikalov et al., 2008; Fried and Arbiser, 2009; Xu et al., 2011)。和厚朴酚的抗發炎作用，是透過抑制 TNFα活 化的 NF-kB 與 NF-kB 下游的目標基因像是 VEGF、ICAM-1 與 COX-2(Tse et al., 與 MH111(Tripathi et al., 2012)，已發現具有神經保護的作用，得以對抗神經毒 素及氧化毒害。而本論文對於這些雙酚化合物神經保護作用與滋養作用做進一步 的探討
‧
一、 活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS)
活性氧是生物在代謝過程中的一種副產物，包括氧離子、過氧化物和含氧自
‧
酵素性抗氧化系統主要含有超氧化歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、
過 氧 化 氫 酶 (catalase) 與 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶 (Se-dependent glutathione peroxidase, GSH-Px)等，SOD 會促使超氧陰離子轉化成過氧化氫，使超氧陰離 子清除，過氧化氫酶與 GSH-Px 再將過氧化氫還原成水和氧，另外，GSH-Px 也可以將脂質過氧化物還原成無毒害產物(Kurata et al., 1993)。
非酵素性抗氧化物質，主要包括維生素 E (vitamin E)、維生素 C (vitamin C) 與穀胱甘肽(glutathione, GSH)等。維生素 E 是一種脂溶性維生素，可以直接與 自由基反應，與脂質共存並保護膜上的不飽和脂肪。維生素 C 為細胞內主要的
‧
第六節、 細胞外信號調節激酶 (Extracellular-signal-regulated kinases, Erk1/2)
Erk1/2 屬於 絲裂 原活 化蛋 白激 酶 (mitogen-activated protein kinases ， MAPKs)家族，ERK 1 與 ERK 2 分子量分別為 44kD 與 42kD，彼此有接近 85%
的相似程度(Miyata and Nishida, 1999)。常見 ERK 的活化路徑為：酪氨酸激酶 受體(receptor-linked tyrosine kinases)與細胞膜上的特異受體結合，形成二聚體 後啟動 Ras，再進一步啟動 Raf-1，Raf-1 將 MEK1/2 磷酸化，從而激活 Erk1/2，
活化的 Erk1/2 進入到細胞核作用於目標基因，例如：c-fos、c-Jun、 Elk-1、c-myc 和 ATF2 等，調控目標基因的轉錄與表達，進而調控細胞的增生或分化。
先前已有研究指出，在神經細胞 NGF 透過結合受體激活下游反應，活化 Erk1/2 作用於目標基因的表現，以達到促進神經突生長(Perron and Bixby, 1999;
Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b; Lee et al., 2009b)。在未分化 PC12 細胞，NGF 結合上 TrkA，活化 Ras 啟動 Raf 將 MEK1/2 磷酸化，進而活化 Erk1/2，
‧
第七節、 訊息傳遞轉錄活化基因-3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)
STAT3 屬於 STAT 家族的一員，由 STAT3 基因編碼出的轉錄因子(Akira, 1994)。已知 STAT3 可透過不同獨立的機制改變轉錄活性來調控細胞的功能，像 是增生與存活。STAT3 同樣在神經發育中扮演重要的角色，並在神經系統受損 反應中為主要的介質。STAT3 會經由不同的生長因子(growth factor)及細胞激素 (cytokine)活化，生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、肝細 胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)與神經生長因子(NGF)等，細胞激素 則包括白細胞介素(Interleukin-6, IL-6)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 與睫狀節神經營養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)(Hirano, 2000)。而 STAT3 被活化的位置會在羧基末端(C-terminal)的 Y705 與轉錄活化 區域(transactivation domain)的 S727。
在 PC12 細胞的研究，NGF 透過結合 TrkA 激活 STAT3，表明 STAT3 的活
‧
‧
0.5 % trypsin-EDTA Sigma
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) Sigma 40 % Acrylamide/Bis solution (29:1) SERVA Aluminum persulfate (APS) Bio-red
Boric acid Sigma
Bovine serum albumin (BSA) Sigma
Bromophenol blue Sigma
Chemiluminescent HRP Substrate Millipore
Collagen Sigma
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T.Baker
Dithiothreitol (DTT) Fermentas
