雙酚合成物抑制氧化壓力及加強神經生長因子誘導神經突生長 - 政大學術集成

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(1)國立政治大學神經科學研究所碩士論文. 雙酚合成物抑制氧化壓力及加強神經生長因子誘導神經突生長治. 立. 政. 大. ‧ 國. 學. The novel biphenol compounds inhibit oxidative. ‧. stress and enhance nerve growth factor. Nat. n. al. er. io. sit. y. (NGF)-induced neurite outgrowth. Ch. engchi. i n U. v. 研究生：林芊瑜撰指導教授：詹銘煥博士. 中華民國 104 年 7 月 14 日.

(2) 謝誌在政大神科所的日子裡，感謝所上老師在課業上的教導，也感謝指導老師─詹銘煥老師除了給予我在研究上的幫助，亦給予我許多成長的空間，還有感謝班導師─趙知章老師的用心，關心著我們的課業與生活。在這兩年研究所的生活中，深深的感謝與滿滿的感恩，讓我收穫良多。除了受到許多人的幫助與鼓勵外，也在這裡感受到許多溫暖！感謝在大學期間的游仲逸老師，除了建立了我在做研究上的基礎，同時也開啟我對研究的興趣與熱忱，以及當時許多的學長姊的指導與陪伴。而在大學能有機會出國. 政治大經驗，讓我在研究所時能更加順利！立. 參加國際性的研討會，更加開拓我對生醫領域的視野。也正因為有大學參與實驗室的. ‧ 國. 學. 進入神科所的第一年，是我最快樂也最充實的一年。從進到神經藥理實驗室，有親愛的筱玉，帶我進行小鼠的實驗，因為第一次接觸動物實驗，學習的過程中碰到不. ‧. 同的問題與困難，都是小玉帶我一一解決。安安王爺時不時地屁話中，總會出現一些. sit. y. Nat. 建議與關心。在進行細胞實驗時碰到問題，還有于姐的銘銘可以詢問與討論。當我第. er. io. 一次在新環境報告 seminar 時的緊張與不安，筱玉和宇銘陪我練習到將近半夜。而小. al. v i n Ch 主動給我幫助，到畢業離校後，時不時會回來關心我，甚至在我研究所最重要的日子， engchi U n. 潔總是做出讓我感動的事，從我在報告時碰到不懂的部分，她會默默的找資料理解後，. 特地回來旁聽我的論文口試，替我加油打氣。當學長姐畢業離校後，還有綺翊與玫汝時不時貼心的舉動，總是讓我感到窩心。而在神科所，最重要最少不了的溫暖來源，就是全政大最正的于姐，也是我親愛大嫂。當我遇到問題時，有于姐的幫助；當心情沮喪時，有于姐的安慰。只要有于姐在的地方，總是充滿著歡笑與快樂。我想，離開神科所我最捨不得的人，就是于姐了！當我遇到心情好的事情，有朋友們可以分享，當我心情沮喪，碰到挫折時，有朋友們可以傾訴，需要幫助或陪伴時，朋友們會義不容辭的跳出來。這些朋友們，都是我在求學過程中，認識到的知己，儘管她們有些人身處在遙遠的國外，我們之間除了 II.

(3) 距離還隔著時差，但我總是能隨時感受到她們的關心與陪伴。而同樣身處在台灣的朋友們，都可以隨時給予我照應與幫助。能與朋友一起進步，也是我最開心的事了！在我的成長過程中，最重要的家人，爸爸、媽媽與哥哥們，總是給予我鼓勵，給予我支持，做我最堅強的後盾。我最愛你們了！在這一路上所碰到的人事物，讓我學習、讓我成長。心中滿滿的感恩，讓我能夠身處在這種幸福當中！. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. III. i n U. v.

(4) 中文摘要人類隨著年齡增長後中樞神經系統的修補及再生能力逐漸下降，一旦神經系統受到傷害，是很嚴重的問題。因此，引導或促進神經細胞生長甚至再生的方法，中樞神經受損患者將獲得更有效的治療。先前已有文獻指出由植物厚朴萃取的天然化合物─ 和厚朴酚，具有抗氧化、抗腫瘤、抗發炎、神經保護與滋養的作用。在不同疾病模式的囓齒動物實驗，如帕金森氏症、阿茲海默症、癌症與腦缺血疾病等，和厚朴酚皆具有預防疾病或減緩症狀的效果。本篇研究使用和厚朴酚之衍生物─新合成雙酚化合物. 治政大護與滋養作用。透過腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤 PC12 細胞預先處理新合成雙酚化合物，立. (MH102、MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111)，並探討對於神經細胞的保. 並以過氧化氫(H2O2)使細胞產生氧化壓力，使用活性氧檢測試驗(DCFH-DA assay)偵. ‧ 國. 學. 測細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的含量。實驗結果顯示，預先處理較. ‧. 高濃度(3-10μM)的新合成雙酚化合物顯著降低過氧化氫所產生的氧化壓力。另以 H2O2 誘導 PC12 細胞死亡，並使用 MTT 試驗法，觀測新合成雙酚化合物對於細胞存活的. y. Nat. er. io. sit. 影響。結果顯示新合成雙酚化合物顯著減少 H2O2 造成的細胞死亡。於神經滋養實驗，發現新合成雙酚化合物無法直接誘導 PC12 細胞的神經突生長。因此，使用神經滋養. al. n. v i n 因子(nerve growth factor, NGF)誘導 C hPC12 細胞神經突生長，發現新合成雙酚化合物 engchi U 在低濃度(0.1-0.3μM)顯著加強神經突生長。然而雙酚化合物加強 NGF 誘導神經突生長之機制，並非透過活化細胞外信號調節激酶 (extracellular-signal-regulated kinases, Erk1/2)與訊息傳遞轉錄活化基因-3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)，Erk1/2 的活化在短時間內(5 至 10 分鐘) 反而減少，STAT3 的活化則沒有差異。由此推論，新合成雙酚化合物的保護作用是透過減少 ROS 的產生，並可以加強 NGF 對於 PC12 細胞的神經突生長，但不是透過 Erk1/2 或 STAT3 路徑所致。關鍵字：雙酚化合物、腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤、神經保護、神經突生長、細胞外信號調節激酶(Erk1/2)、訊息傳遞轉錄活化基因-3(STAT3) IV.

(5) Abstract Neural impairment or death is a serious problem, because the neuronal regeneration in central nerve system (CNS) is dramatically declined with aging. If there is a new approach to induce neurite outgrowth or neuron regeneration, this treatment may be more effective in patients with severe neuronal injury. Magnolia officinalis has been used as a traditional medicine in Asia for the treatment of thrombotic stroke, nervous disturbance, and gastrointestinal complaints. The biphenol compound honokiol, constituent of the Magnolia plant, has been shown to induce not. 政治大 and neuroprotective effects.立 Our previous findings have shown that the new synthetic. only anti-oxidative, anti-inflammatory and anti-cancer effects, but also neurotrophic. ‧ 國. 學. biphenol compounds exhibit the anti-oxidative and anti-inflammatory activities in in vitro and in vivo studies. Moreover, these biphenol compounds could prevent and. ‧. reverse neuronal damage induced by neurotoxins. Thus, we predicted that the novel. sit. y. Nat. biphenol compounds may conduct the trophic and protective effects on neurons.. al. er. io. Using the PC12 cell model, it was observed that biphenol compounds at higher. v. n. concentrations of 3-10 μM reduced the increases in reactive oxygen species (ROS). Ch. engchi. i n U. level and cell damage induced by hydrogen peroxide (H2O2) exposure for one hour. Biphenol compounds at high concentration (10-30μM) also decreased the cell death by H2O2 exposure for 24 hours. As to the neurotrophic effects, biphenol compounds alone did not induce neurite outgrowth. However, these biphenol compounds significantly potentiated nerve growth factor (NGF) induced neurite outgrowth in a concentration-dependent manner (0.1-1 μM). Since activation of extracellular signal-regulated protein kinase 1/2 (Erk1/2) is known for the signal of neurite outgrowth, NGF sufficiently enhanced phospho-Erk1/2 expression in 15 min treatment. When PC12 cells were co-treated with NGF and biphenol compounds, the level of V.

(6) phospho-Erk1/2 expression was decreased under the period of time 5-10 min. Previous studies indicated that STAT3 activation regulates the NGF signaling. When PC12 cells co-treated with NGF and biphenol compounds, STAT3 activation was insignificant. Taken together, these biphenol compounds. may have the. neuroprotective activity and potentiation of neuritogenesis. And the pharmacological mechanism is not via activation of Erk1/2 and STAT3 signal. Key words: biphenol compounds, PC12 cell, neuroprotection, neurite outgrowth, Erk1/2, STAT3. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. VI. i n U. v.

