Western blot

第二章材料與方法

2.3 抗體的測定

2.3.4 Western blot

硝化纖維膜與紙張先浸泡於轉漬緩衝液 transfer buffer 中，將完成的 SDS-PAGE 膠片置於硝化纖維膜上，上下再夾以三張紙張，置入溼式電傳器中 (Mini Trans-Blot Cell, Bio-Red)，90V，60 分鐘。完成後置入 blocking buffer 中，室溫下搖晃一個小時後，以 PBS 洗去 blocking buffer，重複洗三次，再置入以 PBS 稀釋的一級抗體(待測抗體)，室溫下搖晃一個小時後，

以 PBS 洗去一級抗體，重複洗三次，置入以 PBS 稀釋的二級抗體 (如 goat anti-mouse conjugated HRP antibodies)，室溫下搖晃一個小時後，以洗滌液洗去二級抗體，重複洗三次，後加入 DAB 呈色劑呈色。

2.4 儀器與設備

UVS400, Thermo Savant SPD SpeedVac

BECKMAN COULTER Allegra 21R Centrifuge ORBITOR SHAKER

Centrifuge 5415R, eppendorf

Orbital shaking incubator Model S300R, FIRSTEK SCIENTIFIC 550 sonic dismembrator, FIRSTEK SCIENTIFIC

Mini Trans-Blot Cell, Bio-Red

Fusion Universal Microplate Analyzer, Packard

第三章結果與討論

3.1 病毒基因片段取得

所得到之病毒基因片段均進行定序實驗，且證實所得之 DNA 片段序列無誤。

3.1.1 IHHNV

使用商業用檢測試劑組所抽得之基因體當作模板，再用所設計之引子進行 PCR 反應，即可得到一長度為 990bp 之基因產物 (圖 3-1-1)。

M 1

(Kb)

Lane M: DNA marker (100bp, fermentas) Lane 1: IHHNV PCR 產物，長度 990bp

1.0 0.8 0.8

圖 3-1-1 IHHNV PCR 產物

3.1.2 HPV

Lane M: DNA marker (100bp, fermentas) Lane 1~5: 五隻不同蝦子檢體，編號

#1~5，Lne 6: positive control，若檢體中具有 HPV, 即可放大出一相同大小的片段，該片段長 441bp。結果看來，五隻檢體中，有四隻具有 HPV

圖 3-1-3 HPV PCR 產物

(Kb)

M 1 2 3 4

Lane M: DNA marker (100bp, fermentas) Lane 1~4: 四個不來源，檢體編號為#1、

3.1.3 TSV

TSV 屬於 RNA 病毒，因此需經由反轉錄之過程，以取得 cDNA，再由其為模板，放大出所選取之基因片段。亦因如此，需在所選取之基因片段前後，設計新的引子 (TSV Forward primer 1 and Forward primer 2) ，利用反轉錄酵素，以放大出長度大於目標基因片段之 DNA 片段。再利用這個片段，進行 Nest-PCR，以增加放大量。在圖 3-1-4 中，Lane 1 為使用 TSV Forward primer 1 和 TSV Reversed primer 所放大，其長度為 947bp。而在 Lane 2 則是利用 TSV Forward primer 2 和 TSV Reversed primer 所大出, 其長度為 903bp。再利用這兩段 RT-PCR 產物當作模板，進行 Nest-PCR，不論使用何者當模板，均可得到一片段長度為 876bp 的 DNA 片段 (圖 3-1-5) 。

Lane M: DNA marker (100bp, fermentas)

Lane 1:使用 TSV foreard 1 及 TSV reversed primer 所作之 PCR 結果，可放大出一長 947bp 的片段

Lane 2: 使用 TSV foreard 2 及 TSV reversed primer 所作之 PCR 結果，可放大出一長 903bp 的片段

0.2 0.3 1.5 1.0

Lane M: DNA marker (100bp, fermentas) Lane 1:使用 947bp RT-PCR 產物當模板 Lane 2:使用 903bp RT-PCR 產物當模板