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) Sigma Fetal bovine serum (FBS) Gibco
Glycerol Sigma
Glycine J.T.Baker
H2O2 Sigma
Horse serum heat inactivated (HS) Gibco
KCl Sigma
KH2PO4 J.T.Baker
‧
Methanol Merck
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma
Na2HPO4 Riedel-de Haën
NaCl J.T.Baker
Nerve growth factor (NGF) Sigma
Nonident P-40 Sigma
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Penicillin-Streptomycin Gibco Poly-L-lysine hydrobromide (30000-70000 DA) Sigma Polyvinylidene difluoride (PVDF) Transfer membrane Millipore Protease inhibitor (PI) Calbiochem Phosphatase inhibitor cocktail set IV Merck
Protein Assay Dye Bio-Rad
Sodium bicarbonate 島久藥品
Sodium tetraborate Riedel-de Haën
Stripping buffer Bio-East
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma
Tris J.T.Baker
TWEEN® 20 Calbiochem
脫脂奶粉 安佳
‧
100 mM boric acid 75 mM NaCl 25 mM sodium tetraborate 再以孔徑 0.22 μm filter 過濾。
抗體名稱 廠牌 型號
p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell signaling technology 4695S Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)
(T202/Y204) antibody
Cell signaling technology 4377S
STAT3 antibody Cell signaling technology 12640S Phospho-STAT3 (Y705) antibody Cell signaling technology 9145S Phospho-STAT3 (S727) antibody Cell signaling technology 9134S
Actin antibody Millipore MAB1501
Goat anti-Rabbit IgG antibody Millipore AP132P Goat anti-Mouse IgG Antibody Millipore AP124P
‧
10% Running gel Stacking gel
ddH2O 4.8 ml 2.1 ml
Running/stacking buffer 2.5 ml 833 μl 40 % Acrylamide/Bis (29:1) 2.5 ml 333 μl
‧
18.2 MΩ·cm ultra-pure water Rephile 分光光度計(Spectrophotometer) BOECO S-30
水浴槽 (Water bath) COCONO laboratory equipment BH-200I
加熱攪拌器 CORNING
平面震盪器 (Orbital shaker) Digisystem laboratory instruments 多孔式乾浴器 (Dry bath) CLUBIO CB1503
多功能微量盤分析儀 (Microplate reader)
Perkin Elmer VICTOR X4
封膜機 (Impulse sealer) MERCIER corporation
倒立光學顯微鏡 Motic
桌上型吸引器 (Portable suction) Doctor’s friend DF-506
迷你離心機 Cubee
培養箱 (Incubator) ESCO CCL-170B-9 超音波震盪器 (Sonicator) HEAT SYSTEMS 試管震盪器 (Vortex mixer) FINEPCR
電泳槽 Amersham Biosciences
電泳膠影像系統 AVEGENE
電源供應器 Major Science
酸鹼度計 (pH meter) Denver Instrument
螢光顯微鏡 Leica
濕式轉漬槽 (Trans-blot cell) Bio-Rad
擺盪式震盪器 (3D shaker) KANSIN instruments RS01
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
Na tiona
l Ch engchi University
17
離心機 BECKMAN COULTER Allergra
X-15R/KUBOTA 1300
鑄膠器具 Amersham Biosciences
‧
pheochromocytoma) 選殖而成 (Greene and Tischler, 1976)。此細胞株來源由 國立清華大學陳令儀老師實驗室提供。 bovine serum)、1 % 抗生素 (penicillin-streptomycin) 的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) 培養液中，培養環境為溫度 37 ℃、5 % CO2的恆溫‧