(7) 目錄謝誌 .................................................................... II 中文摘要 ............................................................... IV Abstract ................................................................ V 目錄 ................................................................... VII 表次 .................................................................... X 圖次 ................................................................... XI 縮寫與中英對照表 ....................................................... XII. 治政第一章、緒論 ........................................................... 1 大立第一節、前言 ....................................................... 1 ‧ 國. 學. 第二節、嗜鉻性細胞瘤細胞 (PC12 cell) ............................... 1 PC12 細胞簡介 ............................................ 1. 二、. PC12 細胞之分化 .......................................... 1. ‧. 一、. y. Nat. io. sit. 第三節、神經生長因子 (Nerve growth factor, NGF) ..................... 3. n. al. er. 第四節、雙酚化合物 (Biphenol compounds) ........................... 5. Ch. i n U. v. 一、. 厚朴分化合物 .............................................. 5. 二、. 和厚朴酚 (Honokiol) ........................................ 6. 三、. 和厚朴酚之衍生物 .......................................... 6. engchi. 第五節、自由基簡介 (Free radical) ................................... 7 一、. 活性氧 .................................................... 7. 二、. 抗氧化系統 ................................................ 7. 三、. 抗氧化物質 (Antioxidant). .................................. 8. 第六節、細胞外信號調節激酶 (Extracellular-signal-regulated kinases, Erk1/2) ........................................................... 9 VII.

(8) 第七節、訊息傳遞轉錄活化基因-3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) .................................... 10 第八節、實驗目的與假說 ............................................ 11 第二章、實驗材料與方法 ................................................ 12 第一節、化學藥品與儀器 ............................................ 12 一、化學藥品................................................. 12 二、藥品製備................................................. 14 三、儀器設備................................................. 16. 治政大細胞株培養 ............................................... 18 立. 第二節、細胞培養 .................................................. 18 一、. 繼代培養與計數 ........................................... 19. 三、. 細胞冷凍保存 ............................................. 19. 四、. 細胞解凍 ................................................. 19. ‧. ‧ 國. 學. 二、. 第三節、藥物處理 .................................................. 20. y. Nat. er. io. sit. 第四節、活性氧檢測試驗 ............................................ 21 第五節、細胞存活率試驗法─MTT 試驗法 ............................. 22. al. n. v i n 第六節、神經突生長 (Neurite C houtgrowth assay)U....................... 23 engchi 第七節、西方點墨法 ................................................ 23 一、. 蛋白質萃取 ............................................... 23. 二、. 蛋白質濃度測定 ........................................... 23. 三、. 蛋白質樣品配置 ........................................... 24. 四、. 鑄膠 ..................................................... 24. 五、. 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 ......................... 24. 六、. 轉漬 ..................................................... 25. 七、. 免疫轉漬 ................................................. 25 VIII.

(9) 第八節、實驗數據分析 .............................................. 26 第三章、實驗結果 ...................................................... 27 第一節、過氧化氫引起嗜鉻性細胞瘤細胞 PC12 之氧化壓力 .............. 27 第二節、雙酚類合成物對於 H2O2 處理後 ROS 含量之影響 .............. 30 第三節、雙酚類合成物對於 H2O2 處理後細胞存活率之影響 .............. 47 第四節、雙酚類化合物加強 NGF 對於 PC12 細胞神經突生長之影響 ...... 54 第五節、 MH101 對於 NGF 處理後 Erk1/2 磷酸化表現之影響 ............. 72. 第六節、 MH101 對於 NGF 處理後 STAT3 磷酸化表現之影響 ............. 77. 治政大第五章、結論 .......................................................... 84 立第四章、討論 .......................................................... 80. 參考文獻 ............................................................... 85. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. IX. i n U. v.

(10) 表次表 1、雙酚化合物對於 H2O2 處理後 ROS 生成影響之比較。表 2、雙酚化合物對於 H2O2 處理後細胞存活率影響之比較。表 3、雙酚化合物對於 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長情形之比較。. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. X. i n U. v.

(11) 圖次圖 1、厚朴類化合物分子結構圖圖 2、細胞存活試驗 ─ MTT 試驗法藥物處理流程。圖 3、活性氧檢測試驗藥物處理流程。圖 4、神經突生長實驗處理流程。圖 5、H2O2 對於 PC12 細胞 ROS 生成之影響。圖 6、MH101 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。圖 7、MH102 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。. 政治大處理後立 ROS 生成之影響。. 圖 8、MH103 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。圖 9、MH104 對於 H2O2. ‧. ‧ 國. 圖 11、MH107 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。. 學. 圖 10、MH106 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。. 圖 12、MH111 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。. y. sit. Nat. 圖 13、雙酚類合成物對於 H2O2 處理後細胞存活率之影響。. er. io. 圖 14、不同濃度 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。. al. v i n C h PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 16、不同濃度 MH102 與 NGF 處理 engchi U n. 圖 15、不同濃度 MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。. 圖 17、不同濃度 MH103 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 18、不同濃度 MH104 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 19、不同濃度 MH106 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 20、不同濃度 MH107 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 21、不同濃度 MH111 與 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長之情形。圖 22、MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞在不同時間 Erk1/2 與磷酸化 Erk1/2 之表現。圖 23、MH101 與 NGF 處理 PC12 細胞在不同時間 STAT3 與磷酸化 STAT3 之表現。. XI.

(12) 縮寫與中英對照表 AD. Alzheimer’s disease. Aβ. Beta-amyloid. BBB. Blood brain barrier. BCSFB. Blood cerebrospinal fluid barrier. BFC. Basal forebrain complex. CNS. Central nervous system. CNTF. Ciliary neurotrophic factor. EGF. Epidermal growth factor. Erk1/2. 政治大 Extracellular signal-regulated kinase 立 Se-dependent glutathione peroxidase. HGF. Hepatocyte growth factor. IL-6. Interleukin-6. LIF. Leukemia inhibitory factor. MAPK. Ras-mitogen activated protein kinase. NF-κB. Nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells. NGF. Nerve growth factor. PI3K. Phosphatidylinositol 3-kinase. PLC. Phospholipase C. PNS. Peripheral nervous system. PVDF. Polyvinylidene difluoride. ROS. Reactive oxygen species. SDS. Sodium dodecyl sulfate. SOD. Superoxide dismutase. ‧. ‧ 國. 學. GSH-Px. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. XII. i n U. v.

(13) 第一章、緒論第一節、前言老化、中風和遺傳疾病，或是運動和意外傷害而導致神經受損，都是很嚴重的問題，因為人類在成年後神經細胞在中樞神經系統的修補及再生能力相對減弱，一旦神經系統受到損害，患者可能變成癱瘓或衰老致死。因此，研究學者努力尋找能夠引導神經細胞生長甚至是再生的方法，希望能夠使患者受損的神經細胞得到更有效的治療。已有文獻指出雙酚化合物和厚朴酚 (honokiol) 具有抗發炎、抗腫瘤、抗微. 政治大. 生物活性、抗氧化和神經保護與滋養的作用。故本研究以體外實驗方式，除了進. 立. 一步探討和厚朴酚的新合成物 MH101 及其衍生物 MH102、MH103、MH104、. ‧ 國. 學. MH106、MH107 與 MH111 對於氧化壓力導致細胞死亡是否有保護的效果外，同時也探討這些雙酚化合物對於類神經細胞是否有滋養的作用，進而促使受損神. ‧. 經細胞恢復功能。. n. Ch. engchi. er. io. al. 一、 PC12 細胞簡介. sit. y. Nat. 第二節、嗜鉻性細胞瘤細胞(PC12 cell). i n U. v. PC12 細胞株是由大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤 (rat adrenal medulla pheochromocytoma)選殖而成(Greene and Tischler, 1976)。. 二、 PC12 細胞之分化在培養未分化 PC12 細胞的過程中，透過神經成長因子(nerve growth factor, NGF)誘導後，細胞會開始進行分化，形態上具有神經突生長與分枝。而分化後的 PC12 細胞，類似於交感神經細胞，可以分泌儲存兒茶酚胺類(catecholamine)，例如多巴胺(dopamine)及正腎上腺素(norepinephrine)等神經傳導物質(Greene and Tischler, 1976)。由於 PC12 細胞具有上述類似神經細胞的特性，因此被廣. 1.

(14) 泛應用在神經分化、神經毒性與神經保護機制等研究。所以本研究使用此 PC12 細胞探討雙酚化合物的神經保護與滋養作用。. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 2. i n U. v.

(15) 第三節、神經生長因子 (Nerve growth factor, NGF) 神經生長因子(NGF)屬於神經營養因子(neurotrophin)家族中的一員，由 NGF 基因所轉譯出的蛋白(Ebendal, 1992)。NGF 對於周圍神經系統(peripheral nervous system, PNS)的神經細胞發育與存活扮演重要的角色，尤其是作用在交感神經元以及感覺神經元，PNS 的表型特徵和 NGF 密切相關，像是神經分佈的密度、細胞體的大小、軸突終端的出芽、樹突的分枝、誘導或抑制神經肽 (neuropeptides)和神經傳遞物質，或製造傳遞物質的蛋白酶(Aloe et al., 1997)。在中樞神經系統(central nervous system, CNS)，NGF 除了在皮層(cortex)、海. 政治大節(basal ganglia)、丘腦(thalamus)、脊髓(spinal cord)和視網膜(retina)同樣有顯立. 馬迴(hippocampus)和腦垂體(pituitary gland)大量表現外，在其他區域像是基底. ‧ 國. 學. 著的表現(Dreyfus, 1989; McAllister, 2001)。NGF 調控基底前腦(basal forebrain complex, BFC)膽鹼能神經(cholinergic neuron)的發育與維持，而影響的功能包. ‧. 括注意力、覺醒、動機、記憶和意識(Dreyfus, 1989)。因為在 BFC 的神經元高. sit. y. Nat. 度影響阿茲海默症（Alzheimer’s disease, AD），且 NGF 已被指出可以調控阿茲. al. er. io. 海默症 β 類澱粉蛋白質(beta-amyloid, Aβ)的生成與堆積，因此 NGF 對於神經退. v. n. 化疾病具有潛在保護性或療效 (Allen and Dawbarn, 2006; Matrone et al., 2008)。. Ch. engchi. i n U. NGF 的功能會通過結合上神經細胞表面的受體，啟動訊號傳遞至細胞內。而 NGF 蛋白可以結合兩種不同的受體，一個是 tropomyosin kinase receptor A (TrkA)，另一個是 non-selective p75 pan-neurotrophin receptor (p75NRT)。這兩種受體皆被發現在感覺神經元及其他類型的神經細胞表面。TrkA 是一種典型酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor) (Huang and Reichardt, 2003)，NGF 透過 TrkA 激活的訊號主要為促分裂原活化蛋白激酶(ras-mitogen activated protein kinase, MAPK)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、磷酸肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)以及 C 型磷脂酶. 3.

