二、微陣列分析
7. 基因表現
中草藥物對於肝癌細胞的處理，不論是抑制生長或誘發細胞凋亡作用皆為複雜的細 胞生理作用，由多條生理生化途徑交叉串連構成 [Fadok et al., 1992; Liu et al., 1996;
Nagata, 1997]，透過少數幾個基因表現儘管可說明中草藥抗癌效應可能產生的途徑，但 微陣列的分析同時提供上萬個基因的偵測，更可以推測細胞生理途徑中，上下游基因的 表現機制。在許多基因的功能性種類中，基因表現樣式常被探討，對於細胞凋亡、細胞 增生、細胞壞死及細胞死亡相關的基因經過Cluster 3.0 程式的分析後，作基因表現樣 式的討論。表
3-4 為與細胞凋亡作用相關的基因表現樣式，經過叢集分析後，基因表現
樣式的Cy5/Cy3 數值列於表中，主要分為三個基因群，第一群基因群為具有低表現量（Cy5/Cy3 < 0.5；綠色表示）的細胞凋亡作用相關的基因，含有 UBE2M、CFLAR、
PLINP-1、UBE2I、PSMA6 及 RELA 等基因。第二群基因為具有高表現（Cy5/Cy3 > 2.0；
紅色表示）的細胞凋亡作用相關基因，含有BID、MLC-B、FASTK、PSMB6、PSMB8、
PSMB1 及 E2F4 等基因。第三群基因為與細胞凋亡途徑相關的基因，包含 BAK1、
BCL2、BCL2L2、BIK、BNIP3L、CASP3、CASP8、CASP9、CFLAR、FADD 及 FAIM2 等基因。使用五種中草藥分別處理後，在細胞凋亡作用相關基因中具有低表現量的RELA 為NF-κB p65 subunit，而 PSMA6 為 proteasome subunit-α-type-6。B 型肝炎病毒基 因轉殖小鼠（HBx transgenic mice；p21-HBx）的腫瘤細胞經 2-DE 分析後， PSMA6、
PSMB4、PSMC2 與 PSMD12 具有高表現量 [Cui et al., 2006]。NF-κB 為啟動促進腫
瘤及腫瘤血管成長之蛋白質表達的一種轉錄因子，也可阻礙細胞凋亡作用，造成癌細胞 不滅的延續，HepG2 經 interferon-α（IFNα）或酒精處理後，會使 NF-κB 活化，藉由 TNFα 或 NF-κB 和 IFNα 的結合物可以讓 IκBα 快速分解，IFNα 可以增加 HepG2 細胞 對於TNFα 活化的靈敏度，並增加單核球炎症性的細胞激素，尤其是 IL-2 的產生 [Szabo et al., 2001]，癌細胞中會大量表現 NF-κB 而刺激生長，而 IκBα 在癌細胞中為低表現量
（與正常肝細胞比較），p50（NF-κB1）與 p65（RelA）為 NF-κB 的 subunit，肝癌細 胞SMMC7721 中轉殖入突變的 IκBα（mIκBα）質體，可以抑制 NF-κB 活性與癌細胞的 生長 [Wang et al., 2003]。在豬隻血管中注射 Doxorubicin 後 24 小時，HSP72（heat shock protein 72）在肝臟中大量表現，但 NF-κB p65 並無明顯的表現，於 stop-flow 化 學治療結束，30 分鐘時，NF-κB p65 的濃度為最高點，然後在 6 小時內，緩慢的下降 [Lu et al., 2005]。經紫蘇與刺五加葉分別處理後，具有高表現的 FASTK 為 FAST kinase，
在Fas 途徑的細胞凋亡作用，FASTK 會被快速的活化，當 FASTK 被快速的去磷酸化時，
會伴隨TIA1（細胞核中 RNA 的結合蛋白質，含有細胞凋亡作用的 effector）的磷酸化，
而TIA1 的磷酸化反應會在 DNA 發生片段化之前產生，所以被當作傳遞細胞凋亡訊息給 下游基因的角色 [Tian et al., 1995]。應用含有 588 個基因的 cDNA 微陣列偵測結腸腺 窩腺腫瘤基因表現，與細胞凋亡作用相關的基因FASTK 與 p53 為低表現量，細胞增生 相關基因p21-rac1（ras-oncogene 相關基因）與 MAPK p38α 為具有高表現量的基因 [Lechner et al., 2003]。在逐步叢集分析中，大多與細胞凋亡途徑相關的基因分類於叢 集2 與叢集 10 中。大部分歸類於這兩個叢集的基因表現樣式低，但在其他分類的叢集 中，如叢集14 也可以發現表現量高的基因；而在自組圖分析中，跟細胞凋亡途徑相關 的基因大多分類於叢集7 及 6，也是屬於基因表現樣式低的族群，但在叢集 11 中，也 具有跟細胞凋亡途徑相關，但表現量高的基因。不同中草藥水萃出物處理後，所引發的 基因表現機能具有不同的基因表現樣式的變化。