結果指出，不論用何種模板，均能放大出一長度 876bp 的基因片段

3.2 重組蛋白的表現與純化

Lane M: Protein marker (amersham) Lane 1: lysate of BL21(DE3)(pET28a) Lane 2: lysate of BL21(DE3)

(pET28a-IHHNV)

Lane M: Protein marker (amersham) Lane 1: IHHNV 重組蛋白

分子量估計為 37kDa

3.2.2 HPV

HPV 重組蛋白，在 37℃表現時，會形成 inclusion body。改為 25℃表現時，表現量降低甚多，與對照組相比，無法看出差異，僅能使用 anti-his tag 進行西方墨點實驗時，才能看出此重組蛋白分佈在上清液中。在 25℃

表現雖然不會現在 inclusion body，但表現量太低。因此仍在 37℃表現，

使用 Guanidine HCl 將其失活 (denature) 之後，再利用透析方式使其再重疊

Lane M: Protein marker (amersham) Lane 1: lysate of BL21(DE3)(pET28a) Lane 2: lysate of BL21(DE3)

(pET28a-HPV)

Lane M: Protein marker (fermentas) Lane 1: HPV 重組蛋白

分子量估計為 50 kDa

3.2.3 TSV

TSV 重組蛋白，在 37℃表現時，與對照組相比，無法看出差異，僅能使用 anti-his tag 在西方墨點實驗中，證實該重組蛋白可能有表現。但表現量很低，圖 3-2-4 中所純化之重組蛋白，經濃縮約六倍體積後才有如此結果，蛋白質分子量大小，由表現載體與目標基因切接後，估計為 31 Kda。

也嚐試將此基因片段接入 PBACPAK8-MTEGFP 載體中，使用 baculovirus expression system 作表現 (附錄六)，但初步實驗結果看來，與對照組相比，似乎也是沒有表現 (圖 3-2-5) 。

Lane M: Protein marker (amersham) Lane 1: lysate of BL21(DE3)(pET28a) Lane 2: lysate of BL21(DE3)

(pET28a-TSV)

Lane M: Protein marker (Bio-rad) Lane 1: lysate of Hi 5 cell as control Lane 2: lysate of Hi 5 cell (TSV) 分子量估計為 31kDa

3.3 抗體的製作

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000

Dilution factor Absorbance of OD450 nm

圖 3-3-1 實驗接種小鼠血清力價之測試，HPV 重組蛋白

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000

Dilution factor Absorbance of OD 450 nm

圖 3-3-2 實驗接種小鼠血清力價之測試，IHHNV 重組蛋白

3.3.2 單株抗體對抗原反應篩選

3.3.2.1 HPV

在 HPV 方面，因為表現量很高，所以抗原的製備，是將蛋白質粗抽液跑完 SDS-PAGE 後，經染色，將預期位置的帶切下，使用液態氮讓其結凍，再將其磨碎。如此反覆數次，直至膠體顆粒大小可流過 23G 針頭，以便於打到老鼠中。但免疫三次後，測血清價數，未達可作抗體之數，所以再以粗抽蛋白免疫一次。因為粗抽蛋白中，尚有其它雜蛋白，所以會有認其它蛋白的抗體。因此在篩選時，會使用 E. coli BL21(DE3)(pET28a)表現後的粗抽蛋白當作負向選取 (negative selection)，因為這兩組所表現之蛋白質，理論上只差重組蛋白，所以可以利用這樣的方式，保留只會認重組蛋白質的細胞株。所得到的十六株抗體 (表 3.1) ，由 ELISA 數據看來 (圖 3-3-3) ，均會認到其它雜蛋白，但其中，3-24、3-7 這兩株價數高且負向選取的值也較低，代表這兩株細胞所生產之抗體，較不會認到雜蛋白，有較高的專一性。雖然這兩株細胞，其負向選取的值與負向控制比起來，相對高，但在西方點墨實驗中 (圖 3-3-4) ，卻僅認到 HPV 重組蛋白，這可能跟 DAB 呈色靈敏度較差，導致所認到的雜蛋白無法呈現出來。這樣的推論在 ECL (enhanced chemiluminescent) 呈色結果可得到證實 (data 未呈現) ，所得到之單株抗體均會認到重組蛋白以外的雜蛋白。出現這樣的結果，與未作單株化有關，僅靠負向篩選，又在不使用純的蛋白當抗原時，無法得到僅認重組蛋白之單株抗體。在蝦體檢測方面，初步選了 13 隻未含 HPV 的蝦子，取其組織粗抽液當抗原，與 3-24 單株抗體進行西方墨點實驗 (圖 3-3-5) ，初步結果指出，此株僅認到 HPV 重組蛋白。雖然此一結果並不能證明該抗體可與天然的 HPV 殼蛋白作辨識，但也可證明，不會非特異性地辦認到蝦體中其它的蛋白。

