表現菌株

可表現出帶有 His-tag 的融合蛋白 (fusion protein) 。

2.1.5 病毒基因體的抽取及確認

使用病毒檢測試劑組 (Pathotech, Magellan Biotechnology Co., Ltd.) 抽

取，由病蝦體上取下約 25-50 mg 組織，放到 1.5 ml 微量離心管，加入 500 µl Tissue Lysis buffer，用玻棒攪碎。使用桌上離心機離心 15 分鐘，轉速 10,000 rpm。取上清液 200 µl，加入 200 µl viral DNA binding buffer 及 50 µl Protease K (20 mg/ml)，放到一新的微量離心管中，並反覆倒置混合。72℃

靜置 10 分鐘。再加入 100 µl isopropanol，並再反覆倒置混合。將混合液置 入含有樹脂的 Filter tube 中，離心 1 分鐘，轉速 10,000 rpm。倒去過濾 液，再加入 500 µl Wash bufferⅠ，到 Filter tube 中，離心 1 分鐘，轉速 10,000 rpm。倒去過濾液，再加入 450 µl Wash bufferⅡ到 Filter tube 中，離 心 1 分鐘，轉速 10,000 rpm，倒去過濾液，再離心 30 秒，轉速 13,000 rpm 。 最 後 將 Filter tube 置 於 新 的 微 量 離 心 管 中 ， 加 入 50 µl Elution buffer，並靜置 5 分鐘，離心 1 分鐘，轉速 10,000 rpm，即可收到病毒 DNA，存放於-20℃備用。

使 用 試 劑 組 中 所 附 之 六 種 病 毒 (WSSV 、 HPV 、 IHHNV 、 TSV 、 YHV、MBV)引子, 確認含有那些病毒。

PCR, 聚合鏈反應條件

WSSV、 HPV、 IHHNV、 MBV (DNA virus)

引子 2 μl

病毒 DNA 2 μl 滅菌二次水 16 μl

20 μl

*試劑組中所附藍色小管，內含 DNA polymerase, dNTP (粉狀)

94℃ 2 分鐘

YHV、TSV (RNA viral) RT-PCR (反轉錄聚合鏈反應)

94℃ 2 分鐘 94℃ 30 秒 56℃ 30 秒 72℃ 30 秒

35 cycles 72℃ 7 分鐘

4℃ ∞

2.1.6 蛋白質重組

2.1.6.1 材料

限制酵素 NdeI、XhoI、BamHI、SacI、NotI (購自 NEB)

100bp、1kb DNA marker, dNTP、10X PCR buffer、Taq DNA polymerase (5U/ul) 、Loading buffer 和 Plasmid Prep Kit (購自禾鑫公司)

SYBR Green I (10X)(購自 Life) ，使用 DMSO 將 10000X 稀釋成 10X 備用 T4 DNA ligase (購自進階公司)

Agrose gel (USB, 購自季勗公司)

Gel Band Purification Kit (購自 amersham 公司)

50X TAE buffer

Tris base 242 g, Glacial Acetic Acid 57.1 ml, 0.5 M EDTA, pH8.0 溶於 1 L 二 次水中，使用時稀釋成 1X

LB 培養液

10 g Bacto-Tryptone、5 g yeast extract 以及 5 g NaCl 溶在 1 L 二次水中，滅 菌備用

LB 培養基

每升 LB 培養液加入 15 g Agar 經過高溫滅菌後等冷卻至 70 ℃以下再倒盤 (~15 ml/ 每盤) 備用

Kanamycine 配製 : 取 250 mg kanamycine 溶於 10 ml 二次水中，使用 0.45μm filter 過濾，分裝備用

LB (kan)培養液 (基)，kanamycine 最終濃度為 25 μg/ ml

2.1.6.2 基因片段放大

2.1.6.2.1 IHHNV、HPV

引子 (Forward,10 μM) 2 μl 引子 (Reversed,10 μM) 2 μl viral DNA 2 μl dNTP (2 mM) 2 μl 10X PCR buffer 2 μl Taq polymerase (5U/μl) 0.5 μl