(16) (phospholipase C, PLC) (Klesse and Parada, 1999; Chao et al., 2006; Reichardt, 2006)。而 p75NRT 是一種跨膜糖蛋白，可以調節 TrkA 的傳遞訊號 (Friedman and Greene, 1999; Schor, 2005; Reichardt, 2006)。但當 TrkA 與 p75NRT 沒有同時表現時，NGF 結合 p75NRT 會傳遞細胞凋亡(apoptosis)的訊號使細胞走向死亡(Friedman and Greene, 1999; Miller and Kaplan, 2001; Schor, 2005)。p75NRT 所激活的訊號為 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK) 、核因子活化. B. 細胞 κ 輕鏈增強子 (nuclear. factor. kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB) 以及神經醯胺. 政治大. (ceramide)的產生(Levi-Montalcini, 1987)。. 立. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 4. i n U. v.

(17) 第四節、雙酚類化合物 (Biphenol compounds) 一、厚朴類化合物厚朴(Magnolia officinalis)屬於木蘭科落葉喬木植物，是一種用來鬆弛肌肉、鎮靜中樞神經，並可以治療傷寒、中風、感冒等疾病的亞太地區傳統用藥，而科學研究從厚朴樹皮萃取出的雙酚類物質如厚朴酚(magnolol)、和厚朴酚(honokiol) 及 4-O-methylhonokiol 等，其化學分子結構式如圖 1。已有研究發現這些雙酚類物質在活體外實驗，除了具抗氧化、抗發炎、抗微生物活性等作用外，對於神經細胞在毒性的環境下同樣具有保護作用，並且加強神經細胞的存活率(Ogata et. 政治大. al., 1997; Ho et al., 2001; Lee et al., 2005; Hoi et al., 2010a)。厚朴酚與和厚朴. 立. 酚在大鼠皮層神經元與神經幹細胞的具有神經滋養作用(Fukuyama et al., 2002;. ‧ 國. 學. Zhai et al., 2005a)，4-O-methylhonokiol 可避免受 Aβ 誘導的神經細胞死亡(Lee et al., 2009a)，也可以促進大鼠胚胎幹細胞神經突的生長(Lee et al., 2009a)。亦. ‧. 有研究指出厚朴類化合物是透過活化細胞外信號調節激酶 (extracellular. y. Nat. sit. signal-regulated kinases, Erk1/2)蛋白調節神經細胞的分化、神經突增長以及神. n. al. er. io. 經元存活(Perron and Bixby, 1999; Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b;. i n U. v. Lee et al., 2009b)。在活體上厚朴類化合物對於神經退化疾病模式的小鼠，像是. Ch. engchi. 帕金森氏症和阿茲海默症等，可以預防老鼠的學習能力及記憶的損害(Matsui et al., 2009)，而在癌症小鼠的研究上可以抑制腫瘤生長(Bai et al., 2003)。 (圖 1) Honokiol. Magnolol. 5. 4-O-methylhonokiol.

(18) 二、和厚朴酚 (Honokiol) 和厚朴酚屬於脂溶性化合物，可以直接通過血腦屏障(blood brain barrier, BBB) 與血腦脊液屏障(blood cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)，故能進到中樞神經系統產生藥理作用達到治療效果 (Wang et al., 2011)。和厚朴酚具有抗腫瘤的作用，相較於一般抗腫瘤藥物只能透過單一路徑使癌細胞走向細胞凋亡(apoptosis)，和厚朴酚則可以透過抑制調控癌細胞生長的 p53、 Ras 以及 NF-kB 等多條路徑促使細胞凋亡(Dikalov et al., 2008; Fried and Arbiser, 2009; Xu et al., 2011)。和厚朴酚的抗發炎作用，是透過抑制 TNFα活. 政治大 2005)。而抗焦慮作用，除了在活體外研究指出與 GABA 受體相互作用外，在活立. 化的 NF-kB 與 NF-kB 下游的目標基因像是 VEGF、ICAM-1 與 COX-2(Tse et al.,. ‧ 國. 學. 體研究也會增加海馬迴乙醯膽鹼(acetylcholine)的釋放，藉以達到抗焦慮的效果 (Hou et al., 2000; Ai et al., 2001)。和厚朴酚同樣具有神經保護的作用，在 2010. ‧. 年的體外研究發現，和厚朴酚透過減少活性氧(ROS)的產生與抑制細胞內鈣離子. sit. y. Nat. 的增加和抑制 caspase-3 活性，顯著減少 Aβ 誘導神經細胞死亡(Hoi et al.,. al. er. io. 2010b)。在囓齒動物實驗，顯示和厚朴酚可以減少在大腦發炎和氧化達到預防. v. n. 腦缺血所造成的損傷，對於小腦顆粒細胞也具有神經保護的作用(Lin et al., 2006; Chen et al., 2007)。. Ch. engchi. i n U. 三、和厚朴酚之衍生物實驗室先前新合成的雙酚化合物 MH102、MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111(Tripathi et al., 2012)，已發現具有神經保護的作用，得以對抗神經毒素及氧化毒害。而本論文對於這些雙酚化合物神經保護作用與滋養作用做進一步的探討. 6.

(19) 第五節、自由基之簡介 (Free radical) 自由基為帶有一個單獨不成對的電子的原子、分子或離子，可能產生於人體的任何部位，例如細胞內進行氧化作用產生能量的粒腺體，也是產生自由基的主要胞器。一般的化學物質是由原子與分子組成，會攜帶成對的電子維持在穩定的狀態，而自由基含有不成對電子，因此需要搶奪其它原子或分子的電子湊成對，才能轉為穩定狀態。但若自由基搶奪墊子的對象為蛋白質、脂質等，最後會導致細胞處於氧化狀態，進而對細胞造成影響。其中，在生物體內容易產生的自由基為活性氧。. 政治大. 一、活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS). 立. 活性氧是生物在代謝過程中的一種副產物，包括氧離子、過氧化物和含氧自. ‧ 國. 學. 由基等。在自然界中，三重態氧(triplet state oxygen, 3O2)是氧最安定的存在。生物體內容易產生的活性氧，是由安定的氧分子經不同的途徑形成：. ‧. (1) 單重態氧 (singlet oxygen, 1O2). Nat. sit. y. (2) 超氧陰離子 (superoxide anion, O2-˙)：O2 + e- → O2 - •. n. al. er. io. (3) 過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2)：HO2 • + e- + H → H2O2. i n U. v. (4) 羥自由基 (hydroxyl radical, •OH)：H2O2 + e- → • OH + OH這些物質統稱為 ROS。. Ch. engchi. 當有過多的 ROS 存在時，會以各種途徑對人體進行氧化傷害，例如：傷害遺傳因子 DNA、破壞不飽和脂肪酸引起脂質過氧化作用、破壞蛋白質並干擾蛋白質活性、刺激單核白血球及巨噬細胞的不正常反應引起發炎反應、引起細胞的惡化變形與死亡、發生基因突變致癌等。. 二、抗氧化系統在正常情況下，生物體中具有抗氧化系統來清除過多的自由基。抗氧化系統分為兩個部分，一部分為抗氧化酵素抗氧化物質，另一部分則為非酵素性抗氧化物質，兩者以交互協同作用來清除活性氧與自由基，保護生物體免受到活性氧物 7.

