抗腫瘤之紫蘇、霍香、防風、刺五加葉和石蓮花萃出物對人類肝腫瘤細胞HepG2基因表現樣態之影響

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(1)國立交通大學生化工程研究所生物科技學院碩士論文抗腫瘤之紫蘇、霍香、防風、刺五加葉和石蓮花萃出物對人類肝腫瘤細胞 HepG2 基因表現樣態之影響 Effect of Perilla frutescens, Agastache rugosa, Saposhnikovia divaricatae, Acanthopanax senticosus L. and Echeveria elegans antitumor herbal extracts on the gene expression pattern of HepG2 cells. 研究生：古家禎指導教授：林志生博士. 中華民國九十六年十二月.

(2) 抗腫瘤之紫蘇、霍香、防風、刺五加葉和石蓮花萃出物對人類肝腫瘤細胞 HepG2 基因表現樣態之影響. Effect of Perilla frutescens, Agastache rugosa, Saposhnikovia divaricatae, Acanthopanax senticosus L. and Echeveria elegans antitumor herbal extracts on the gene expression pattern of HepG2 cells. 研究生：古家禎指導教授：林志生博士. Student：Chia-Chen Ku Advisor：Chih-Sheng Lin Ph.D.. 國立交通大學生化工程研究所生物科技學院碩士論文. A Thesis Submitted to Institute of Biochemical Engineering College of Biological Science and Technology National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master in. Institute of Biochemical Engineering. December 2007 Hsinchu, Taiwan, Republic of China. 中華民國九十六年十二月.

(3) 抗腫瘤之紫蘇、霍香、防風、刺五加葉和石蓮花萃出物對人類肝腫瘤細胞 HepG2 基因表現樣態之影響. 研究生：古家禎. 指導教授：林志生博士生化工程研究所生物科技學院國立交通大學中文摘要. 近幾年微陣列技術以應用獨特的基因表現樣態，並結合特定細胞內的反應來提供一個快速的檢測方法。許多天然植物來源的產品已經被證實具有抗癌能力。因此傳統中草藥的應用可以增加對於預防與治療疾病的研究。處理癌症主要治療的方法，包括誘發不正常細胞產生凋亡作用。所以我們嘗試作細胞層面的探討以及 cDNA 微陣列技術，來篩選可以抑制癌症細胞增生與致使癌細胞產生凋亡作用的中草藥萃出物。製備紫蘇、霍香、防風、刺五加葉、石蓮花及七層塔的水萃出物，並用來評估對於人類肝癌細胞株 HepG2 抑制生長的影響。應用 MTT 細胞存活分析來測量六種中草藥萃出物對於抵抗癌細胞的增生能力。並以 Annexin V-FITC 與 PI 螢光染色分析偵測細胞凋亡作用。分離細胞 total mRNA 後，分別使用 cyanine 3-dUTP 標定 PBS 處理的細胞 mRNA，而 cyanine 5-dUTP 標定經中草藥萃出物處理後的細胞 mRNA。應用含有 7,680 個 spots 的晶片，研究經中草藥萃出物處理 HepG2 細胞的基因調節。晶片掃瞄後，以 GeneCluster 軟體作資料分析。經多種濃度的中草藥萃出物處理 72 小時後，確立可抑制 HepG2 細胞生長的中草藥濃度。紫蘇、霍香、防風、刺五加葉及石蓮花抑制細胞生長 50%的濃度依序為 100、300、 400、400 及 400 g/mL。刺五加葉與防風對於誘發 HepG2 細胞產生凋亡作用經流式細胞儀分析，凋亡細胞族群（PI－/AnnexinV＋）的百分比依序為 15.8 0.8%與 21.4 0.9% （P < 0.001）。以 Tukey 公正顯著差異法、鄧氏新多變測驗法及最小顯著差異法的變異 i.

(4) 數分析結果，顯示霍香與刺五加葉對於 HepG2 的處理，具有相似的基因表現。 Spearman’s 等級相關係數（r）分析結果也指出經中草藥水萃出物處理後所誘發的基因表現樣態中，以霍香與刺五加葉具有高相關性（r = 0.8）。cDNA 微陣列的群集分析結果為多數基因表現與細胞凋亡、細胞增生及 Cytochrome P450 superfamily 有關。許多基因具有低表現量，尤其是與細胞增生相關的基因。比較逐步叢集分析法，自組圖分析法對於五種中草藥萃出物所誘發的基因表現樣態更具備良好的分群能力。分析的結果可以讓我們增加對於中草藥抗癌能力的瞭解。此外細胞毒性與微陣列的結果可以定義經防風、刺五加葉、紫蘇、霍香及石蓮花萃出物處理 HepG2 細胞後，抵抗癌細胞增生的能力與細胞凋亡相關的基因。因此在治療肝癌上，這些關於中草藥萃出物的研究發現，使其具有純化為試劑的價值。中草藥萃出物對於 HepG2 細胞的抗腫瘤效用，於某種程度上可抑制癌細胞的增生。在 cDNA 微陣列中，此研究提供一個在 cytochrome P450 superfamily、細胞增生及細胞凋亡作用上，可能是抑制與肝臟方面相關的基因表現樣態之開端。根據樣態而比較群集分析的結果，自組圖分析更適合用來運算及分類與抗腫瘤有關的基因表現樣態。研究 cDNA 微陣列可幫助瞭解中草藥萃出物在生理活動層面上的意義。. ii.