滅菌二次水 9.5 μl

20 μl

94℃ 2 分鐘 94℃ 30 秒 54℃ 30 秒 72℃ 1 分鐘

40 cycles 72℃ 5 分鐘

4℃ ∞

2.1.6.2.2 TSV

Taq polymerase(5U/µl) 0.5 μl

滅菌二次水 9.5 μl

2.1.6.3 表現質體的建構

將載體 (Vector, pET28a) 和欲殖入的 DNA 序列 (Insert) ，IHHNV 和

HPV 利用 Nde

Ⅰ

、Xho

Ⅰ

兩個限制酵素；TSV 利用 Nde

Ⅰ

、BamHI 兩個限 制酵素 (pBacPAK8-MTEGFP-TSV，則是利用 SacI、NotI 將 TSV 基因片段 由 pCR-TOPO vector 上切下，接入 pBacPAK8-MTEGFP vector 中) ，於 37

℃之恒溫水槽作用 (Digestion) 16 小時。再將 DNA 取出，加入 1 μl Loading buffer 及 1 μl SYBR GreenⅠ，利用 1%洋菜膠 (Agrose gel)，電壓 100 伏特進行電泳分析，把正確大小的 DNA 及載體片段切下，使用 Gel Band Purification Kit (Amersham)，將膠體中之 DNA 純化出來。純化出來之 基因片段及載體，以 6 : 1 (體積) 混合後，抽乾，用 10μl 二次水回溶，再 加入接合酵素 (T4 DNA ligase, progema)，在 4℃下作用約 16 小時。再進行 轉形作用，將建構好之表現質體，送入 BL21(DE3)菌株中。

2.1.6.4 轉形作用

取 5 μl 接合產物，加到 100 μl BL21(DE3) 的勝任細胞 (competent

cell)中，在冰上靜置 30 分鐘。Heat shock，置於 42℃熱水中 1 分鐘，馬上 置於冰中 2 分鐘。加入 900 μl LB 培養液，於 37℃振盪培養 (200 rpm)1 小 時。取 200 μl 塗於 LB/kna 培養基上，在 37℃隔夜培養。挑單一菌落至 3 ml LB/kna 培養液中，37℃，振盪培養 (200 rpm) 16 小時，利用 Plasmid Prep Kit (GeneMark)，將建構好之質體抽出，並用原先作接合之限制酵 素，來確認插入之 DNA 片段是否有接入載體之中。

2.1.7 表現與純化

IHHNV、HPV、TSV 三個基因均接在 pET28a，利用 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) 誘發載體，使其表現所接入之基因片段。而 純化方面，均利用載體上所共同表現出來之 his-taq，使用 Nickel column 作 純化。

2.1.7.1 材料

IPTG (sigma, 購自季勗公司) Nickel resin (購自 Novagen)

PBS buffer

37g Na₂HPO₄, NaH₂PO₄ 0.35g, NaCl 8.77g 溶於 1 L一次水中

Lysis buffer

NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 50 mM, pH 7.9

Guanidine-Lysis buffer

6 M Guanidine Hydrochloride, NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 50 mM, pH 7.9

Wash buffer

NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 80 mM, pH 7.9

Elution buffer

NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 0.5 M, pH 7.9

透析液Ⅰ

0.25 M Guanidine Hydrochloride, NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 50 mM, pH 7.9

透析液Ⅱ

NaCl 0.2 M, Tris-HCl 20 mM, Imidazole 50 mM, pH 7.9

2.1.7.2 表現

取菌養於 5 ml LB (kna) 培養液中，37℃振盪培養 (200 rpm) 16 小時

後。以 1:100 體積比，轉養至 300 ml LB (kna) 培養液中，37℃振盪培養 (200 rpm) 2~3 小 時 ， 直 到 OD600=0.4~0.6 後 。 加 入 IPTG (final concentration 1mM) 誘導。IHHNV 在 25℃振盪培養 (200 rpm) 10 小時、

TSV 在 37℃振盪培養 (200 rpm) 10 小時、HPV 在 37℃振盪培養 (200 rpm) 6 小時後。以 4℃，轉速 9000g，離心 15 分鐘，倒掉上清液，菌體保存在-20℃中備用。

