單株抗體之製作

抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質，目前廣為應用的抗體分為兩種，多 株抗體(polyclonal antibody)和單株抗體(monoclonal antibody)。多株抗體是 將抗原打入老鼠體內，經過數次免疫，採集血液，收血清，此為多株抗 體。操作過程雖然簡單，但其專一性低，對於相似的抗原結構都會有所反 應，稱為交叉反應(cross reaction)。1973 年，Milstein 等人，提出骨髓瘤細

胞(myeloma cell)之融合實驗，製造出單株抗體。因為血清中的每一種抗 體，是由單一種 B 細胞所製造，所以將 B 細胞由脾臟中取出，與骨髓瘤細 胞融合，成為可持續分泌抗體，又可在培養基中永久生長的細胞株，即為 融合瘤細胞株(hybridoma cell)。

其過程為，給予小鼠外來抗原，並同時以免疫佐劑加強小鼠免疫反 應，使脾臟內的 B 細胞產生特定抗體，將其與癌化細胞株融合形成可體外 培養且生產特定抗體之細胞株(附錄二)。

附錄二、 單株抗體製作流程圖

第 0 天-將佐劑 ( complete adjuvant) 和抗原等體積混和注射入老鼠體內

第 10 天-第二次注射

第 20 天-第三次注射，解凍 FO 細胞，且大量繁殖

第 27 天-第四次注射

第 28 天- FO 細胞 1：2 繼代培養

第 30 天-採血測 titer，取小鼠脾臟與 FO 細胞做細胞融合

第 37 天-加 50 µL 之 HY-HAT 培養液

細胞數佔孔洞約 50 - 90 %，培養液轉黃取 50 µL，做 ELISA 篩選

陽性細胞群落單株化

以 ELISA 篩選陽性單株細胞群落

大量繁殖陽性單株細胞，收集培養液，做後續實驗用

2.2.1 材料

Name Component Trademark

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

Contains 4500 mg / L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg / L sodium pyruvate but no sodium bicarbonate.

GIBCO BRL^® 12800-017

Fetal Bovine Serum (FBS)

< 10 EU / mL endotoxin, < 10 mg / dL hemoglobin, 40 nm flitered.

HYCLONE^® Defined Grade

Penicillin /

Streptomycin (P/S)

Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 µg of

streptomycin (base) / mL utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85%

saline.

GIBCO BRL^® 15140-122

H-Y Medium (HY)

Contains L-glutamine, bovine insulin, oxaloacetate, and sodium pyruvate but no sodium

bicarbonate.

SIGMA H-9014 HYBRI-MAX ^®

HAT Media

Supplement (50 X) (HAT)

Reconstitute contents of vial with 10 mL sterile cell culture medium.

When reconstituted to 10 mL, each vial contains 5×10^-3 M hypoxanthine, 2×10^-5 M

aminopterin, 8×10^-4 M thymidine.

SIGMA H-0262 (v/v) in DPBS without calcium.

SIGMA P-7306 HYBRI-MAX ^®

碳酸氫鈉 (NaHCO3) (購自sigma) DEAE resin (購自 amersham)

PB buffer

1 M Na2HPO4 68.4 ml, 1 M NaH2PO4 31.6 ml補一次水至 5 L, 調pH至 7.2

2.2.2 免疫反應

以純化所得之病毒蛋白為抗原。利用 4-8 週的 BALB/c 小鼠為免疫動 物，以抗原(100 µg / mouse) 加等體積之佐劑 (Freund’s complete adjuvant) (Sigma) 混合成乳劑，於 0 天做小白鼠腹腔注射(IP)。之後再以抗原(100 µg / mouse) 加等體積之佐劑 (Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma) 混合成乳 劑，於 10、 20 及 27 天再進行小鼠腹腔注射 (IP)，誘發免疫反應，使 B 細 胞成熟增生並產生抗體。第 30 天時要採血測價數，確認小白鼠已被引發 免疫反應，確認後再進行細胞融合。

2.2.3 骨髓癌細胞 (myeloma cell)

所用之骨髓瘤細胞株極易增生，且與脾臟細胞融合後，可迅速發育且 分泌高濃度免疫球蛋白。目前最常使用為HGPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 缺乏性骨髓瘤細胞，如P3、P3 / 653、NS1、

SP2 、 及 FO 等 細 胞 ， 當 細 胞 培 養 於 HAT (hypoxanthine aminopterin thymidine) 培養液中，其中aminopterin可阻止骨髓瘤細胞核酸之正常代謝 途徑 (de novo synthesis) 之進行，使細胞僅能以 HGPRT或TK酵素，依救急 代謝途徑 (salvage pathway) 利用hypoxanthine及thymidine合成核酸，若骨髓 瘤細胞缺乏HGPRT，將無法合成核酸而死亡，而融合細胞因為自脾臟細胞 取得HGPRT之基因而得以存活增生 (參考圖 2-1)。實驗室採用FO細胞株，