(5) Effect of Perilla frutescens, Agastache rugosa, Saposhnikovia divaricatae, Acanthopanax senticosus L. and Echeveria elegans antitumor herbal extracts on the gene expression pattern of HepG2 cells. Graduate Student: Chia-Chen Ku. Advisor: Chih-Sheng Lin Ph.D.. Institute of Biochemical Engineering College of Biological Science and Technology National Chiao Tung University Abstract In recent years, microarray technology provides a rapid method to associate specific cellular responses with unique gene expression patterns. Many natural plant source products have demonstrated that including anticancer ability.. Moreover,. traditional herbs application is increasing in investigation into prevention or treatment in the disease. The main therapeutic approach of cancer treatments is inducing abnormal cells apoptosis.. Therefore, we attempt to screen herbal extracts that can. inhibit cancer proliferation and lead cancer cells to apoptosis by the cellular studies and cDNA microarray technology. Herbal extracts, Perilla frutescens, Agastache rugosa, Saposhnikovia divaricatae, Acanthopanax senticosus L., Echeveria elegan, and Salvia Plebeia R. Brown were prepared and used to evaluate the effect of growth inhibition on human hepatoma HepG2 cells.. MTT cell viability assay was used to measure the antiproliferative. effects of six herbal extracts. fluorescent staining assay.. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI After total mRNA isolation, mRNAs from PBS-treated. cells were labeled with cyanine 3-dUTP and mRNAs from the herbal extracts treated cells were labeled separately with cyanine 5-dUTP. The chip comtains 7,680 spots were used for studying the gene regulation in HepG2 cells treated with herbal extracts. The slides were scanned and the data were analysed by GeneCluster software. iii.

(6) The growth of HepG2 cells in the presence of various concentrations of herbal extracts for 72 h were determined. The growth inhibition (IC50) of P. frutescens, A. rugosa, S. divaricatae, A. senticosus L. and E. elegans were about 100, 300, 400, 400 and 400 g/mL, respectively.. Significant induction of apoptosis was observed in the. HepG2 cells treated with A. senticosus L., and S. divaricatae extract by flow cytometric analysis, and the fraction of apoptosis cells (PI－/AnnexinV＋) were as following 15.8 0.8% and 21.4 0.9%, respectively (P < 0.001).. ANOVA analysis of. Tukey’s honest significant difference, Duncan’s new multiple range test and least significant difference test, A. rugosa and A. senticosus L. had similar gene expression in HepG2 cells. The spearman correlation coefficients (r) were calculated for the gene expression levels of these herbal extracts treatment, and high correlation value was between A. rugosa and A. senticosus L. (r = 0.8).. The clustering results of. cDNA microarray indicated that the expression of numerous genes associated with the apoptosis, proliferation, and Cytochrome P450 superfamily.. Most gene. expression levels were down-regulation, especially in proliferation-related genes. Compared with the k-mean analysis, the SOM analysis in five herbal extracts had good ability of grouping genes.. The result may improve our understanding of the. actions of herbs with anti-tumor activities.. Additionally, the cytotoxicity and. microarray results enabled the apoptosis-associated genes that are responsible for the anti-proliferative activities of S. divaricatae, A. senticosus L., P. frutescens, A. rugosa and E. elegans extracts in HepG2 cells to be identified.. Moreover, these. findings revealed that herbal extracts are the material with potential to be purified as an agent for treating hepatocellular carcinoma. The anti-tumor effects of herbal extracts on HepG2 cells are due in part to inhibition of cancer cells proliferation.. Our study provided a preliminary profile of. gene expression may be related to suppress hepatic expression of cytochrome P450 iv.

(7) superfamily, proliferation and apoptosis in cDNA microarray.. According to the profile,. we compared with cluster analysis, and SOM was more suitable to use in assaying the gene expression profiles associated with the anti-tumor.. Such cDNA microarray. studies can help to identifying herbal extracts in physiological activities.. v.