‧
‧ 國
立 政 治 大 學
‧
Na tiona
l Ch engchi University
21
(圖 3)
於神經突生長 (Neurite outgrowth) 實驗，藥物處理流程如(圖 4)，首先不給 予任何血清，讓細胞處於飢餓的環境(starvation)下，4 小時後，以分化用的培養 液(含有 1%FBS 與 1%抗生素)，同時給予不同濃度的雙酚類化合物( 0.1, 0.3, 及 1μM)與 25ng/ml 或 50ng/ml 的神經生長因子(NGF)，促使 PC12 細胞神經突的 生長，每兩天更換一次含有雙酚類化合物與 NGF 的培養液。
(圖 4)
第四節、活性氧檢測試驗 (reactive oxygen species detection assay)
DCFH-DA 全名為2’,7’ –dichlorodihydrofluorescin diacetate，一種常用 來測量細胞內活性氧(ROS)含量的螢光試劑。 DCFH-DA 本身沒有螢光，可以 自由穿過细胞膜。進入細胞後， DCFH-DA 會被細胞內的酯解酶 (esterase) 去 乙醯化，形成同樣不具螢光的 DCFH。DCFH (dichlorodihydrofluorescin) 無法 通透細胞膜，因此會堆積聚集在细胞內。而细胞內的 ROS 會將 DCFH 氧化，
生成具螢光的 DCF (dichlorofluorescin)。 DCF 的螢光光譜的最大激發光為波 長 485 nm，最大發射光為波長 530 nm，使用螢光顯微鏡偵測螢光強度，觀察 藥物處理後细胞內 ROS 的變化。
配置與使用 DCFH-DA 的過程中必須避光，DCFH-DA 先以 DMSO 溶成
‧
還原，將 tetrazolium 環打開，並形成藍紫色的結晶 formazan，而在死細胞中琥 珀酸脫氫酶消失，無法將 MTT 還原。因此，結晶 formazan 的生成量與活細胞‧
第六節、神經突生長 (Neurite outgrowth assay)
PC12 細胞以 5 × 104 的密度種在 24 孔盤中，每格 1 ml 的培養液，置放 抑制劑 (protease inhibitor) 與磷酸酶抑制劑 (phosphatase inhibitor) 的裂解緩 衝液 (lysis buffer)，放在速度為 100 rpm 的平面震盪器 5 分鐘。將細胞混合 液收集至微量離心管，於溫度 4℃ ，速度 14000 rpm ，離心 10 分鐘，除去 細胞殘骸。只取上清液，避免吸到沉澱物，保存於 -80 ℃ 冰箱。
二、蛋白質濃度測定
本實驗使用 Bradford 測定法測定蛋白質濃度，Protein Assay Dye 含有 Coomassive Brilliant Blue G-250 染劑與蛋白質結合後，顏色由紅棕色轉變為藍 色， O.D. 值在波長 595 nm 有最大吸收值，藉此測量樣本蛋白質濃度。首先，
‧ polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
將完成膠體裝置在電泳槽，小心地移除齒梳，倒入預冷的電泳緩衝液 (tank buffer) ，電泳緩衝液需要蓋過膠體及電泳槽。將配置完成的20 μl 蛋白質樣本注 入至膠體的膠孔中，PageRuler Prestained Protein Ladder 與 5X loading dye、
滅菌 ddH2O 混合後加至樣本旁的膠孔，以便觀察不同分子量大小的蛋白質分離 情形。架設完成的電泳槽放在冰上，將電源供應器設定最大電壓 300 伏特 及 每片膠體固定電流 30 mA，進行不同分子量的蛋白質分離。等待樣本跑至底部 後，再將膠體取下。
‧
70 rpm 的轉速清洗 10 分鐘，將 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) 膜剪適當大小後，浸泡在 100 % 甲醇 (methanol) 中，輕輕搖晃 30 秒，接著 (1:100000)、rabbit anti-Phospho-Erk1/2 antibody (1:1000)、rabbit anti-Erk1/2 (1:1000)。裁剪的 PVDF 膜用無氯塑膠膜封起，加入一級抗體，放置在轉速為 20 peroxidase conjugated antibody (1:10000)、goat anti-rabbit IgG horseradish‧ 國
立 政 治 大 學
‧
Na tiona
l Ch engchi University
26
peroxidase conjugated antibody (1:10000)。完成反應後以 0.1 % TBST 清洗，
放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分鐘、 10 分 鐘、 10 分鐘。以 immobilon Western chemiluminescent HRP substrate 完全 覆蓋於 PVDF 膜上，使用電泳膠影像系統擷取影像。所得到之影像以 ImageJ 軟 體進行量化分析。
若是同一張 PVDF 膜需要進行其他抗體免疫轉漬，將 PVDF 膜浸泡在約 15 ml 的 stripping buffer 中，放置於轉速為 70 rpm 的平面震盪器上，室溫下 反應 15 分鐘。完成反應後，先以 ddH2O 沖洗掉 stripping buffer，再以 0.1 %
若是同一張 PVDF 膜需要進行其他抗體免疫轉漬，將 PVDF 膜浸泡在約 15 ml 的 stripping buffer 中，放置於轉速為 70 rpm 的平面震盪器上，室溫下 反應 15 分鐘。完成反應後，先以 ddH2O 沖洗掉 stripping buffer，再以 0.1 %