表 3.1 HPV 重組蛋白 monoclonal antibodies

Ab so rb an c e o f OD

450

nm

HPV

BL21(DE3)(pET28a)表現後之粗抽蛋白，當作負向選取 (negative selection) ，左圖用 3-7 單株抗體，右圖用 3-24 單株抗體。

85 47

1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Lane 14, HPV 重組蛋白; Lane 15, BL21(DE3)(pET28a)表現後粗抽蛋白，當作負向控制 (negative control)。

Absorbance of OD450 nm

positive control

1 2 M 3 4 5 6 7 47

圖 3-3-7 IHHNV 3-62 抗體與蝦檢體之西方點墨實驗結果。Lane1, BL21(DE3)(pET28a) 表現後粗抽蛋白，當作負向控制 (negative control) ； Lane2, IHHNV 重組蛋白; Lane3~7:

IHHNV 病蝦檢體粗抽液。

3.3.3 單株抗體特異性之測試

抗體與抗原之辨認途徑有二個，一個是蛋白質序列、一個是蛋白質結構。為避免所發展之抗體，會非特異性地辨認到其它蝦病毒，因此將所得到之兩株 HPV 抗體與一株 IHHNV 抗體，交义與 TSV、HPV、IHHNV 三種重組蛋白質進行 ELISA (圖 3-3-8~10) 及西方點墨實驗 (圖 3-3-11~13)實驗。在 (圖 3-3-8)中，使用 HPV 3-24 這株 HPV 抗體，只會專一性辨認到 HPV 重組蛋白。在 (圖 3-3-9)中，使用 HPV 3-7 這株 HPV 抗體，只會專一性辨認到 HPV 重組蛋白，雖然對 IHHNV 重組蛋白有一點反應，這可能與單株化不佳有關。在 (圖 3-3-10)中，使用 IHHNV 3-62 這株 IHHNV 抗體，

只會專一性辨認到 IHHNV 重組蛋白，雖對 HPV 重組蛋白也是有一點反應，這可能也是與單株化不佳有關。而在西方點墨實驗中，也是有類似的結果。因此初步看來，所得到這三株抗體，在不同的重組蛋白中，不會出現非特異性的辨認。

HPV 3-24 antibody Absorbance of OD 450 nm

圖 3-3-8 HPV 3-24 抗體與重組蛋白 ELISA 實驗結果。Positive, 使用老鼠原倍血清；

Absorbance of OD 450 nm

圖 3-3-9 HPV 3-7 抗體與重組蛋白 ELISA 實驗結果。Positive, 使用老鼠原倍血清；

negative, 使用 5%脫脂奶粉；TSV, TSV 重組蛋白；HPV, HPV 重組蛋白；IHHNV, IHHNV 重組蛋白。

IHHNV 3-62 antibody

Absorbance of OD 450 nm

圖 3-3-10 IHHNV 3-62 抗體與重組蛋白 ELISA 實驗結果。Positive, 使用老鼠原倍血

66 CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment

VP2.TSV ---ANPVEIDNFDTTTSGGLIPGGSVTNSEG---STILMNDIPITNQNVVL 45 NS2.HPV MASKGDYYYFTPRDLVNFVNTLLCHKINAIAVKMLTMKEEDFLSQVWLPYIQGFQTAHDL 60 37Kda.IHHNV --MCADSTRASPRKRSRRDAHNEDEEHAEGSSGPDPHRCLQFNTGDSIHITFQTRRYFEF 58 .* . . : : : . :