(8) 誌. 謝. 承蒙指導教授林志生老師在本論文撰寫的過程中細心指導，幫助愚昧與不才的我順利完成學業，在平時的研究中，總以科學的角度切入探討，使我獲益良多，在此致上最深的感謝與敬意。由衷感謝生物科技學院的大家長毛仁淡教授對我的關懷與照顧，除了協助完成論文外，還諄諄教誨我要面對挫折與困難，學習以正確的態度去面對人生。而口試期間，承蒙廖光文教授用心的提點學生在研究上不足的地方，您謹慎思密的研究態度，更是我要學習的目標。在此感謝實驗室建龍學長、俊旭學長及琦斐學姐，在研究上給予的指導與幫忙，更感謝一路支持我繼續學業的瑞萍與俊嘉賢伉儷的照顧與關心，在我人生最低潮的時候拉我一把，也感謝元平、豐鵬、千雅及實驗室學弟妹的協助與包容。對於東海大學一直很照顧與關心著我的劉琳琳老師、洪連欉老師與楊錫昆主任，在此也致上最深的感謝與敬意。感謝台大醫學院符文美教授的關心與照顧，更感激台大醫院林至芃醫師與陳倩儀醫師賢伉儷的幫忙與包容，讓我內心充滿感動！還有要謝謝麗瑛學姐、明城學長、奕廷學長及右穎學長，好友宇淇、麗君、瑋倫、慈安、秉筠、蕙如、妍青、宜慧、琇雯、金蓉、家珍、志瑋、家銘、宇昕、緒民、博群、念組、宏文、維捷、明景及奉庭，同儕翊維、美婷、惠君、宏輝及愛雁，學弟妹欣怡、珮綾、尚燁、智恆、如珊、政文、欣彬及昱丞的幫忙與支持。更感謝葉連發先生、李成衍先生與范宜輝先生在實驗上的協助，讓我更能順利進行研究。最後把這篇論文獻給我至愛的家人，還有一路陪我成長的世杰，非常感謝我的父母一路上的支持與關懷，這份感動與感謝再多的言語也無法形容，以此篇論文表達最誠摯的感激與祝福！. 古家禎謹誌交通大學生物科技學院生化工程研究所中華民國九十六年十二月. vi.

(9) 總目錄頁次中文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. i. 英文摘要… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. iii. 誌謝… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. vi. 總目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. vii. 圖目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. ix. 表目錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. x. 附表目錄................................................................................................................. xi. 論… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 001. 一、DNA 微陣列晶片之原理與發展… … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 001. 二、DNA 微陣列晶片在生物醫學上之應用… … … … … … … … … … … … … … … …. 004. 三、科學中草藥的發展… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 005. 四、中草藥在抗腫瘤與抗癌之研究近況… … … … … … … … … … … … … … … … … …. 006. 壹、緒. 五、DNA 微陣列於中草藥研發上的運用… … … … … … … … … … … … … … … … … . 013. 貳、材料與方法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 014 一、中草藥水萃出物製備方法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 014. 二、細胞培養與處理方法… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 014. 三、細胞存活率測試… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 015. 四、RNA 製備… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 015 五、cDNA 微陣列分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 017. 六、Annexin V-FITC 螢光染色… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 020. vii.

(10) 參、結果與討論… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 023. 一、細胞存活率測試… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 023. 二、微陣列分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 024. 三、細胞凋亡分析… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 034. 肆、結論… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 037. 伍、參考文獻… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …. 040. 圖… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 056 表… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 072 附錄… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 088. viii.

(11) 圖目錄頁次圖 1-1、細胞凋亡的途徑… … … … … … … … … … … ................................................. 056 圖 2-1、cDNA 微陣列分析流程圖… … … … … … … … … … … … … … … … … ..… … …. 057. 圖 3-1、中草藥水萃出物處理 HepG2 的細胞存活率分析...… … … … … … … … … …. 058. 圖 3-2、經 GenePix 螢光掃瞄機擷取 cDNA 微陣列的影像… … … … … … … … … .... 059 圖 3-3、不同中草藥處理的微陣列 Cy5/Cy3 比值之標準常態分佈… … … … … … … . 061 圖 3-4、不同中草藥處理對於基因表現樣態之逐步叢集分析結果… … … … … … … . 圖 3-5、五種中草藥處理所誘發基因表現樣態之自組圖分析結果… … … … … … … 圖 3-6、不同中草藥處理 HepG2 細胞 72 小時後的流式細胞儀分析結果… … … …. 063 065 068. 圖 3-7、以流式細胞儀分析中草藥水萃出物處理後 PI-AnnexinV+與 PI+AnnexinV+ 族群的結果… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 071. ix.

