第三章、 實驗結果
第四節、 雙酚類化合物加強 NGF 對於 PC12 細胞神經突生長之影響
0.1、0.3、及 1 μM 的雙酚類合成物 (MH101、MH102、MH103、MH104、MH106、
MH107 與 MH111)，觀察神經突生長的情形。
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現象。而 MH101、MH102、MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111 皆 以濃度 0.3μM 為加強神經突生長的最好濃度。若雙酚化合物 MH101、MH102、‧ 國
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MH103、MH104、MH106 與 MH111 濃度至 1μM，神經突生長反而是減少的情 形。
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(A)
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圖 14、不同濃度 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 25 ng/ml 與 50 ng/ml 誘導神經突生長。 (A) 在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情形。 (B) 測量神經突長度之 統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆為兩重複，數 值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實驗結果以單因子變 異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001 與對照組比較。圖中 比例尺為 200μm。
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圖 15、不同濃度 MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH101 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001，* 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
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圖 16、不同濃度 MH102 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH102 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
(B)
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圖 17、不同濃度 MH103 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH103 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
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圖 18、不同濃度 MH104 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH104 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
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圖 19、不同濃度 MH106 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH106 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
(B)
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圖 20、不同濃度 MH107 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH107 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
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(A)
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圖 21、不同濃度 MH111 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。
PC12 細胞密度 5 × 104，分別以濃度 0.1 μM、0.3 μM、1 μM MH111 及 25 ng/ml NGF 加強神經突生長。 (A)在顯微鏡物鏡 10X 視野下 PC12 細胞神經突生長情 形。 (B) 測量神經突長度之統計圖表。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，
各組別樣品數皆為兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以 對照組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，
並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p <
0.001 與對照組比較，# 與單獨處理 25 ng/ml NGF 比較。圖中比例尺為 200μm。
表 3、雙酚化合物對於 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長情形之比較
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(C)
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(D)
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(F)
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(G)
(H)
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圖 22、MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞在不同時間 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 之 表現。