VP2.TSV SKNVTDN---LFEVQDQALIESLSRDVLLHN---DSWTSSD 80 NS2.HPV GRDSDKCGAAGDEFQEVFLDERKFIDFMTSFRRSVFISYGDEWRHRSSHFMADVFWSDNL 120 37Kda.IHHNV DAANDGN---FDGKNLYCLPLHWMNLYLYG---LKSSDSSATETQRYKM 101 . : : : .: : .

VP2.TSV DEIGTTMTQEQLATEFN-QPHLYEISLPDDIVRKSLFMSNKLANIAYMR--- 128 NS2.HPV RQFWMMIFGECFHVNMSPCKRLYVDMLPYYYLAKMTTENRHLIEWEYMNPCPATHVRRNK 180 37Kda.IHHNV VKSMMKTYGWKVHKAGVVMHSMVPLMKDLKVSGGTSFETLTFTDTPYLE--- 150 : . : . : : *:.

VP2.TSV ---CDYEVTVR---VQATPFLQGALWLWNKMN----AKQTSIIRRTLT 166 NS2.HPV MTGMNFCSQGVVIDNEYPDNQMGCYNIDEHPLPGGIRWSGNTEYRTGYVHVNKVKWLGVT 240 37Kda.IHHNV ---IFKDTTGLHN---QLSTKEADVTLAKWIQNPQLVT--VQSTAANYEDPI 194 . . : . * * .: .

VP2.TSV EHLRSITSFPGIEMNLQSEARAITLS----IPYTSELQVFNPRNVN--- 208 NS2.HPV DKVSDMEETSSDEEVPSSQEKYMKSKEKKEQPKTSEKKDDEPANKKRKFCLTSAALEKQK 300 37Kda.IHHNV QQFGFMEQMRTGDRKAYTIHGDTRNWYGGEIPTTGPTFIPKWGG--- 238 ::. : . : : * *. : .

VP2.TSV ---NLNSIRLSVLSQLQGPEDVESASYSIYGRLKNIK--- 242 NS2.HPV LELGKFFRMEEEPINIKLYDLEEGKEHHVHEAIRIDGTNSKFAKKKDEHGNVIDDFKVIV 360 37Kda.IHHNV ---QLKWDKPSLGNLVYPADHHTNDWQQIFMRMSPIK--- 272 : : . .: . :. * . :

VP2.TSV ---LYGHAP---SVTSSVYPSTQSGYDDDCPIVHAGTDEDSSKQGIV--- 283 NS2.HPV CDGENNLYGFFANTQLNKLFNKWHSTKKYSMKPEHNISLKVSQIQEVRNGKMCIVKMAIN 420 37Kda.IHHNV ---GPNGDELKLG-CRVQADFFLHLEVRLPPQGCVASLGMLQYLHAPCTGQLNKCYIM 326 * : . . : : :