(12) 表目錄頁次表 1-1、微陣列晶片的分析方法… … … … … … … … … … … … … … … … … … . 072 表 1-2、科學中草藥的研究發展… … … … … … … … … … … … … … … … … … . 表 1-3、應用中草藥的抗癌研究… … … … … … … … … … … … … … … .… … ... 表 1-4、應用微陣列分析的中草藥研究.… … … … … … … … … … … … … … .... 073 074 078. 表 3-1、不同中草藥處理的基因表現樣態 Cy5/Cy3 之偏態係數與峰值係數 080 表 3-2、不同中草藥處理的基因表現樣態 spearman 相關係數… … … … … .. 表 3-3、以五種不同中草藥處理的基因表現樣態 ANOVA 分析結果… … … … . 表 3-4、細胞凋亡作用相關的基因表現樣態… … … … … … … … … … … … … . 表 3-5、細胞增生相關的基因表現樣態… … … … … … … … … … … … … … … . 表 3-6、Cytochrome P450 superfamily 相關的基因表現樣態… … … … … …. x. 081 082 083 085 087.

(13) 附. 錄頁次. 附錄表 1、基因名稱對照… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 088 附錄表 2、論文中所提及之運算公式列表… … … … … … … … … ..… … … … …. 092. 附錄表 3、本研究中所運用之運算公式列表… … … … … … … … … … … … … . 093 附錄圖 1、細胞凋亡途徑中抗癌藥物處理 HepG2 細胞的基因表現樣態… …. 095. 附錄圖 2、細胞增生途徑中抗癌藥物處理 HepG2 細胞的基因表現樣態… …. 096. 附錄圖 3、肝臟代謝途徑中抗癌藥物處理 HepG2 細胞的 Cytochrome P450 family 基因表現樣態… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. xi. 097.

(14) 壹、緒. 論. 一、DNA 微陣列晶片之原理與發展 1. DNA 微陣列晶片的應用原理傳統的核酸分子雜交技術（例如 Northern blot 或 Southern blot）所耗費的人工、時間與效力不足以應付大量基因信息的產生，基因晶片為近幾年興起的一項生物技術，可以將生物中許多不連續的分析過程，移植到固相的晶片上進行，並且使其連續化和微型化 [Kallioniemi et al., 1992; Schena et al., 1995; Shalon et al., 1996]。生物晶片在廣義的定義上是指與生物有關的分子（例如：基因、蛋白質、碳水化合物或細胞組織），利用微小的面積且高密度的排列方法，將探針定位在經過特殊處理的塑膠、矽片或玻璃材質上，依照植入微陣列晶片上物質的不同，可以分為基因晶片與蛋白質晶片，應用最廣泛的 DNA 微陣列晶片，主要是把已知序列的單股 DNA 分子（DNA 探針），以打點的方式附著固定在玻璃晶片或其他固體上，另一段未知且有興趣的 DNA 片段（標的 DNA）以螢光標定的方式偵測並進行資料分析。基因晶片技術又稱作 DNA 微陣列（DNA microarray）或是 DNA 微陣列晶片，也稱為生物晶片（biological chip 或 biochip）。微陣列分析可以使用 RNA 的樣品同時測量數千個基因的表現，經過微陣列的實驗分析，可以解開許多重要的生物現象，如：基因表現樣式、藉由相同途徑調節的基因群與比較兩種不同的實驗狀況 [Garrigues et al., 2005]。經由兩種不同的狀況處理細胞後所萃取出的 mRNA，經過反轉錄作用成 cDNA 時，通常會標定上兩種不同顏色的螢光物質（例如 cyanine 3-dUTP [Cy3] 與 cyanine 5-dUTP [Cy5]）。混合標的上不同螢光的 cDNA，同時與有規律地排列並固定於玻璃片上的基因或表達序列標籤（expressed sequence tags; EST）結構作競爭性雜合作用（comparative hybridization），由 Cy3 或 Cy5 標的上的目標物（target）在每一個基因的 spot 上所激發出的光分別為綠色與紅色，再以螢. 1.

(15) 光掃描器（鐳射共聚焦螢光檢測系統）對晶片進行掃描並讀取訊號，每一個 spot 所散發出的螢光訊號還需要經過電腦軟體系統定量數值，並比較和檢測那些特定位置的 DNA 有增加（gain）或減少（deletion），從而迅速得出所要的資訊。背景值的擷取通常由 spot 周圍的面積取決，而 Cy3 與 Cy5 的訊號強度會扣除掉背景值。最後，每一個基因的表現數值會經過 log2 運算的比值會用來表示對照組與實驗組間相關基因的表現量 [Quackenbush, 2001]。經由 log 的運算後，在同一個基準點上，高表現與低表現的數值相互作比較。. 2. DNA 微陣列的發展 1990 年代初，人類基因體計畫與分子生物的發展奠定基因晶片技術的形成，史丹佛大學 Brown 教授實驗室發明第一塊應用玻璃材質的基因微陣列晶片 [Schena et al., 1995]，基因晶片是因應人類基因體計畫完成後所衍生出來的產品，主要是利用為處理技術，把基因黏著於玻璃片上，同時可以處理上萬個基因的點漬晶片，全面且大量的偵測基因表現樣式。為了因應不同的研究領域，也需要擴展生物晶片的領域，從植入晶片上的探針不同又可以分 cDNA 晶片與寡核苷酸（oligonucleotide）晶片 [Afshari et al., 1999; Peixoto et al., 2006]。cDNA 晶片為利用反轉錄方式所產生的互補 DNA，以打點的方式植入尼龍材質的薄膜或玻璃玻片上。寡核苷酸晶片為在晶片上直接合成寡核苷酸或是將合成好的寡核苷酸植入並固定在尼龍材質的薄膜或玻璃玻片上。藉由測定樣本中不同的 mRNA 濃度，可以探討基因的表現情況，細胞製造越多的 mRNA，就有可能產生越多與之相對應的蛋白質，以基因的表現量來間接研究蛋白質的種類與數量。利用 cDNA 或寡核苷酸微陣列的研究可以同時進行兩種生物樣本的實驗和觀察很多基因的表現或抑制程度，對照組和實驗組的兩兩比較，可以在同一時間完成，主要用於腫瘤的 DNA 測序、基因表達、突變、診斷、藥物篩選和遺傳圖譜等研究 [Tamayo et al., 1999; Takeo et al., 2001; Lee et al., 2002; Hong et al., 2003; Huang and Hazlett, 2003; Taniuchi et al., 2005; Staal et al., 2006]。隨著微陣列技術的研究和應用急劇增加，日益 2.