(A) 將濃度 0.1、 0.3 及 1 μM 的 MH101 與 25 ng/ml NGF 同時處理 PC12 細 胞 2 分鐘時 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 的表現。(B) 處理 5 分鐘時 Erk1/2 與磷酸 化 Erk1/2 的表現。(C) 處理 10 分鐘時 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 的表現。(D) 處 理 15 分鐘時 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 的表現。(E) 處理 1 小時時 Erk1/2 與磷酸 化 Erk1/2 的表現。(F) 處理 6 小時時 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 的表現。(G) 處理 24 小時時 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 的表現。(H)綜合不同時間點磷酸化 Erk1/2 與 Erk1/2 比值的變化統計圖。實驗數據來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品 數皆兩重複以上，實驗數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均先除以 β-actin，再以磷酸化 Erk1/2 除以 Erk1/2 之數值。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以 Student-Newman-Keuls test 進行 後測。
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第五節、MH101 對於 NGF 引起 STAT3 磷酸化之影響
先前文獻指出 NGF 透過 Erk1/2 路徑促進神經突生長會受 STAT3 磷酸化的 影響，但和厚朴酚是否會透過 STAT3 路徑調控細胞分化的情形，目前尚未有清 楚的研究表示。因此，實驗接著探討新合成雙酚化合物對於神經突生長的情形，
STAT3 的活化是否也參與其中。而先前文獻指出，在 PC12 細胞，STAT3 的活 化的位置為 S727，因此，本實驗所適用之抗體為磷酸化 STAT3 S727。
將濃度 0.1、 0.3 及 1 μM 的 MH101 與 25 ng/ml NGF 同時處理 PC12 細 胞，分別處理不同時間： 5 分鐘、10 分鐘、1 小時以及 24 小時，再以西方點墨 法觀測 STAT3 與磷酸化 STAT3 的蛋白質表現量。由圖 23 (A) 顯示五分鐘時 STAT3 磷酸化的情形，處理 50 ng/ml NGF 相較於 25 ng/ml NGF，磷酸化 STAT3 的表現較高，當同時處理 NGF 與不同濃度 MH101 的組別(0.1 μM、0.3 μM 與 1 μM)與單獨處理 25 ng/ml NGF 相比，反而顯著降低 STAT3 磷酸化的情況。隨著 時間的增加，磷酸化 STAT3 的表現隨之減少，但在處理 24 小時時，磷酸化 STAT3 有些微回升的情形。
由 STAT3 磷酸化實驗結果發現，新合成雙酚化合物對於 NGF 處理 PC12 細胞後，亦不是透過 STAT3 路徑加強神經突生長。
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(A)
(B)
(C)
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(D)
圖 23、MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞在不同時間 STAT3 與磷酸化 STAT3 之 表現。
(A) 將濃度 0.1、 0.3 及 1 μM 的 MH101 與 25 ng/ml NGF 同時處理 PC12 細 胞 5 分鐘時 STAT3 與磷酸化 STAT3 的表現。(B) 處理 10 分鐘時 STAT3 與磷酸 化 STAT3 的表現。(C) 處理 1 小時時 STAT3 與磷酸化 STAT3 的表現。(D) 處 理 24 小時時 STAT3 與磷酸化 STAT3 的表現。實驗數據來自三次獨立實驗結果，
實驗數值均以 mean 表示，各組別之數值均先除以 β-actin，再以磷酸化 STAT3 除以 STAT3 之數值。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進 行統計分析，並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測。
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缺血性心臟病、癌症之後的第三大死因(Broderick et al, 1998)。而老化常見的相 關 疾 病 ， 包 括 阿 茲 海 默 症 (Alzheimer's disease) 與 帕 金 森 氏 症 (Parkinson’s 2003; Leonard et al, 2003; Martinez et al, 2000)。亦有文獻指出傳統中藥厚朴萃 取的主要成分為雙酚化合物，像是厚朴酚及和厚朴酚，具有抗氧化和神經保護與‧
浸潤防止因再灌注而造成大鼠大腦缺血(Liou et al, 2003)。在體外研究發現，和 厚朴酚透過減少 ROS 的產生與抑制細胞內鈣離子的增加和抑制 caspase-3
Leonard et al, 2003; Martinez et al, 2000; Lin et al., 2006)。綜合本研究上述結 果，新合成化合物與合成和厚朴酚 MH101 對於神經保護有相似效果，甚至更 有潛力作為神經保護的治療藥物。
文獻指出，厚朴酚與和厚朴酚在大鼠皮層神經元與神經幹細胞的具有神經滋 養作用(Fukuyama et al., 2002; Zhai et al., 2005a)。因此，為了確認合成厚朴酚 MH101 與新合成雙酚類化合物的神經滋養效果，PC12 細胞直接處理雙酚類化 需要透過 NGF 誘導神經生長因子誘導神經突生長(Greene and Tischler, 1976)，
本實驗以 NGF 誘導 PC12 細胞分化，並同時給予雙酚化合物，觀察新合成雙 酚化合物對於 NGF 誘導神經突生長的影響。NGF 的使用濃度一開始為 50 ng/ml，但實驗結果發現雙酚化合物對於神經突生長沒有差別，推測 50 ng/ml
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MH102、MH103、MH104、MH106 與 MH111 濃度至 1μM，神經突生長的總長 度反而是減少的情形。
NGF 與和厚朴酚是透過活化 Erk1/2 促進神經突生長 (Perron and Bixby, 1999; Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b; Lee et al., 2009b; Kaplan, 2000)。在 PC12 細胞，單獨處理 NGF 時，隨著 NGF 濃度增加，Erk1/2 磷
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飢餓狀態時，細胞內的 ROS 會增加，並走向細胞死亡(Scherz-Shouval and Elanar, 2007)。本論文以 NGF 誘導 PC12 細胞分化，處理 NGF 前，會使細胞 處於飢餓狀態 4 小時，因此推測細胞內 ROS 因飢餓狀態而增加。當同時處理 NGF 與雙酚化合物時，可能是為了保護細胞走向死亡，抑制 Erk1/2 的活化。因 此，在短時間內 Erk1/2 活化的表現顯著減少。‧ 國
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第五章、 結論
綜合本實驗結果，新合成雙酚化合物 MH101, MH102、MH103、MH104、
綜合本實驗結果，新合成雙酚化合物 MH101, MH102、MH103、MH104、