採購於食品工業研究所，使用DMEM培養液，添加 0.018 M碳酸氫納、10

% FBS及 1 % penicillin / streptomycin，培養於 37 ℃，5 % CO2。

圖 2-1 細胞內核酸的合成路徑 核酸的正常代謝途徑若被 aminopterin 阻礙，可由 救急途徑 (salvage pathway) 取用 thymidine (T) 及 hypoxanthine (H) 來合成 DNA。

但 FO cell 缺乏 TK 及 HGPRT 兩種酵素，因此在 aminopterin (A) 存在下 FO cell 無法生長；正常細胞 (如 B 細胞) 則可經救急途徑繼續生長。HAT 培養基含 aminopterin, thymidine 及 hypoxanthine，FO cell 在 HAT 中無法生長，除非經由 細胞融合導入 TK 或 HGPRT 兩酵素的基因 (可由正常脾臟細胞得來)。

2.2.4 細胞融合 (Fusion)

小鼠以乙醚將其迷昏後，採眼窩血，無菌操作解剖取出脾臟，以 DMEM於培養皿中清洗兩次。將脾臟至於培養皿中以 5 mL針筒末端平坦 處將脾臟壓碎，用 21G針頭抽吸使細胞分散，經由無菌紗布過濾至 50 mL 離心管，離心 5 分鐘，轉速 260 g，去除上清，再加入 10 mL DMEM沖

洗，重複兩次。同時取FO細胞，以DMEM沖洗細胞兩次，離心 5 分鐘，轉 速 260 g，回溶於 10 mL DMEM中。取部分細胞做細胞計數，用trypan blue 液計算活細胞率，以脾細胞：FO細胞＝4：1 之比例將細胞混合，離心 5 分鐘，轉速 260 g，去上清液 。離心管輕擊桌面震散細胞，於 1 分鐘內緩 慢滴入 1 mL已加溫到 37 ℃之PEG / DMSO，同時輕輕搖晃細胞使其均勻 混合，於 37 ℃水浴 1 分鐘後取出，在 2 分鐘內緩慢滴入 10 mL已加溫到 37 ℃之DMEM，離心管輕擊桌面邊敲邊加，離心 5 分鐘，轉速 180 g，去 上清液，再以 20 mL DMEM沖洗細胞兩次。，以HY培養液 (已添加HAT、

0.018 M 碳酸氫納、20 % FBS及 1 % P / S) 懸浮細胞，並於 96 孔細胞培養 盤 (96 well culture plate)培養細胞，在 37 ℃，5 % CO₂之條件進行融合後細 胞培養。

2.2.5 細胞增殖與取樣篩檢

融合後培養之細胞定期觀察其生長狀況，融合後第 7 天，需再補充 HY-HAT 培養液。14 天後檢查培養液之顏色，若有融合成功有融合瘤細胞 (hybridoma cell) 產生，則培養液顏色變黃，取其培養液做 ELISA 篩檢。太 早做篩檢易漏失陽性細胞，因其分泌出的抗體濃度尚低，但若太遲篩檢，

融合細胞會因過度增生而死亡。因此最好在細胞未長滿前篩檢一次，其陰 性者在培養液變黃時再篩檢一次。培養液經 ELISA 篩檢出含有抗體時，每 一次 ELISA 需作一個負向對照組實驗，將該細胞繼續培養。

2.2.6 抗體之生產

單株抗體之生產是使用組織培養法，組織培養法是以 175 cm²塑膠培 養盤 (T75) 大量培養，直到細胞過飽和開始死亡時，離心除去細胞，收集 上清液，保存在 -20 ℃冰箱中備用。

2.2.7 腹水抗體製備 (Ascetic fluid)

6~11 週大的BALB/C小鼠為實驗動物，第 0 天小鼠腹腔注射給予 0.5 ml Pristane (Sigma)。第 7 天收集單株抗體細胞以PBS清洗兩次後，小鼠腹 腔注射單株抗體細胞，3x10⁶ cell/mouse。第 21 天觀察小鼠，腹部腫脹且行 動不便者，以 18 號針頭配 5ml針筒腹腔收集腹水，可收 2~3 次。將收集的 腹水離心去除組織碎片，最上層白色懸浮物為脂質先去除，收上清液。加 入 50﹪的硫酸銨 (ammonia sulfate)，分三次加入，每次間隔 30 分鐘，最後 在 4℃中攪拌反應 2 小時，離心 30 分鐘，4℃，轉速 1620 g，倒掉上清 液，沈澱物以適量PB buffer回溶，再用PB buffer透析 16 小時。離心 30 分 鐘，4℃，轉速 1620 g，上清液用 0.45µm filter過濾備用。

使用 DEAE 管柱 (管徑 2.5 公分)進行純化，裝填 20 ml DEAE 樹脂，

加入 80 ml PB buffer 平衡管柱。將硫酸銨沈澱所得之過濾液倒入，將流過 管柱之液收起，大部份抗體因為不與 DEAE 樹脂結合，而分佈在這個部 份。再分別用含有 40mM、60m NaCl 之 PB buffer，各 40 ml 沖洗管柱，每 1.5 ml 收集一管。最後再用含有 1M NaCl 之 PB buffer 50 ml 沖洗管柱。