(16) 增多的資料，處理與分析方法都值得我們討論，癌細胞在抗癌藥物的處理下的反應機制，以及哪些癌細胞能夠發生反應，哪些不能，也都是我們必須探討的問題，而微陣列的研究最終還是會朝著臨床的方向發展。. 3. DNA 微陣列的資料分析（1）微陣列的影像處理：造成微陣列分析的低再現性影響的因子很多，包含收集細胞的狀況、生物變異性、mRNA 的品質、打 spot 的狀況和雜合作用。研究者在碰到螢光的背景值或非由 cDNA 雜合作用所產生的螢光數值時，會經由校正螢光或是正規化（normalization）資料來提高正確性。背景值所造成的偏差會藉由扣除 spot 圈選以外的範圍面積所測得的螢光數值，通常這個區域的螢光背影值是會與 spot 內的面積有重疊的狀況，校正由特定螢光差異性所造成的偏差，最簡化的正規化方法是讓 Cy3 與 Cy5 訊號具有一樣的總平均強度，此方法是基於細胞狀態下大部分的基因表現樣式是不改變的。如果背景值顯著的重疊在 spot 內（spot-localized），就不能以減去背景值來做為提高 spot 準確定的方法，因為精確的微陣列掃瞄器技術不能將同一 spot 內的背景值螢光與經過雜合作用後產生的螢光分開。因此，如果有此狀況發生，就算是經過正規化的處理，這種誤差還是會存在於資料分析中 [Martinez et al., 2003]。微陣列分析正規化是平衡兩種標定螢光物質的螢光強度，主要目標是移除實驗時所產生的誤差。造成螢光數值偏差的原因包含不一樣螢光標物質標的效率、對光的敏感性與掃描器的設定。一般對於正規化方法的使用如：對於所有基因作廣泛的正規化、持續表現或無變化的管家基因（housekeeping gene）正規化及控制組（internal controls）正規化 [Quackenbush, 2002]。但是這些正規化的方法還是不夠恰當，因為螢光標的物的誤差與 spot 的密度與在微陣列上的空間為置有關 [Lee, 2002]。（2）微陣列的資料分析：cDNA 微陣列能在同一時間平行檢測大規模的基因分子資訊，並比較每個基因的調節，可以同時反映出基因調節變化途徑。在生物學上，比較基因間. 3.

(17) 的表現可以提供對於研究癌症重要的線索，微陣列分析技術可以讓收集千個以上的基因表現變成可能，許多傳統的技術仍然具有限制，因為需要大量的 mRNA 樣品來測量少數基因的表現 [Garrigues et al., 2005]。微陣列的分析中，叢集分析方法是直接比較樣本中各指標之間的性質，將性質相近的歸為一類，性質差異較大的歸為另一類，常用的分析方法有系統叢集分析（hierarchical clustering）、逐步叢集分析（k-mean clustering）、自組圖分析（self organizing maps; SOM）及主成分分析（principal component analysis）（表 1-1），其中逐步叢集分析主要是輸入 K 值後，將資料分為 K 群，但並無考慮基因間的相關性，而是基因間的距離最為分類依據。而自組圖分析，主要提供由資料中取出 N 個最明顯的基因表現樣式來執行一大量的資料的整理，因此相似的基因表現樣式在自組圖分析中會被分為同一類 [Tamayo et al, 1999]。. 二、DNA 微陣列晶片在生物醫學上之應用傳統的毒理學和分子生物學研究著重於以臨床化學或組織學觀察細胞或是組織的改變，但是 cDNA 微陣列的技術可以應用在經過毒物或是抗癌藥物（如：中草藥）處理後的細胞或是組織，並同時可觀察大量的基因表現情況，此主要以基因的表現樣式（expression pattern）結果，這包含特定的酵素活動或是特殊的訊息傳遞途徑的調控，也是特定的毒物或是中草藥的特性。微陣列的複雜性在處理過程中增加變化性，也可以提供對於藥物毒性的機制瞭解價值。此外，基因表現樣式可以正確的定義與預測特定的毒性指標（toxicity endpoint）並優先排列（lead prioritization），這可以提供非常有利的篩選工具 [Rodi et al., 1999; Pennie, 2000; Steiner and Anderson, 2000]。癌症的發生常伴隨著遺傳物質的改變，這些變化可能是經由增加致癌基因（oncogenes）或是減少腫瘤抑制基因（tumor suppressor genes）的表現，進而導致病變。基因的突變也會造成癌症的發生，這些基因上的突變可以利用寡核苷酸微陣列來偵測；而由這些病變基因造成之異常基因表現，可以利用 DNA 微陣列來分析。也有使用 DNA 微陣列分析來比. 4.