(20) 質的氧化性傷害。酵素性抗氧化系統主要含有超氧化歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (catalase) 與谷胱甘肽過氧化物酶 (Se-dependent glutathione peroxidase, GSH-Px)等，SOD 會促使超氧陰離子轉化成過氧化氫，使超氧陰離子清除，過氧化氫酶與 GSH-Px 再將過氧化氫還原成水和氧，另外，GSH-Px 也可以將脂質過氧化物還原成無毒害產物(Kurata et al., 1993)。非酵素性抗氧化物質，主要包括維生素 E (vitamin E)、維生素 C (vitamin C) 與穀胱甘肽(glutathione, GSH)等。維生素 E 是一種脂溶性維生素，可以直接與. 政治大溶性抗氧化劑，除了可以直接消除自由基外，亦可將維生素 E 還原。穀胱甘肽立. 自由基反應，與脂質共存並保護膜上的不飽和脂肪。維生素 C 為細胞內主要的. 由麩胺酸-胱胺酸-甘胺酸 (γ-Glu-Cys-Gly) 所組成，以兩種型態存在於人體，還. ‧ 國. 學. 原型 (G-SH) 與氧化型 (G-S-S-G)。當體內有 H2O2 時，反應為 H2O2 + 2 GSH. ‧. → GSSG + 2 H2O。穀胱甘肽還原酶 (glutathione reductase) 則將氧化型穀胱. sit. y. Nat. 甘肽還原成還原型穀胱甘肽(Sinet et al., 1977)。. io. al. er. 三、抗氧化物質(Antioxidant). v. n. 抗氧化物質除了上述提到的維他命 C 與維他命 E 外，還有 β-胡蘿蔔素。-. Ch. engchi. i n U. 胡蘿蔔素廣泛存在於自然界，是一種脂溶性色素，為維生素 A 的前趨物，但維生素 A 並不像 β-胡蘿蔔素具有良好的抗氧化作用。-胡蘿蔔素在體內可以消除單重態氧的毒性及作為自由基的清除劑，特別是可以消除吞噬細胞所產生的過多自由基。. 8.

(21) 第六節、細胞外信號調節激酶 (Extracellular-signal-regulated kinases, Erk1/2) Erk1/2 屬於絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases ， MAPKs)家族，ERK 1 與 ERK 2 分子量分別為 44kD 與 42kD，彼此有接近 85% 的相似程度(Miyata and Nishida, 1999)。常見 ERK 的活化路徑為：酪氨酸激酶受體(receptor-linked tyrosine kinases)與細胞膜上的特異受體結合，形成二聚體後啟動 Ras，再進一步啟動 Raf-1，Raf-1 將 MEK1/2 磷酸化，從而激活 Erk1/2，活化的 Erk1/2 進入到細胞核作用於目標基因，例如：c-fos、c-Jun、 Elk-1、c-myc. 政治大先前已有研究指出，在神經細胞 NGF 透過結合受體激活下游反應，活化立. 和 ATF2 等，調控目標基因的轉錄與表達，進而調控細胞的增生或分化。. Erk1/2 作用於目標基因的表現，以達到促進神經突生長(Perron and Bixby, 1999;. ‧ 國. 學. Kaplan and Miller, 2000; Zhai et al., 2005b; Lee et al., 2009b)。在未分化 PC12. ‧. 細胞，NGF 結合上 TrkA，活化 Ras 啟動 Raf 將 MEK1/2 磷酸化，進而活化 Erk1/2，. y. sit. io. er. 2002)。. Nat. 使 PC12 細胞開始進行分化，形成具有神經突與分支的細胞(Vaudry et al,. 在癌症研究亦有文獻指出，和厚朴酚會透過 Erk1/2 路徑產生抗腫瘤機制. al. n. v i n (Hua et al, 2013 )。和厚朴酚對於抗發炎反應，也可以透過 Erk1/2 路徑調節(Chao Ch engchi U et al, 2010)。亦在神經保護的反應中，和厚朴酚同樣會透過 Erk1/2 路徑調節神經細胞的分化、生存與神經突的生長(Kaplan et al, 2000)。. 從上述可以知道，不論是 NGF 還是和厚朴酚，皆會透過 Erk1/2 的路徑來調控細胞的存活與神經突生長。因此，本論文進一步探討新合成雙酚化合物是否透過 Erk1/2 路徑滋養 PC12 細胞。. 9.

(22) 第七節、訊息傳遞轉錄活化基因-3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3) STAT3 屬於 STAT 家族的一員，由 STAT3 基因編碼出的轉錄因子(Akira, 1994)。已知 STAT3 可透過不同獨立的機制改變轉錄活性來調控細胞的功能，像是增生與存活。STAT3 同樣在神經發育中扮演重要的角色，並在神經系統受損反應中為主要的介質。STAT3 會經由不同的生長因子(growth factor)及細胞激素 (cytokine)活化，生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)與神經生長因子(NGF)等，細胞激素 IL-6)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory 政治大 factor, LIF) 與睫狀節神經營養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)(Hirano, 立則包括白細胞介素(Interleukin-6,. 區域(transactivation domain)的 S727。. 學. ‧ 國. 2000)。而 STAT3 被活化的位置會在羧基末端(C-terminal)的 Y705 與轉錄活化. ‧. 在 PC12 細胞的研究，NGF 透過結合 TrkA 激活 STAT3，表明 STAT3 的活. y. Nat. 化有助於 NGF 誘導基因的轉錄。當以 RNAi 抑制 STAT3 的表達，減弱了 NGF. er. io. sit. 對 PC12 細胞神經突生長的作用。在海馬迴神經元減少 STAT3 的表達，神經突起生長的情形同樣明顯減弱。因此，STAT3 在 NGF 信號傳遞路徑中具有重要作. al. n. v i n 用(Ng et AL, 2006)。在 PC12 C 細胞，STAT3 的活化的位置為 S727 而非 Y705 (Ng hengchi U. et al, 2006; Zhou et al, 2011)。並有研究指出 NGF 誘導周邊神經細胞的神經突生長是需要活化的 STAT3 存在(Quarta et al, 2014)。而和厚朴酚的相關文獻指出，和厚朴酚會透過抑制 STAT3 的活化達到抗腫瘤與抗發炎的效果。先前研究和厚朴酚促進神經突生長的路徑多為透過 Erk1/2 路徑，但和厚朴酚是否會透過 STAT3 路徑調控細胞分化的情形，目前尚未有清楚的研究表示。因此，本論文除了探討新合成雙酚化合物對於神經突生長的情形是否透過 Erk1/2 的活化之外，也同時探討 STAT3 的活化是否也參與其中。. 10.

(23) 第八節、論文研究之目的與實驗設計已有研究指出和厚朴酚等雙酚類物質對於神經細胞有保護作用與滋養效果，因此本論文利用實驗室先前新合成的雙酚化合物，探討這些化合物是否有同樣甚至更好的效果。實驗選用 PC12 細胞作為實驗目標，並利用 H2O2 誘導 PC12 細胞死亡，觀察新合成雙酚類化合物對神經細胞的保護作用。接著，觀察雙酚化合物處理 PC12 細胞後 NGF 誘導神經突的生長情形。再來，觀察神經突的生長機制是透過活化 Erk1/2 路徑或者 STAT3 路徑所影響。綜合以上結果觀察新合成雙酚化合物對神經細胞的滋養效果與保護作用，並證實這類化合物是否有潛力作為. 政治大實驗使用 PC12 細胞作為實驗目標，並針對上述實驗目的擬定以下實驗設立. 誘發神經再生的藥物，進而達到治療神經退化等疾病的效果。. ‧ 國. 1.. 學. 計：. 預先處理不同濃度的新合成雙酚化合物，接者以 H2O2 使細胞直接產生氧化. ‧. 壓力，以單獨處理 H2O2 組別作為對照組。透過 ROS 檢測試驗法檢測新合. y. sit. al. er. 利用 H2O2 誘導 PC12 細胞死亡，預先處理不同濃度的新合成雙酚化合物，. io. 2.. Nat. 成雙酚化合物對於 PC12 細胞株產生氧化壓力的預防程度。. v. n. 以單獨處理 H2O2 組別作為對照組。透過細胞存活率分析觀察新合成雙酚化. Ch. engchi. 合物對神經細胞的保護作用。 3.. i n U. 利用神經生長因子誘導神經突生長，觀察雙酚化合物處理 PC12 細胞後神經突的生長情形。. 4.. 經西方點墨法觀察雙酚類化合物處理後神經突的生長機制是否是透過活化 Erk1/2 路徑所影響。. 5.. 經西方點墨法觀察雙酚類化合物處理後神經突的生長機制是否是透過活化 STAT3 路徑所影響。. 11.

(24) 第二章、實驗材料與方法第一節、化學藥品與儀器一、化學藥品藥品名稱. 廠牌. 0.4 % trypan blue. Sigma. 0.5 % trypsin-EDTA. Sigma. 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). Sigma. 政治大. 40 % Acrylamide/Bis solution (29:1). 立. Bio-red. 學. Boric acid. ‧ 國. Aluminum persulfate (APS). SERVA. Bovine serum albumin (BSA). Sigma. ‧. Bromophenol blue. Sigma Millipore Sigma. al. er. io. sit. y. Nat. Chemiluminescent HRP Substrate Collagen. Sigma. n. Dimethyl sulfoxide (DMSO) Dithiothreitol (DTT). Ch. engchi U. v ni. J.T.Baker Fermentas. DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium). Sigma. Fetal bovine serum (FBS). Gibco. Glycerol. Sigma. Glycine. J.T.Baker. H2O2. Sigma. Horse serum heat inactivated (HS). Gibco. KCl. Sigma. KH2PO4. J.T.Baker. 12.