表
3-5 為與細胞增生相關的基因表現樣式，具有低表現量基因的為 LMO4、
PRDM4、PTHLH、PBEF、ANK2、ANK3、DLG5、LGALS2、SIPA1、SST、PA26
及PTCH。高表現的基因有 CTBP1、GRN、SCGN、TFDP1、FLJ22169、TPD52L2 及DRIM。表現量不變的基因有 LRP5。分別以紫蘇與霍香處理後，在細胞增生相關基 因中具高表現量的GRN 為 granulin，生長因子 granulin-epithelin precursor（GEP）在 肝癌細胞中，為高表現的基因，在RNA 與蛋白質層面上，比起正常肝細胞皆具有高度 的表現，在Hep3B 細胞中，也證實 GEP 蛋白質濃度降低會使細胞增生效率減少 [Cheung et al., 2004]。使用五種中草藥分別處理 HepG2 後，具有低表現量的 DLG5 為 discs-large（Drosophila）homolog 5，與人類同源的果蠅 dlg 腫瘤抑制基因又稱為 P-dlg，除了腦之外，在胎盤與許多種腺細胞中會表現，P-dlg 蛋白質存在於細胞膜與細 胞質中，在正常前列腺組織的上皮腺細胞中表現，但不會在前列腺癌細胞中表現 [Nakamura et al., 1998]。hDlg5 為 MAGUKs（membrane-associated guanylate kinase homologs）家族成員之一，在乳癌細胞 MCF-7 中為主要黃體激素的目標基因，使用合 成的黃體激素MPA（medroxyprogesterone acetate）處理 MCF-7、T47D 與 ZR-75-I 細胞後，hDlg5 mRNA 快速且明顯的增加 [Purmonen et al., 2002]。胰臟導管腺癌
（pancreatic ductal adenocarcinoma；PDAC）中 DLG5 具有高表現量，降低內源性的 DLG5 可以有效的抑制 PDAC 細胞的生長 [Taniuchi et al., 2005]。細胞增生有關的基因 在逐步叢集分析中多分類於叢集2、9、10、12 及 17；比較在自組圖分析中所分類的叢 集，與細胞增生相關的基因表現樣式，具有低表現的基因大多於叢集7，而具高表現量 的基因大多分類於叢集11 與 20，其他與細胞增生相關的基因也大部分在叢集 7 與 6 中。
藥物大都會藉由肝臟的代謝而轉變為較親水性，然後再由腎臟或膽汁排出體外。許 多 致癌 物 需要 代 謝 酶啟 動 後 ，才能與細胞的大分子起反應，因 此 這 些 代 謝 酶的 基 因 多 態 性和變異對癌症有重要的影響。基 因 的 多 態 性 存 在 於 許 多 代 謝 酶中 ，肝臟代謝Ⅰ期中扮 演重要角色的Cytochrome P450 基因（例如 CYP1A1、CYP1A2、CYP2D6 及 CYP2E1）
[Yu et al., 1995]。Cytochrome P450-2E1（CYP2E1）是 Cytochrome P450 家族中的 主要成員，主要表現於肝臟。CYP2E1 可以被乙醇誘導活化，參與小分子物質（例如亞 硝胺、乙醇、苯及CCl4）的代謝作用。CYP2E1 基 因 或 是 酶活 性 的 改 變 ，會影響對身
體的毒性和致癌性 [Maezawa et al., 1994]。Cytochrome P450 superfamily 相關的基因 表現樣式列於表
3-6，經五種不同中草藥水萃出物處理後，基因表現樣式低的有 CYP2C9