(18) 較同種細胞內兩種狀態之間的差異，此為所有蛋白質編碼基因表現樣式之間的關係 [Schena et al., 1995; Shalon et al., 1996]。對於癌症的檢測利用 DNA 微陣列來分析各種相關基因的表現，對於癌症初期篩檢，除了提供快速檢測技術外，也可以瞭解致病的遺傳因子，更能快速且正確地診斷病因，作早期的防範，且可藉由瞭解基因表現樣式的改變來推測細胞內的變化，進而找出損傷的原因 [Burczynski et al., 2000; Hong et al., 2003]。在醫學臨床的研究上，研發新藥是需要檢驗眾多生物檢體與化學合成物，微陣列晶片已成為生醫檢驗及新藥開發的方法之一 [Iizuka et al., 2003; Hara et al., 2005; Rho et al., 2005; Yang et al., 2005]。微陣列晶片應用在生物醫學方面的有微血液感測晶片，可以測量與分析血液中的各種成分 [Oh et al., 2005]，也開發出檢測癌症、地中海型貧血、乾癬性關節炎及風濕性關節炎等晶片 [Hong et al., 2003; Bang-Ce et al., 2004; Batliwalla et al., 2005; Tsubaki et al., 2005]。製藥公司為了能降低開發新藥的費用，因此在學術性質和產業界的實驗室中，努力使用 DNA 微陣列分析來研究於以藥物處理多種組織樣品後的效果分析，還有以 DNA 微陣列分析來研究特定毒性的特殊 RNA 表現樣式，並用來區別不同種類的毒物特性 [Hong, 2003]。. 三、科學中草藥的發展科學中草藥統稱來說是透過對藥材炮製、萃取的科學化品質管制，製成便於口服的劑型，改善傳統中草藥調製煎煮費時且攜帶不易的缺點，科學中草藥又稱濃縮中藥，指以科學的方法精選藥材，透過 GMP 製造流程及精密儀器的分析檢驗，經過煎煮、萃取、濃縮、噴霧及造粒等流程，再製成濃縮顆粒、錠劑及粉末等製劑，使每一批次的藥品品質完全一致。在講求健康與自然的時代裡，從天然物中研發新藥來防治人類疾病，已經成為醫藥界的主流，並以藥用植物作為醫療資源之一，德國與中國皆具有系統性的使用藥用植物，各類植物中所發現具有抗病及防癌的天然物質統稱植物化學藥品。美國於 1944 年通過營養補助品健康及教育法案（dietary supplement health and education act;. 5.

(19) DSHEA）開始引起全世界對於中草藥的注意。1950 年代已經開始研究中草藥的單一成分（表 1-2）。最早將中草藥單一成分用於癌症方面的研究，是把 Primin、Plumbagin 與 Maytenin 應用皮膚癌的治療上 [Melo et al., 1974]。1990 年代分生技術發展成熟，中草藥除了用於抑制癌細胞生長外，並探討基因表現的機制；藥物對於癌細胞的處理，追求緩和且不傷害正常細胞的方式進行 [Yang et al., 1996]。美國食品藥物管理局（FDA）在 1997 年公布植物性產品規範草案（guidance on botanical products），首次將植物性藥品納入管理，也讓製藥界開始重視中草藥，很多生技公司（例如：順天堂藥廠與中天生技公司）開發中草藥的產品目標是通過 FDA 的認證而可以讓產品流通性更國際化。銀杏是最普及的單味藥，全世界的銀杏品種將近 10 種，德國人用十幾年的時間找出穩定且療效最好的銀杏葉品種，開發穩定的製藥品質與過程 [DeFeudis et al., 2003]，而德國政府核准的標準銀杏萃出物為 GBE 761，證實可治療阿茲海默疾病 [Kanowski et al., 1996]，並由銀杏所含的三百多種化學成分中，確立出主要的活性成分為黃酮類與 terpenes [Le Bars and Kastelan, 2000]。2000 年代微陣列晶片技術發展成熟，並應用在作為篩選中草藥所誘發產生表現的基因 [Lee et al., 2002]。. 四、中草藥在抗腫瘤與抗癌之研究近況 1. 應用於抗腫瘤與抗癌研究之中草藥許多國家廣泛的使用中草藥來治療疾病，其中包含腫瘤與癌症，許多民間使用傳說中可以抗癌的草藥萃出物的正確性已經被證實，包含冬蟲夏草（Cordyceps sinensis Sacc.）、白芍（Paeoniae Radix）、防風（Saposhnikovia divaricata）、金線蓮（Anoectochilus formosanus）、刺五加葉（Acanthopanax senticosus）、紅豆杉（Taxus mairei）、洛神花（Hibiscus sabdariffa）、粉防己（Stephania tetrandra S. Moore）、茯苓（Poria cocos Wolf）、柴胡（Radix Bupleuri）、紫蘇（Perilla frutescens）、黃耆（Astragali Radix）、銀杏（Ginkgo biloba）、霍香（Agastache rugosa）及靈芝（Ganoderma lucidum） 6.