(25) Methanol. Merck. N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED). Sigma. Na2HPO4. Riedel-de Haën. NaCl. J.T.Baker. Nerve growth factor (NGF). Sigma. Nonident P-40. Sigma. PageRuler Prestained Protein Ladder. Thermo. Penicillin-Streptomycin. Gibco. 政治大 Polyvinylidene difluoride (PVDF) Transfer membrane 立 Poly-L-lysine hydrobromide (30000-70000 DA). Millipore. ‧ 國. 學. Protease inhibitor (PI). Sigma. Phosphatase inhibitor cocktail set IV. Bio-Rad 島久藥品 Riedel-de Haën. n. al. er. io. sit. y. Nat. Sodium bicarbonate. Stripping buffer. Merck. ‧. Protein Assay Dye. Sodium tetraborate. Calbiochem. Ch. engchi U. Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT). v ni. Bio-East Sigma. Tris. J.T.Baker. TWEEN® 20. Calbiochem. 脫脂奶粉. 安佳. 13.

(26) 抗體名稱. 廠牌. 型號. p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody. Cell signaling technology. 4695S. Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2). Cell signaling technology. 4377S. STAT3 antibody. Cell signaling technology. 12640S. Phospho-STAT3 (Y705) antibody. Cell signaling technology. 9145S. Phospho-STAT3 (S727) antibody. Cell signaling technology. 9134S. Actin antibody. Millipore. MAB1501. (T202/Y204) antibody. Goat anti-Rabbit IgG antibody. 立. Goat anti-Mouse IgG Antibody. Millipore 政治大 Millipore. AP132P AP124P. ‧ 國. 學. 二、藥品製備. ‧. 1. DMEM (pH 7.4)：DMEM 細胞培養基粉末以二次過濾水 (ddH2O) 溶解，每. sit. y. Nat. 1 公升加入 3.7g NaHCO3，利用 6 N HCl 調整 pH 值至 7.4，再以孔徑. 2.7 mM KCl. al. n. 2. PBS (pH 7.4)：. er. io. 0.22 μm filter 過濾。. Ch. i n U. v. e n g c 137 h i mM NaCl. 1.8 mM KH2PO4. 10 mM Na2HPO4. 再以孔徑 0.22 μm filter 過濾。 3. 0.05 % trypsin-EDTA： 100 ml 0.5 % trypsin-EDTA. 900 ml PBS. 4. Borate buffer (pH 8.5)： 100 mM boric acid. 75 mM NaCl. 再以孔徑 0.22 μm filter 過濾。. 14. 25 mM sodium tetraborate.

(27) 5. RIPA lysis buffer (pH 8.0)： 50 mM Tris-HCl. 150 mM NaCl. 2 mM EDTA. 1 % NP40. 每 1 ml 加 10μl protease inhibitor (1:100) 及 5μl phosphatase inhibitor (1:200) 6. SDS-PAGE： 10% Running gel. Stacking gel. ddH2O. 4.8 ml. 2.1 ml. Running/stacking buffer. 2.5 ml. 833 μl. 40 % Acrylamide/Bis (29:1). 立. 10 % SDS. 33.3 μl 33.3 μl. 7.5 μl. 4.6 μl. ‧. Total. ‧ 國. TEMED. 100 μl. 333 μl. 學. 10 % APS. 2.5 ml 政治大 100 μl. 10 ml. Nat. sit. y. 3.3 ml. io. al. 500 mM. Tris-HCl. DTT. v ni. 10 %. n. 250 mM. er. 7. 5X loading dye (pH 6.8)： 50 %. C hSDS i U e n g c hglycerol. 0.5 % bromophenol. 8. 電泳緩衝液 (Tank buffer)： 25 mM Tris-base. 192 mM glycine. 0.1 % SDS. 9. 轉漬緩衝液 (Transfer buffer)： 25 mM Tris-base. 192 mM glycine. 15 % methanol. 10. 0.05 % TBST： 25 mM Tris-base. 150 mM NaCl. 2.7mM KCl. 0.05 % Tween-20. 150 mM NaCl. 2.7mM KCl. 0.1 % Tween-20. 11. 0.1 % TBST： 25 mM Tris-base. 15.

(28) 三、儀器設備儀器名稱. 廠牌. 18.2 MΩ·cm ultra-pure water. Rephile. 分光光度計(Spectrophotometer). BOECO S-30. 水浴槽 (Water bath). COCONO laboratory equipment BH-200I. 加熱攪拌器. CORNING. 平面震盪器 (Orbital shaker). Digisystem laboratory instruments. 多孔式乾浴器 (Dry bath). 立. 多功能微量盤分析儀. 治 CB1503 政 CLUBIO 大 Perkin Elmer VICTOR X4. ‧ 國. 學. (Microplate reader). MERCIER corporation. 倒立光學顯微鏡. Motic. ‧. 封膜機 (Impulse sealer). Nat. 迷你離心機. Cubee. 超音波震盪器 (Sonicator). Ch. sit er. al. n. 培養箱 (Incubator). y. Doctor’s friend DF-506. io. 桌上型吸引器 (Portable suction). i n U. v. ESCO CCL-170B-9. i e n gHEAT c h SYSTEMS. 試管震盪器 (Vortex mixer). FINEPCR. 電泳槽. Amersham Biosciences. 電泳膠影像系統. AVEGENE. 電源供應器. Major Science. 酸鹼度計 (pH meter). Denver Instrument. 螢光顯微鏡. Leica. 濕式轉漬槽 (Trans-blot cell). Bio-Rad. 擺盪式震盪器 (3D shaker). KANSIN instruments RS01. 16.

(29) 離心機. BECKMAN COULTER Allergra X-15R/KUBOTA 1300. 鑄膠器具. Amersham Biosciences. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 17. i n U. v.

(30) 第二節、細胞培養一、細胞株培養本實驗使用的 PC12 細胞株為大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤 (rat pheochromocytoma) 選殖而成 (Greene and Tischler, 1976)。此細胞株來源由國立清華大學陳令儀老師實驗室提供。 PC12 細胞屬於懸浮型的細胞，因此培養皿需要以 poly-L-lysine 或 collagen 處理過，使 PC12 貼附於底部。 poly-L-lysine 處理的部分，以滅菌 ddH2O 將 poly-L-lysine 配成 10 mg/ml 的原液保存，再以 50 ml 的 100 mM borate. 政治大. buffer 稀釋成 0.1 mg/ml poly-L-lysine 溶液，使用 0.22 μm 過濾膜過濾。將 0.1. 立. mg/ml poly-L-lysine 溶液加到培養皿，覆蓋整個底部後，放置到培養箱 30 分. ‧ 國. 學. 鐘，將 poly-L-lysine 溶液回收，以滅菌 ddH2O 清洗一到兩次，吸乾後即可使用。 Collagen 處理的部分，先配置 0.02N acetic acid，以 1:20 的比例稀釋. ‧. collagen，使用 0.22 μm 過濾膜過濾。將 collagen 均勻佈於底部薄薄一層，於. y. Nat. sit. 無菌操作台(laminar flow)風乾後即可使用。. n. al. er. io. PC12 細胞培養於含有 10 % 馬血清 (horse serum)、5 % 胎牛血清 (fetal. i n U. v. bovine serum)、1 % 抗生素 (penicillin-streptomycin) 的 DMEM (Dulbecco’s. Ch. engchi. modified Eagle medium) 培養液中，培養環境為溫度 37 ℃、5 % CO2 的恆溫培養箱 (incubator)。每 2 天更換一次培養液，培養液預先在水浴槽 (water bath) 回溫至 37 ℃，利用桌上型吸引器 (portable suction) 將培養皿中的培養液吸乾，以 PBS 清洗一次後，再將新的培養液緩慢注入培養皿中。操作細胞實驗前，若穿著長袖衣服需捲至手肘以上，雙手需先使用洗手乳清洗乾淨，擦乾後穿戴乳膠手套，以 70 % 酒精均勻噴灑，細胞實驗皆在無菌操作台進行，無菌操作台使用前開啟紫外線燈 20 分鐘，再以 70 % 酒精擦拭平台，所有物品進入無菌操作台之前必須以 70 % 酒精均勻噴灑過，容器如血清瓶、離心管等，瓶口開啟前須過火。. 18.

(31) 二、繼代培養與計數每 4 天進行一次細胞繼代分盤培養，先將含血清的培養液、1X PBS 及 0.05 % trypsin-EDTA 放至水浴槽內回溫至 37 ℃，把培養液吸乾後，加入 PBS 清洗剩餘的培養液，避免干擾 trypsin 的作用，吸去 PBS 後加入 0.05 % trypsin-EDTA，用量覆蓋底部即可。將培養皿放置到培養箱 5 分鐘，以分解細胞與培養皿間的附著蛋白，加入培養液停止 trypsin 的作用後，將細胞均勻沖散。以 500 × g 轉速離心 5 分鐘後，吸除上清液，加入 PBS 均勻混合，清洗殘餘 trypsin，再次 500 × g 轉速離心 5 分鐘。. 政治大以培養液稀釋成適當倍數，與立 0.4 % trypan blue 以 1:1 的比例混合均勻。吸除上清液後，再加入 1 ml 的培養液混合均勻，從中取出 10 μl 的細胞液. ‧ 國. 學. trypan blue 可以進入到細胞膜不完整的死細胞內，因此死細胞會呈藍色，活細胞則不會呈色。從中取出 10 μl 加到細胞計數盤，計算 4 個區域的活細胞數量. ‧. 做平均，將數量乘以稀釋倍數，再除以體積 10-4 ml，數值即為 1 ml 的細胞液. sit. y. Nat. 中的細胞數量。. n. al. er. io. 三、細胞冷凍保存. i n U. v. PC12 細胞需先以 0.05 % trypsin-EDTA 將細胞從底部飄起呈懸浮狀態，. Ch. engchi. 步驟如前面繼代培養與計數所述，離心後加入事先配置含有 10 % dimethyl sulfoxide (DMSO)的培養液後，均勻混合，取 1 ml 至細胞冷凍管。接著，將細胞冷凍管放置到細胞漸凍盒內，置於 -80 ℃ 冰箱 3 至 5 小時後，移入液態氮桶中保存。. 四、細胞解凍解凍細胞必須快速進行，以避免在過程中造成細胞死亡。先將培養液回溫至 37 ℃，將細胞冷凍管從液態氮桶中取出，立即將細胞管放入 37 ℃ 的水浴槽中回溫，輕輕搖晃細胞管以加速細胞解凍，回溶完成後將細胞加至 10 ml 培養. 19.