與CYP2J2。表現量高的基因有 CYP27A1、CYP1A1 及 CYP2S1。表現量不變的有 CYP2C8。經過紫蘇、霍香或刺五加葉水萃出物處理後，基因表現樣式低的有CYP11B1、CYP2A6 及 CYP4B1。在紫蘇、霍香、防風與刺五加葉處理後，具有低表 現量的CYP2C9 為 cytochrome P450-family 2-subfamily C-polypeptide 9，研究指出在 肝癌細胞中，Cytochrome P450 基因表現的活性很低，常伴隨少量的肝臟轉錄因子
（C/EBPα 最為常見），在 HepG2 細胞中植入帶有 Zn-inducible metallothionein promoter 的 C/EBPα vector，使 C/EBPα 基因功能啟動，伴隨 CYP2 家族（CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6）mRNA 增加，因此推論轉錄因子可以控制在肝臟中 CYP 基因的表 現 [Jover et al., 1998]。早期在 HepG2 細胞上使用 RT-PCR 的技術，研究經藥物處理 後CYP3A mRNA 的表現，更進一步的研究，有利用 RT-competitive PCR 探討經 rifampicin（RFP）處理的 HepG2 細胞，可以誘發 CYP3A4，CYP2C9，CYP2E1 與 CYP1A2 的表現，經過長時間的處理（120 小時），CYP3A4 與 CYP2C9 基因具有高表 現 [Sumida et al., 2000]。經過防風、霍香與刺五加葉處理後，具有高表現量的 CYP1A1 為cytochrome P450-family 1-subfamily A-polypeptide 1，在 HepG2 細胞的研究上，有 經多環芳香族B[a]P-7,8-dihydrodiol 處理後，所誘發的細胞凋亡作用，和刺激
hydrocarbon（Ah）接受器活性與誘發 CYP1A1 基因表現有關 [Chen et al., 2003]。經 tocotrienols（vitamin E 的主要成分之一，已被證實可以抑制小鼠的肝癌與肺癌）中的 δ-tocotrienols 處理的人類肝癌細胞株 HepG2，可以抑制生長，並使 CYP1A1 基因具有 高表現 [Wada et al., 2005]。近來更有利用 cDNA 微陣列（具有 600 個與毒物學方面相 關的基因）分析經多環芳香族處理後，並以32P 標定探針，經影像與數據分析，具有高 表現量的CYP1A1、CYP1A2 與 CYP2D6 為高度相關的基因 [Staal et al., 2006]。在基 因逐步叢集分析結果中，基因大多分類於叢集8、10 及 15 中；自組圖分析的結果，大 部分的Cytochrome P450 基因屬於叢集 1、6 及 7。許多中草藥已被用來作抗癌研究，
粉防己鹼可抑制HepG2 細胞生長，並誘發產生細胞凋亡的作用 [Yoo et al., 2002]。補
中益氣湯可以抑制肝癌細胞的生長，使細胞週期停滯於G0/G1 期（抑制 DNA 合成）並 誘發細胞凋亡作用 [Kao et al., 2001]。綠茶含有天然化合物黃烷醇（flavanol），主要的 多酚成分epigallocatechin-3-gallate（EGCG）可以預防酒精誘發的肝臟傷害，並對抗 因CYP2E1-dependent 產生的氧化傷害以及抑制人類 CYP2E1 基因在 HepG2 細胞中 過度表現 [Jimenez-Lpoez and Cederbaum, 2004]。白芍水萃出物可抑制 HepG2 細胞 生長，誘發細胞凋亡作用主要是以p53 的途徑發生，其中 BNIP3 具有高的基因表現樣 式，而ZK1、RAD23 及 HSPD1 基因表現低 [Lee et al., 2002]。霍香含有黃酮類成分，
可以抑制由TNF-K 所誘發的 VCAM-1 基因表現 [Hong et al., 2001]。使用五種不同中 草藥對於HepG2 細胞的處理，所誘發的細胞凋亡、細胞增生及影響肝臟代謝的
Cytochrome P450 基因表現的變化不盡相同，但中草藥所含的有效的抗癌物質值得被進 一步研究。