(20) （表 1-3）。冬蟲夏草屬於滋補藥草，含有豐富的蟲草素、核酸、游離脂肪酸、甘露醣醇、蛋白質，可以治療肝炎與心臟病，強化免疫系統，具有抗氧化功能可以抗衰老 [Yoshida et al., 1989; Zhu et al., 1998.]。白芍是中國傳統的中草藥毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pallas）乾燥根，在中國與日本被廣泛用來治療肝臟疾病的傳統藥方，早期的研究指出白芍可以抑制由化學藥品（可造成多種氧化性 DNA 損傷）所誘發的氧化性 DNA 分裂，所以白芍不只具有抗癌的功效，還是抗衰老與抗致癌作用的藥物，白芍的萃出物可以經由血管內皮依賴性血管擴張（endothelium-dependent vasodilator）的影響，改善主動脈的血流量並且抑制血拴形成與血小版凝集 [Goto et al., 1996]。此外白芍水萃出物可以抑制 HepG2 與 Hep3B 細胞株的生長，由白芍萃出物所誘發的細胞凋亡作用主要是以 p53 的途徑發生，經過 cDNA 微陣列分析與 RT-PCR 的實驗證實，可能是改變了 BNIP3、ZK1、RAD23 及 HSPD1 基因表現 [Lee et al., 2002]。防風乾燥的根部為亞洲天然的中草藥，主要當成發汗劑、止痛劑及退熱劑來使用，應用於治療一般的感冒、頭痛及關節痛，防風含有揮發油及有機酸等成分，有明顯的免疫增生及抗過敏的作用。由防風萃取的歐前胡素（imperatorin）與 1-甲基苯乙妥因（deltoin）可抑制 NO 的產生，而避免 NO 對人體所產生的傷害 [Wang et al., 1999]。金線蓮為珍貴的民間用藥，墨綠色葉面成嵌著金線脈紋，金線之名因此而得。全草味甘性涼且清熱退火，可降低膽固醇、防止血壓上升及強化肝臟機能，所含的 plumbagin 成分，可誘發乳腺癌細胞 MCF-7 產生細胞凋亡作用 [Yang et al., 2004]。刺五加葉為一種傳統的天然草藥，作為補藥與抗風濕病，主要應用在慢性支氣管炎、高血壓、抗緊迫及缺血性心臟病 [Nishibe et al., 1990; Fujikawa et al., 1996]。肥大細胞（mast cells）合成與分泌化學性的傳遞物在過敏性反應中扮演重要的角色，而刺五加可以抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α; TNF-α）所產生肥大細胞依賴性的發炎反應 [Yi et al., 2001]；但可以增加肺癌病人血液中 TNF-α 的活性，來抵抗癌細胞 [Huang et al., 2005]；由刺五加葉中所分離的 glycoprotein 可降低經酒精對於肝臟細胞所造成的肝毒傷害，並增加抗氧化酶的活性 [Choi et al., 2006]。紅豆杉又稱紫杉，所含紫杉鹼（taxine）有抗腫瘤活性及細胞毒性，紅豆杉所含的 taxumairol A 可抑制人類腫瘤細胞株 KB-16、A-549 及 HT-29 生長 [Shen 7.