(32) 液，混合均勻後，注入已處理 poly-L-lysine 的培養皿中，放置於溫度 37 ℃、 5 % CO2 的培養箱，隔天更換培養液。. 第三節、藥物處理本論文使用的雙酚類化合物為新化學合成的結構物(Tripathi et al., 2012)，將化合物的乾燥粉末以 DMSO 稀釋成 10-3 M, 10-4 M，再將 10-4 M 以 ddH2O2 稀釋成 10-5 M。細胞實驗處理藥物時，以培養液稀釋成不同最終濃度 (0.1, 0.3, 1, 3, 10, 及 30μM)進行實驗。 H2O2 以 1X PBS 稀釋成 10-4M，再以培養液稀釋成. 政治大溶成 1 mg/ml 冰於 -20℃保存，使用前先將 NGF 稀釋成 10μg/ml 後，再以促使立不同最終濃度 (100, 200, 400, 800, 及 1000μM)。神經生長因子 NGF 以 DMSO. ‧. ‧ 國. 50ng/ml。. 學. 細胞分化使用的培養液(含有 1%FBS、1%抗生素)稀釋成最終濃度 25ng/ml 與. PC12 細胞保護實驗，藥物處理流程如 (圖 2) 細胞存活試驗 ─ MTT. sit. y. Nat. 試驗法 (MTT assay) 與 (圖 3)活性氧檢測試驗 (reactive oxygen species. al. er. io. detection assay) 所表示，圖 2 為事先處理不同濃度 ( 0.3, 1, 3, 10, 及 30μM ). v. n. 的雙酚類化合物 30 分鐘，再給予 400μM H2O2， 24 小時後，進行 MTT 試驗. Ch. engchi. i n U. 法，觀察雙酚類化合物保護細胞在氧化壓力造成傷害的存活情形。圖 3 為事先處理不同濃度 ( 1, 3, 及 10μM ) 的雙酚類化合物 30 分鐘，再給予 400μM H2O2， 1 小時後，處理 10μM DCFH-DA 30 分鐘，在螢光顯微鏡下觀察細胞產生氧化壓力的情形。 (圖 2). 20.

(33) (圖 3). 於神經突生長 (Neurite outgrowth) 實驗，藥物處理流程如(圖 4)，首先不給予任何血清，讓細胞處於飢餓的環境(starvation)下，4 小時後，以分化用的培養液(含有 1%FBS 與 1%抗生素)，同時給予不同濃度的雙酚類化合物( 0.1, 0.3, 及. 政治大生長，每兩天更換一次含有雙酚類化合物與 NGF 的培養液。立. 1μM)與 25ng/ml 或 50ng/ml 的神經生長因子(NGF)，促使 PC12 細胞神經突的. ‧. ‧ 國. 學. (圖 4). er. io. sit. y. Nat. n. a l (reactive oxygen species 第四節、活性氧檢測試驗 i v detection assay). n U engchi DCFH-DA 全名為 2’,7’ –dichlorodihydrofluorescin diacetate，一種常用. Ch. 來測量細胞內活性氧(ROS)含量的螢光試劑。 DCFH-DA 本身沒有螢光，可以自由穿過细胞膜。進入細胞後， DCFH-DA 會被細胞內的酯解酶 (esterase) 去乙醯化，形成同樣不具螢光的 DCFH。DCFH (dichlorodihydrofluorescin) 無法通透細胞膜，因此會堆積聚集在细胞內。而细胞內的 ROS 會將 DCFH 氧化，生成具螢光的 DCF (dichlorofluorescin)。 DCF 的螢光光譜的最大激發光為波長 485 nm，最大發射光為波長 530 nm，使用螢光顯微鏡偵測螢光強度，觀察藥物處理後细胞內 ROS 的變化。配置與使用 DCFH-DA 的過程中必須避光，DCFH-DA 先以 DMSO 溶成. 21.

(34) 20 mM 的原液，再以培養液稀釋成最終濃度 10 μM 的溶液。PC12 細胞以 4 × 105 的密度種在 24 孔盤中，單獨處理 H2O2 1 小時，做為 positive control 組，藥物處理後將培養液吸乾，每一格加入 250 μl 的濃度 10 μM DCFH-DA 溶液，放入培養箱 30 分鐘，環境為溫度 37 ℃、5 % CO2。反應完成後將液體吸乾，以 1X PBS 清洗兩次。使用螢光顯微鏡觀察並拍照，所得到的影像以 ImageJ 軟體進行量化分析。在顯微鏡物鏡 10X 視野下，每個組別隨機選擇 10 顆細胞定量螢光強度，扣除背景值，再將數值平均，並以 mean ± SEM 值做為誤差值。. 政治大 MTT 立試驗法來偵測細胞的存活情形。 MTT. 第五節、細胞存活率試驗法 ─ MTT 試驗法 (MTT assay) 本實驗利用. 全名為：. ‧ 國. 學. 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，呈黃色的水溶性化合物，可以通過細胞膜進入細胞內。在活細胞中的粒線體中，含有琥珀酸脫氫酶. ‧. (succinate dehydrogenase, SDH) 和細胞色素 C (cytochrome c) 能使 MTT. sit. y. Nat. 還原，將 tetrazolium 環打開，並形成藍紫色的結晶 formazan，而在死細胞中琥. al. er. io. 珀酸脫氫酶消失，無法將 MTT 還原。因此，結晶 formazan 的生成量與活細胞. v. n. 數目呈正比，在波長 570 nm 有最大吸收值，其測得之 O.D. 值則代表活細胞數目。. Ch. engchi. i n U. 配製及使用 MTT 的過程中必須避光，先將 MTT 以 1X PBS 配置成 5 mg/ml 的原液，再以回溫至 37 ℃且不含血清及抗生素的培養液稀釋成最終濃度 0.5 mg/ml。 PC12 細胞以 5 × 105 的密度種在 24 孔盤中，待細胞貼附於底部後處理藥物，於藥物處理後將培養液吸乾，每個孔加入 300 μl 配置完成的 MTT 溶液，將細胞放回培養箱中培養 3 至 4 小時。接著，因為 formazan 結晶不溶於水，將 MTT 溶液吸乾後，加入 500 μl 的 DMSO 溶解，放置在平面震盪器 (orbital shaker) 上，以 100 rpm 的轉速於室溫中搖晃 5 分鐘，利用微量盤分析儀 (microplate reader) 讀取波長 595 nm 的吸光值，將其測得的吸光值. 22.

(35) 扣除背景值後除以控制組，以 mean ± SEM 值做為誤差值。. 第六節、神經突生長 (Neurite outgrowth assay) PC12 細胞以 5 × 104 的密度種在 24 孔盤中，每格 1 ml 的培養液，置放於培養箱，環境為溫度 37 ℃、5 % CO2。隔天將培養液更換成不含血清的培養液，使細胞處於飢餓狀態 4 小時，接著更換成含有 NGF 及雙分類化合物的分化用培養液(含有 1%FBS 及 1%抗生素)，每兩天更換一次含有 NGF 及雙分類化合物的分化用培養液，並拍照紀錄。所得到的影像以 ImageJ 軟體進行量化分析。. 政治大並以 mean ± SEM 值做為誤差值。立. 計算隨機不同的 4 個顯微鏡物鏡 10X 視野，每個視野下最長 10 個神經突總長度，. ‧ 國. 學. 第七節、西方點墨法 (Western blot). ‧. 一、蛋白質萃取. y. Nat. sit. PC12 細胞以 2 × 106 的密度種在 6 孔盤中，每格 2 ml 的培養液，置放. n. al. er. io. 於培養箱，環境溫度 37 ℃、5 % CO2。隔天加入不同時間的藥物處理，分別為. i n U. v. 2 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、15 分鐘、1 小時、6 小時以及 24 小時。藥物處理後. Ch. engchi. 將培養液吸乾，以 1X PBS 清洗，洗去殘留的培養液。加入 150 μl 含有蛋白酶抑制劑 (protease inhibitor) 與磷酸酶抑制劑 (phosphatase inhibitor) 的裂解緩衝液 (lysis buffer)，放在速度為 100 rpm 的平面震盪器 5 分鐘。將細胞混合液收集至微量離心管，於溫度 4℃ ，速度 14000 rpm ，離心 10 分鐘，除去細胞殘骸。只取上清液，避免吸到沉澱物，保存於 -80 ℃ 冰箱。. 二、蛋白質濃度測定本實驗使用 Bradford 測定法測定蛋白質濃度，Protein Assay Dye 含有 Coomassive Brilliant Blue G-250 染劑與蛋白質結合後，顏色由紅棕色轉變為藍色， O.D. 值在波長 595 nm 有最大吸收值，藉此測量樣本蛋白質濃度。首先， 23.