2.1.7.3 純化

2.1.7.3.1 IHHNV、TSV

取 100 ml 培養液所離心下來之菌體，加入 15 ml Lysis buffer 回溶菌

體。使用超音波震碎方式破細胞 (震幅 30%, 打 1 秒停 2 秒，共打 10 分 鐘)。以 4℃，轉速 10,000 g，離心 15 分鐘，取上清液進行純化工作。

將約 2 ml Nickel resin 裝填到管柱 (直徑 1.5 公分)中，取 20 ml Lysis buffer 平衡管柱。之後將上個步驟中，含有蛋白質的上清液，慢慢加到管 柱之中，待流完時，再用 15 ml Lysis buffer 沖洗管柱一次。取 12 ml Wash

buffer，沖洗管柱一次。再取 12 ml Elution buffer 沖洗管柱，每 1.5 ml 收一 管。

2.1.7.3.2 HPV

取 100 ml 培養液所離心下來之菌體，加入 5 ml PBS buffer 回溶菌

體，使用超音波震碎方式破細胞 (震幅 30%, 打 1 秒停 2 秒，共打 10 分 鐘)。以 4℃，轉速 6000 g，離心 15 分鐘。倒去上清液，加入 5 ml PBS buffer 回溶沈澱物，再使用超音波震碎，條件同上。離心 15 分鐘，4℃，

轉速 6000 g，到去上清液，加入 5 ml Guanidine-Lysis buffer，使用超音波 震碎回溶沈澱物，靜置冰上 1 小時。以 4℃，轉速 16,000 g，離心 30 分 鐘。取上清液，使用針頭，利用重力，慢慢加入 15 ml Lysis buffer，並將 之裝入透析膜 (MW 25,000)中，在 250 ml 透析液Ⅰ中，4℃透析 4~6 小時 後。再將之換到 1 升透析液Ⅱ中，4℃透析約 16 小時後。再以 4℃，轉速 16000g，離心 30 分鐘，取上清液作純化。

將約 2 ml Nickel resin 裝填到管柱 (直徑 1.5 公分)中，取 20 ml Lysis buffer 平衡管柱。將上個步驟中，含有蛋白質的上清液，慢慢加到管柱之 中，待流完時，再用 15 ml Lysis buffer 沖洗管柱一次。取 12 ml Wash buffer，沖洗管柱一次。再取 12 ml Elution buffer 沖洗管柱，每 1.5 ml 收一 管。

2.2 單株抗體之製作

抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質，目前廣為應用的抗體分為兩種，多 株抗體(polyclonal antibody)和單株抗體(monoclonal antibody)。多株抗體是 將抗原打入老鼠體內，經過數次免疫，採集血液，收血清，此為多株抗 體。操作過程雖然簡單，但其專一性低，對於相似的抗原結構都會有所反 應，稱為交叉反應(cross reaction)。1973 年，Milstein 等人，提出骨髓瘤細

胞(myeloma cell)之融合實驗，製造出單株抗體。因為血清中的每一種抗 體，是由單一種 B 細胞所製造，所以將 B 細胞由脾臟中取出，與骨髓瘤細 胞融合，成為可持續分泌抗體，又可在培養基中永久生長的細胞株，即為 融合瘤細胞株(hybridoma cell)。

其過程為，給予小鼠外來抗原，並同時以免疫佐劑加強小鼠免疫反 應，使脾臟內的 B 細胞產生特定抗體，將其與癌化細胞株融合形成可體外 培養且生產特定抗體之細胞株(附錄二)。

附錄二、 單株抗體製作流程圖

第 0 天-將佐劑 ( complete adjuvant) 和抗原等體積混和注射入老鼠體內

第 10 天-第二次注射

第 20 天-第三次注射，解凍 FO 細胞，且大量繁殖

第 27 天-第四次注射

第 28 天- FO 細胞 1：2 繼代培養

第 30 天-採血測 titer，取小鼠脾臟與 FO 細胞做細胞融合

第 37 天-加 50 µL 之 HY-HAT 培養液

細胞數佔孔洞約 50 - 90 %，培養液轉黃取 50 µL，做 ELISA 篩選

陽性細胞群落單株化

以 ELISA 篩選陽性單株細胞群落

大量繁殖陽性單株細胞，收集培養液，做後續實驗用

2.2.1 材料

Name Component Trademark

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

Contains 4500 mg / L D-glucose, L-glutamine, and 110 mg / L sodium pyruvate but no sodium bicarbonate.