VP2.TSV --- NS2.HPV DDVKCFAR 428 37Kda.IHHNV HTN--- 329

第四章結論與展望

目前可利用所設計之引子，放大出所選之目標基因，並可利用基因重組方式，大量表現這些蛋白質並純化之。也可以使用這些純化的蛋白質，

在 BALB/c 老鼠體內，誘導出對重組蛋白具有免疫反應的多株抗體。所發展的單株抗體中，選擇 3-24 這株單株抗體，與未含 HPV 的蝦子檢體 (由 PCR 方式證實未含 HPV) ，進行西方墨點實驗，結果指出，3-24 這株單株抗體，並不會與蝦子檢體產生非特異性反應，僅會針對 HPV 重組蛋白產生反應，3-7 進行相同實驗，也有相似的結果。在 IHHNV 方面，目前已篩到 3-62 細胞株，可單一辨認出 IHHNV 重組蛋白，並且可在 IHHNV 病蝦中，辨認出此一殼蛋白。但也非特異性地辨認到蝦體粗抽液中其它蛋白質，因此該細胞株可能無法單一用於發展檢測試劑，仍需配合其它細胞株以增加專一性。另外，使用所得到之三株不同的抗體，針對不同之重組蛋白進行 ELISA 及西方點墨實驗也初步證實，這些抗體對不同的重組蛋白並不會有非特異性的辨認產生。

目前的結果中，僅使用未含 HPV 的蝦體，之後仍需使用含有 HPV 的蝦體，看能否使用單株抗體，認到 HPV 上的這個抗原。另外，TSV 尚有其它兩個殼蛋白、HPV 仍有一個殼蛋白，後續實驗中，可先利用同樣的方式，發展成單株抗體。再整合這些對蝦病毒殼蛋白具有專一性的抗體，作下列四種應用: (1) 發展出檢測工具； (2) 純化病毒，用以探討致病機制；

(3) 進行中和反應 (neutralization) ，以探討殼蛋白在病毒入侵宿主時，是否具有細胞吸附 (cell attachment) 的功能； (4) 發展口服疫苗。以下將就各應用作一簡略之介紹。

(1) 發展檢測工具，取得對病毒表面殼蛋白具有專一性之單株抗體後，

將應用於 immuno-strips 及 immuno-PCR 等檢測工具的開發。Immuno-strips (附錄七) 利用單株抗體，吸附在膜上當作捕捉抗體 (capture antibody) ，辨

認到病毒表面殼蛋白時，再利用結合金粒子之單株抗體當作二級抗體 (secondary antibody)，因為金粒子聚集時，會呈現紫紅色 (附錄八) ，以此作為判斷之用。Immuno-PCR (附錄九)，則是利用 PCR 的方式放大訊號，

藉此增加靈敏度。原理為，對殼蛋白 (抗原) 具有專一性的抗體作為捕抓抗體，再以 biotinylated anti-IgG antibody 當作二級抗體，透過 strepavidin 這個蛋白質，連結 biotinylated signaling DNA，如此，將抗原上連結上一段 DNA，之後可利用 PCR 將訊號放大。放大的 DNA 可用電泳分析，或是作比色分析。因為透過 PCR 放大訊號的關係，一般只要幾百個分子就可被偵測到。

(2) 純化病毒，病毒顆粒可用以探討致病機制。一般傳統的純化方法，

是利用不同的蔗糖梯度 (sucrose gradient) 或是氯化鍶梯度 (CsCl gradient) ，在超高速離心下，將病毒純化出來。我們利用抗體與抗原高度的專一性，

將抗體與 sepharose 這類載體結合，發展成親和性管柱。(附錄十)

(3) 中和反應實驗，探討病毒殼蛋白在病毒入侵宿主時，是否具有細胞

在文檔中使用重組蛋白製造對 HPV、IHHNV 和TSV殼蛋白有專一性之單株抗體 (頁 49-0)

第二章 材料與方法

2.3 抗體的測定

2.3.4 Western blot

2.4 儀器與設備

3.1 病毒基因片段取得

3.1.1 IHHNV

(Kb)

3.1.2 HPV

(Kb)

3.1.3 TSV

3.2 重組蛋白的表現與純化

3.2.2 HPV

3.2.3 TSV

3.3 抗體的製作

3.3.2 單株抗體對抗原反應篩選

3.3.2.1 HPV

Ab so rb an c e o f OD

nm

HPV

3.3.3 單株抗體特異性之測試

第二章材料與方法