(36) μg/μl 的胎牛血清蛋白 (bovine serum albumin,. 配製濃度 0, 2, 4, 6, 8, 10. BSA)，做為蛋白質濃度標準曲線。取 798 μl 滅菌 ddH2O 、 200 μl protein assay dye、蛋白質樣本 2 μl 在微量離心管混合均勻，利用分光光度計測量吸光值，推算出樣本中蛋白質濃度。. 三、蛋白質樣品配製測定蛋白質濃度後，以 5X loading dye、滅菌 ddH2O 將樣本稀釋成濃度為 1 μg/μl 的蛋白質溶液，混合均勻後放製於溫度 90 ℃多孔式乾浴器 (dry bath)，加熱 10 分鐘，使蛋白質變性 (denaturation)，完成後放於冰上 5 分鐘。. 政治大. 四、鑄膠. 立. 以 ddH2O 清洗鑄膠器具，並以酒精擦拭後架設完整，加入 ddH2O 來檢查. ‧ 國. 學. 是否架設正確，若無漏水現象，將 ddH2O 倒掉後以濾紙吸乾鑄膠器具。根據所要測定的蛋白質分子量大小，配製 8% 、 10 % 或 12% 的分離膠 (running. ‧. gel)，加入 10 ml 至鑄膠器具，過程中避免氣泡產生，再緩慢加入 1 ml 的滅菌. y. Nat. sit. ddH2O 使膠體平整。待膠體凝結後，將 ddH2O 移除以濾紙吸乾。加入聚集膠. n. al. er. io. (stacking gel) 再插入 10 格或 15 格的齒梳 (comb)，小心地將氣泡移除，聚集膠凝結後，即可進行電泳。. Ch. engchi. i n U. v. 五、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 將完成膠體裝置在電泳槽，小心地移除齒梳，倒入預冷的電泳緩衝液 (tank buffer) ，電泳緩衝液需要蓋過膠體及電泳槽。將配置完成的 20 μl 蛋白質樣本注入至膠體的膠孔中，PageRuler Prestained Protein Ladder 與 5X loading dye、滅菌 ddH2O 混合後加至樣本旁的膠孔，以便觀察不同分子量大小的蛋白質分離情形。架設完成的電泳槽放在冰上，將電源供應器設定最大電壓 300 伏特及每片膠體固定電流 30 mA，進行不同分子量的蛋白質分離。等待樣本跑至底部後，再將膠體取下。 24.

(37) 六、轉漬 (transfer) 將取下的膠體浸泡在轉漬緩衝液 (transfer buffer) 中，置於平面震盪器以 70 rpm 的轉速清洗 10 分鐘，將 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) 膜剪適當大小後，浸泡在 100 % 甲醇 (methanol) 中，輕輕搖晃 30 秒，接著移至 ddH2O 中清洗約 10 秒，最後放入轉漬緩衝液中。放置順序由負電到正電依序為海綿、濾紙兩張、PVDF membrane、膠體、濾紙兩張、海綿，過程中避免氣泡產生，完成後放入濕式轉漬槽 (trans-blot cell)，放入保冰槽，倒入預冷的轉漬緩衝液，將濕式轉漬槽放置於冰上，避免轉漬過程過熱。設定固定電壓. 政治大. 100 伏特，最大電流 700 mA，依偵測目標蛋白質分子量的大小，時間設定於 1. 立. 至 2 小時。. ‧ 國. 學. 七、免疫轉漬 (immunoblot). 轉漬完成後，將 PVDF 膜浸泡於含有 5 % BSA 或 5 % 脫脂奶粉的 0.05. ‧. % TBST 溶液中，放置在轉速為 40 rpm 的平面震盪器上，於室溫中搖晃 1 小. y. Nat. sit. 時，或者放於 4 ℃ 冰箱 16 小時，以避免抗體與蛋白質之間非特異性的結合。. n. al. er. io. 完成後將 PVDF 膜取出並放置於保鮮膜上，沿兩側蛋白質分子量標誌裁剪下欲進行免疫轉漬之蛋白質所在區域。. Ch. engchi. i n U. v. 以 0.05 % TBST 稀釋一級抗體，一級抗體包含 mouse anti-actin antibody (1:100000)、rabbit anti-Phospho-Erk1/2 antibody (1:1000)、rabbit anti-Erk1/2 (1:1000)。裁剪的 PVDF 膜用無氯塑膠膜封起，加入一級抗體，放置在轉速為 20 rpm 的擺盪式震盪器 (3D shaker)，於 4 ℃ 冰箱反應 16 小時或室溫下反應 2 小時。完成反應後以 0.1 % TBST 清洗，放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分鐘、 10 分鐘、 10 分鐘。接著，加入以 0.05 % TBST 稀釋的二級抗體約 10 ml，放置在平面震盪器上，以 40 rpm 的轉速，在室溫下搖晃 1 小時。二級抗體包含 goat anti-mouse IgG horseradish peroxidase conjugated antibody (1:10000)、goat anti-rabbit IgG horseradish. 25.

(38) peroxidase conjugated antibody (1:10000)。完成反應後以 0.1 % TBST 清洗，放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分鐘、 10 分鐘、 10 分鐘。以 immobilon Western chemiluminescent HRP substrate 完全覆蓋於 PVDF 膜上，使用電泳膠影像系統擷取影像。所得到之影像以 ImageJ 軟體進行量化分析。若是同一張 PVDF 膜需要進行其他抗體免疫轉漬，將 PVDF 膜浸泡在約 15 ml 的 stripping buffer 中，放置於轉速為 70 rpm 的平面震盪器上，室溫下反應 15 分鐘。完成反應後，先以 ddH2O 沖洗掉 stripping buffer，再以 0.1 %. 政治大. TBST 清洗，放置在平面震盪器上，轉速為 70 rpm 清洗三次，時間依序為 5 分鐘、 10 分鐘、 10 分鐘。. 學. ‧ 國. 立. 第八節、實驗數據分析. ‧. 實驗結果的數據取得資料之平均值以平均值 ± 標準誤差 (means ± S.E.M). sit. y. Nat. 表示。統計上的差異以單向變異分析 (one way analysis of variance) 來建立，. al. n. 差異。. er. io. 並以 Student-Newman-Keuls test 進行後測，將 p < 0.05 視為有統計上的顯著. Ch. engchi. 26. i n U. v.

(39) 第三章、實驗結果第一節、過氧化氫引起嗜鉻性細胞瘤細胞 PC12 之氧化壓力本實驗以過氧化氫處理 PC12 細胞，使細胞直接產生氧化壓力。細胞密度 4 × 105 種於 24 孔盤，以濃度 100、200、400、800 及 1000 μM 的 H2O2 處理 1 小時，使用 ROS 檢測試驗法檢測 H2O2 對於 PC12 細胞株產生氧化壓力的程度。由圖 5 觀察到，H2O2 對於 PC12 細胞株所產生的 ROS 隨著 H2O2 濃度增加而加劇，在統計上達到顯著差異 (F5,12 = 62.35, p < 0.001)，H2O2 在濃度 100μM. 政治大. 及 200μM 與對照組相比，ROS 的產生增加至對照組的 4 倍；H2O2 在濃度 400μM. 立. 與對照組相比，顯著增加 ROS 的產生至對照組的 6 倍(p < 0.001)；濃度 800 μM. ‧ 國. 學. 的 H2O2，ROS 增加至對照組的 12.97 倍；1000 μM 的 H2O2 更加強烈，ROS 增加至對照組接近 15 倍 (p < 0.001)。. ‧. 後續的實驗選擇 H2O2 具有較顯著差異(p < 0.001)的濃度 400μM，作為實驗. n. al. er. io. sit. y. Nat. 濃度。. Ch. engchi. 27. i n U. v.

(40) 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. (G). Ch. engchi. 28. i n U. v.

(41) 圖 5、H2O2 對於 PC12 細胞 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105 種於 24 孔盤，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 100 μM H2O2、 (C, c) 200 μM H2O2、(D, d) 400 μM H2O2、(E, e) 800 μM H2O2、(F, f) 1000 μM H2O2、(G) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E, F)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e, f) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實驗結. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001 立果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. 與對照組比較。圖中比例尺為 100μm。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 29. i n U. v.