GIBCO BRL^® 12800-017

Fetal Bovine Serum (FBS)

< 10 EU / mL endotoxin, < 10 mg / dL hemoglobin, 40 nm flitered.

HYCLONE^® Defined Grade

Penicillin /

Streptomycin (P/S)

Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 µg of

streptomycin (base) / mL utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85%

saline.

GIBCO BRL^® 15140-122

H-Y Medium (HY)

Contains L-glutamine, bovine insulin, oxaloacetate, and sodium pyruvate but no sodium

bicarbonate.

SIGMA H-9014 HYBRI-MAX ^®

HAT Media

Supplement (50 X) (HAT)

Reconstitute contents of vial with 10 mL sterile cell culture medium.

When reconstituted to 10 mL, each vial contains 5×10^-3 M hypoxanthine, 2×10^-5 M

aminopterin, 8×10^-4 M thymidine.

SIGMA H-0262 (v/v) in DPBS without calcium.

SIGMA P-7306 HYBRI-MAX ^®

碳酸氫鈉 (NaHCO3) (購自sigma) DEAE resin (購自 amersham)

PB buffer

1 M Na2HPO4 68.4 ml, 1 M NaH2PO4 31.6 ml補一次水至 5 L, 調pH至 7.2

2.2.2 免疫反應

以純化所得之病毒蛋白為抗原。利用 4-8 週的 BALB/c 小鼠為免疫動 物，以抗原(100 µg / mouse) 加等體積之佐劑 (Freund’s complete adjuvant) (Sigma) 混合成乳劑，於 0 天做小白鼠腹腔注射(IP)。之後再以抗原(100 µg / mouse) 加等體積之佐劑 (Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma) 混合成乳 劑，於 10、 20 及 27 天再進行小鼠腹腔注射 (IP)，誘發免疫反應，使 B 細 胞成熟增生並產生抗體。第 30 天時要採血測價數，確認小白鼠已被引發 免疫反應，確認後再進行細胞融合。

2.2.3 骨髓癌細胞 (myeloma cell)

所用之骨髓瘤細胞株極易增生，且與脾臟細胞融合後，可迅速發育且 分泌高濃度免疫球蛋白。目前最常使用為HGPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) 缺乏性骨髓瘤細胞，如P3、P3 / 653、NS1、

SP2 、 及 FO 等 細 胞 ， 當 細 胞 培 養 於 HAT (hypoxanthine aminopterin thymidine) 培養液中，其中aminopterin可阻止骨髓瘤細胞核酸之正常代謝 途徑 (de novo synthesis) 之進行，使細胞僅能以 HGPRT或TK酵素，依救急 代謝途徑 (salvage pathway) 利用hypoxanthine及thymidine合成核酸，若骨髓 瘤細胞缺乏HGPRT，將無法合成核酸而死亡，而融合細胞因為自脾臟細胞 取得HGPRT之基因而得以存活增生 (參考圖 2-1)。實驗室採用FO細胞株，

採購於食品工業研究所，使用DMEM培養液，添加 0.018 M碳酸氫納、10

% FBS及 1 % penicillin / streptomycin，培養於 37 ℃，5 % CO2。

圖 2-1 細胞內核酸的合成路徑 核酸的正常代謝途徑若被 aminopterin 阻礙，可由 救急途徑 (salvage pathway) 取用 thymidine (T) 及 hypoxanthine (H) 來合成 DNA。

但 FO cell 缺乏 TK 及 HGPRT 兩種酵素，因此在 aminopterin (A) 存在下 FO cell 無法生長；正常細胞 (如 B 細胞) 則可經救急途徑繼續生長。HAT 培養基含 aminopterin, thymidine 及 hypoxanthine，FO cell 在 HAT 中無法生長，除非經由 細胞融合導入 TK 或 HGPRT 兩酵素的基因 (可由正常脾臟細胞得來)。

2.2.4 細胞融合 (Fusion)