(42) 第二節、雙酚類合成物對於 H2O2 處理後 ROS 含量之影響細胞密度 4 × 105 的細胞分別給予濃度 1、3 及 10μM 的雙酚類合成物(MH101、MH102、MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111) 預先處理 30 分鐘後，再加入濃度 400 μM 的 H2O2 處理 1 小時，以 DCFH-DA 螢光試劑染 PC12 細胞，檢測細胞內 ROS 生成量。圖 6 結果顯示隨著 MH101 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS (F4,10 = 32.946, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照組相比，ROS 為對照組的 6.02 倍，ROS 顯著地大量產生 (p < 0.001)。預先. 政治大顯著地降低 ROS 產生 (p 立< 0.001)，而濃度 10 μM 的 MH101 降至對照組的. 處理 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH101 將 ROS 的生成量降至對照組的 3.32 倍，. ‧ 國. 學. 2.56 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而預先處理 30 分鐘濃度 1 μM 的 MH101 並沒有降低 ROS 生成的效果。. ‧. 圖 7 結果顯示隨著 MH102 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS. al. (p < 0.001)。預先處理 30. er. io. 組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍. sit. y. Nat. (F4,10 = 47.246, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照. v. n. 分鐘濃度 1 μM 的 MH102 將 ROS 的生成量降至對照組的 4.27 倍，顯著地降. Ch. engchi. i n U. 低 ROS 產生 (p = 0.02)，預先處理 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH102 將 ROS 的生成量降至對照組的 2.31 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而濃度 10 μM 的 MH102 降至對照組的 1.42 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)。圖 8 顯示隨著 MH103 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS (F4,10 = 25.227, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍. (p < 0.001)。預先處理 30. 分鐘濃度 1 μM 的 MH103 將 ROS 的生成量降至對照組的 4.47 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p = 0.029)，預先處理 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH103 將 ROS. 30.

(43) 的生成量降至對照組的 3.41 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p = 0.004)，而濃度 10 μM 的 MH103 降至對照組的 1.13 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)。圖 9 結果結果顯示隨著 MH104 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS (F4,10 = 43.035, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍. (p < 0.001)。預先處理. 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH104 將 ROS 的生成量降至對照組的 3.18 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而濃度 10 μM 的 MH104 降至趨近於對照組，. 政治大 MH104 並沒有降低 ROS 生成的效果。立. 同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而預先處理 30 分鐘濃度 1 μM 的. ‧ 國. 學. 圖 10 結果顯示隨著 MH106 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的. ROS (F4,10 = 12.525, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與. ‧. 對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍 (p < 0.001)。濃度 10 μM. y. Nat. 的 MH106 降至對照組的 3.79 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.05)，而預先. n. al. 圖 11 結果顯示隨著. er. io. 效果。. sit. 處理 30 分鐘濃度 1 μM 與 3 μM 的 MH106 並沒有達到顯著降低 ROS 生成的. v i n MH107 C h 的濃度增加有顯著地減少 engchi U. H2O2 所產生的. ROS (F4,10 = 18.767, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍. (p < 0.001)。預先處理. 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH107 將 ROS 的生成量降至對照組的 3.92 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p = 0.03)，而濃度 10 μM 的 MH107 降至對照組的 2.49 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p = 0.002)，而預先處理 30 分鐘濃度 1 μM 的 MH107 並沒有降低 ROS 生成的效果。. 31.

(44) 圖 12 結果顯示隨著 MH111 的濃度增加有顯著地減少 H2O2 所產生的 ROS (F4,10 = 22.834, p < 0.001)，處理 1 小時濃度 400 μM 的 H2O2 的組別與對照組相比，ROS 顯著地大量產生至對照組的 6.02 倍 (p < 0.001)。預先處理 30 分鐘濃度 3 μM 的 MH111 將 ROS 的生成量降至對照組的 2.58 倍，顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而濃度 10 μM 的 MH111 降至對照組的 1.72 倍，同樣顯著地降低 ROS 產生 (p < 0.001)，而預先處理 30 分鐘濃度 1 μM 的 MH111 並沒有降低 ROS 生成的效果。表 3 為雙酚化合物對於 NGF 處理 PC12 細胞後神經突生長情形之比較。比較結果顯示 MH102 與 MH103 在濃度 1 μM 即可降低因 H2O2 所產生的 ROS。. 政治大其餘雙酚化合物則濃度需要達到 3μM 以上才能達到顯著降低 ROS。立 ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 32. i n U. v.

(45) 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. (F). Ch. engchi. 33. i n U. v.

(46) 圖 6、MH101 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH101 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH101 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH101 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。*** p < 0.001，*是對照組組比較，#是立驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. 與單獨處理 H2O2 組別比較。圖中比例尺為 100μm。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 34. i n U. v.


(48) 圖 7、MH102 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH102 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH102 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH102 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001，立驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. *是對照組組比較，#是與單獨處理 H2O2 組別比較。圖中比例尺為 100μm。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 36. i n U. v.


(50) 圖 8、MH103 於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH103 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH103 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH103 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001，立驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. *是對照組組比較，#是與單獨處理 H2O2 組別比較。圖中比例尺為 100μm。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 38. i n U. v.





(55) 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. al. er. io. sit. y. Nat (F). Ch. engchi. 43. i n U. v.

(56) 圖 11、MH107 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH1071μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH107 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH107 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001，立組。實驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. *是對照組組比較，#是與單獨處理 H2O2 組別比較。圖中比例尺為 100μm。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 44. i n U. v.

(57) 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. al. er. io. sit. y. Nat (F). Ch. engchi. 45. i n U. v.

(58) 圖 12、MH111 對於 H2O2 處理後 ROS 生成之影響。 PC12 細胞密度 4 × 105，分別以不同濃度的 H2O2 處理 1 小時後，使用 ROS 檢測法測量細胞 ROS 的生成量。(A, a) 對照組、(B, b) 400 μM H2O2、(C, c) MH111 1μM + 400 μM H2O2、(D, d) MH111 3μM + 400 μM H2O2、(E, e) MH111 10μM + 400 μM H2O2、(F) ROS 檢測法定量柱狀圖。圖(A, B, C, D, E)為明視野下所擷取之影像，圖(a, b, c, d, e) 皆為使用螢光顯微鏡以波長 485 nm 激發，發射光波長 530 nm，所得到的影像。實驗數值來自三次以上獨立實驗結果，各組別樣品數皆兩重複，數值均以 mean ± SEM 表示，各組別之數值均除以對照組。實. 政治大 Student-Newman-Keuls test 進行後測。*** p < 0.001，*是對照組組比較，#是立驗結果以單因子變異數分析 (one-way ANOVA) 方法進行統計分析，並以. 與單獨處理 H2O2 組別比較。圖中比例尺為 100μm。. Nat. n. al. er. io. sit. y. ‧. ‧ 國. 學. 表 1、雙酚化合物對於 H2O2 處理後 ROS 生成影響之比較. Ch. engchi. 46. i n U. v.

(59) 第三節、雙酚類合成物對於 H2O2 處理後細胞存活率之影響本實驗以過氧化氫處理 PC12 細胞，使細胞直接產生氧化壓力，進而促使細胞死亡。細胞密度 5 × 105 種於 24 孔盤，以濃度 100、200、400、800 及 1000 μM 的 H2O2 處理 24 小時，使用 MTT 試驗法檢測 H2O2 對於 PC12 細胞株存活率的影響。由圖 13 (A) 結果顯示，H2O2 對於 PC12 細胞株的存活率隨著 H2O2 濃度增加而減少，在統計上達到顯著差異 (F5,12 = 62.63, p < 0.001)，H2O2 在濃度 100μM 及 200μM 與對照組相比，細胞存活率的減少沒有達到顯著差異；H2O2. 政治大濃度 800 μM 的 H O ，細胞存活率的減少至對照組的 44% (p < 0.001)；1000 立. 在濃度 400μM 與對照組相比，細胞存活率的減少至對照組的 75% (p = 0.008)； 2. 2. ‧ 國. 學. μM 的 H2O2 降低細胞存活率更加強烈，減少至對照組的 12%(p < 0.001)。後續的實驗選擇 H2O2 具有顯著差異(p < 0.01)的濃度 400μM，作為實驗濃度。. ‧. 接著，為了探討雙分類合成物是否具有對於氧化壓力所造成神經傷害的保護. sit. y. Nat. 效果，細胞分別預先給予濃度 1、3、10 及 30μM 的雙酚類合成物(MH101、MH102、. al. er. io. MH103、MH104、MH106、MH107 與 MH111) 處理 30 分鐘後，再加入濃度. v. n. 400μM 的 H2O2 處理 24 小時，藉由測量 MTT 的吸光值，推測細胞的存活率。. Ch. engchi. i n U. 圖 13 (B)結果顯示隨著 MH101 的濃度增加有增加細胞存活率的趨勢，並達顯著差異(F5,12 = 5.065, p = 0.01)，處理 24 小時 H2O2 的組別與對照組相比，細胞存活率下降至 71% (p < 0.05)，當預先處理 30 分鐘 10μM MH101，細胞存活率上升至 86%。預先處理 30μM MH101，細胞存活率上升至 107%，具有顯著防範氧化壓力傷害保護效果(p < 0.05)。圖 13 (C) 結果顯示隨著 MH102 的濃度增加有增加細胞存活率的趨勢，並達顯著差異(F5,12 = 9.282, p < 0.001)，處理 24 小時 H2O2 的組別與對照組相比，細胞存活率下降至 70% (p < 0.01)，當預先處理 30 分鐘 10μM 的 MH102，細胞存活率上升至 92%，具有顯著防範氧化壓力傷害保護效果(p < 0.05)。預先處. 47.