小鼠以乙醚將其迷昏後，採眼窩血，無菌操作解剖取出脾臟，以 DMEM於培養皿中清洗兩次。將脾臟至於培養皿中以 5 mL針筒末端平坦 處將脾臟壓碎，用 21G針頭抽吸使細胞分散，經由無菌紗布過濾至 50 mL 離心管，離心 5 分鐘，轉速 260 g，去除上清，再加入 10 mL DMEM沖

洗，重複兩次。同時取FO細胞，以DMEM沖洗細胞兩次，離心 5 分鐘，轉 速 260 g，回溶於 10 mL DMEM中。取部分細胞做細胞計數，用trypan blue 液計算活細胞率，以脾細胞：FO細胞＝4：1 之比例將細胞混合，離心 5 分鐘，轉速 260 g，去上清液 。離心管輕擊桌面震散細胞，於 1 分鐘內緩 慢滴入 1 mL已加溫到 37 ℃之PEG / DMSO，同時輕輕搖晃細胞使其均勻 混合，於 37 ℃水浴 1 分鐘後取出，在 2 分鐘內緩慢滴入 10 mL已加溫到 37 ℃之DMEM，離心管輕擊桌面邊敲邊加，離心 5 分鐘，轉速 180 g，去 上清液，再以 20 mL DMEM沖洗細胞兩次。，以HY培養液 (已添加HAT、

0.018 M 碳酸氫納、20 % FBS及 1 % P / S) 懸浮細胞，並於 96 孔細胞培養 盤 (96 well culture plate)培養細胞，在 37 ℃，5 % CO₂之條件進行融合後細 胞培養。

2.2.5 細胞增殖與取樣篩檢

融合後培養之細胞定期觀察其生長狀況，融合後第 7 天，需再補充 HY-HAT 培養液。14 天後檢查培養液之顏色，若有融合成功有融合瘤細胞 (hybridoma cell) 產生，則培養液顏色變黃，取其培養液做 ELISA 篩檢。太 早做篩檢易漏失陽性細胞，因其分泌出的抗體濃度尚低，但若太遲篩檢，

融合細胞會因過度增生而死亡。因此最好在細胞未長滿前篩檢一次，其陰 性者在培養液變黃時再篩檢一次。培養液經 ELISA 篩檢出含有抗體時，每 一次 ELISA 需作一個負向對照組實驗，將該細胞繼續培養。

2.2.6 抗體之生產

單株抗體之生產是使用組織培養法，組織培養法是以 175 cm²塑膠培 養盤 (T75) 大量培養，直到細胞過飽和開始死亡時，離心除去細胞，收集 上清液，保存在 -20 ℃冰箱中備用。

2.2.7 腹水抗體製備 (Ascetic fluid)

6~11 週大的BALB/C小鼠為實驗動物，第 0 天小鼠腹腔注射給予 0.5 ml Pristane (Sigma)。第 7 天收集單株抗體細胞以PBS清洗兩次後，小鼠腹 腔注射單株抗體細胞，3x10⁶ cell/mouse。第 21 天觀察小鼠，腹部腫脹且行 動不便者，以 18 號針頭配 5ml針筒腹腔收集腹水，可收 2~3 次。將收集的 腹水離心去除組織碎片，最上層白色懸浮物為脂質先去除，收上清液。加 入 50﹪的硫酸銨 (ammonia sulfate)，分三次加入，每次間隔 30 分鐘，最後

6~11 週大的BALB/C小鼠為實驗動物，第 0 天小鼠腹腔注射給予 0.5 ml Pristane (Sigma)。第 7 天收集單株抗體細胞以PBS清洗兩次後，小鼠腹 腔注射單株抗體細胞，3x10⁶ cell/mouse。第 21 天觀察小鼠，腹部腫脹且行 動不便者，以 18 號針頭配 5ml針筒腹腔收集腹水，可收 2~3 次。將收集的 腹水離心去除組織碎片，最上層白色懸浮物為脂質先去除，收上清液。加 入 50﹪的硫酸銨 (ammonia sulfate)，分三次加入，每次間隔 30 分鐘，最後

在文檔中 使用重組蛋白製造對 HPV、IHHNV 和TSV殼蛋白有專一性之單株抗體 (頁 31-0)