(21) et al., 1996]。而 taxumairols U 與 taxumairols V 可抑制人類肝腫瘤細胞的生長 [Shen et al., 2001]。洛神花常用於解熱與平衡身體的酸鹼值，成分中的 Hibiscus protocatechuic acid、花青素及多酚類萃出物，可抑制小鼠的皮膚腫瘤與人類 HL-60 細胞的生長，並具有抗氧化作用 [Tseng et al, 1998; Tseng et al., 2000]；誘發人類胃癌細胞進行細胞凋亡 [Lin et al., 2005]。粉防己的根被當作中國的草藥來治療關節炎（arthritis）、矽肺病（silicosis）與高血壓已經有數十年了，粉防己鹼（tetrandrine）為雙苄基異喹啉類生物鹼（bisbenzylisoquinoline alkaloid），主要從粉防己根部萃取出來，已經被證實可以抑制人類 HeLa 細胞的分化 [Teh et al., 1991]，且可以抑制小鼠的腹水腫瘤 [Kuroda et al., 1976]，還可以誘發人類白血病 U937 細胞的凋亡 [Lai et al., 1998]，除此之外，粉防己鹼（tetrandrine）還可以抑制人類肝癌細胞株 HepG2 細胞的生長，誘發產生細胞凋亡的作用 [Yoo et al., 2002]。茯苓含有多醣體、Pachymic acid、3-O-acetyl-16 alpha-hydroxytrametenolic acid、poricoic acid B 與 beta-glucan PCM3-II 可以抑制小鼠的腫瘤 [Kanayama et al., 1986]，抑制皮膚腫瘤與免疫反應 [Kaminaga et al., 1996]，抑制人類乳癌細胞株 MCF-7 生長並誘發細胞凋亡作用 [Zhang et al., 2006]。柴胡含有皂素、RBIaii、Bupleurum scorzonerifolium 與 KY88，可以抑制小鼠肉瘤生長 [Haranaka et al., 1985; Kok et al., 1995; Chow et al., 2004]，對人類肺癌細胞株 A549 與肝癌細胞株（HB8064）具有抑制增殖與誘發產生凋亡作用 [Cheng et al., 2003; Hsu et al., 2004]。紫蘇含有 Nelignans、luteolinu、Rosmarinic acid 及 triterpene acids，對於 mocrophage 細胞株 RAW 264.7 與皮膚腫瘤有抑制生長的效果 [Ryu et al., 2002; Ueda et al., 2002; Ueda et al., 2003]；並可降低受到 aflatoxin B1 或 ochratoxin A 處理 HepG2 細胞後，所導致的傷害 [Osakabe et al., 2002; Renzulli et al., 2004; Osakabe et al., 2004]。黃耆有利尿、降壓、抗腎炎的作用，含有 juzentaihoto 成分，可以抗腫瘤 [Aburada et al., 1983]，並抑制膀胱癌 [Kurashige et al., 1999] 與胃癌細胞 [Lin et al., 2003] 生長。銀杏含有黃酮類、terpenoid、flavonol glycosides 與 terpene lactones，具有抗氧化能力 [Dubey et al., 2004]，也可抑制乳癌細胞、神經膠質瘤及肝癌細胞株的增殖 [DeFeudis et al., 2003; Pretner et al., 2006]。霍香屬於唇形花科（Labiatae）含有多種 8.

(22) 黃酮類（flavonoids）與主要成分椴寧（tilianin），可以抑制由 TNF-K 所誘發的 VCAM-1 基因表現。動脈硬化為一種慢性發炎疾病，在動脈粥樣硬化的病理生理學上，腫瘤壞死因子所誘發 VCAM-1 表現為早期的症狀，研究指出霍香可以抑制腫瘤壞死因子所誘發 VCAM-1 的表現 [Hong et al., 2001]。靈芝富含維他命、纖維與氨基酸，,可以活化多醣體促進人體免疫功能 [Sliva, 2004; Yuen and Gohel, 2005]，除了靈芝本身所含的 triterpene 可以抑制人類肝癌細胞株 Huh-7 的生長 [Lin et al., 2003]，在乳癌與前列腺癌細胞中，也可抑制細胞附著與轉移 [Sliva, 2003]。此外補中益氣湯（Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang; BZYQT）為中國傳統的複方中草藥，可抑制人類肝癌細胞株（Hep3B、HepG2 及 HA22T）的生長，在中國已經使用於多種癌症的治療，體內與體外試驗指出補中益氣湯可以抑制肝癌後期病人癌細胞的蔓延，經細胞週期與 DNA 片段分析，可以抑制肝癌細胞的生長，細胞週期停滯於 G0/G1 期的現象，並抑制 DNA 合成並誘發細胞凋亡作用。肝細胞的死亡與多種肝臟失調疾病與肝臟功能退化有密切的關係 [Kao et al., 2001]。. 2. 中草藥與肝癌研究的結合（1）肝癌簡介：近幾年來惡性腫瘤以高居我國十大死亡原因之首，其中以肝腫瘤佔國人惡性腫瘤死亡的最主要病症，行政院衛生署（http://www.doh.gov.tw）統計民國九十三年台灣地區主要死亡原因，肝癌為第二大死亡原因，死亡人數超過萬人，其中在女性致死的惡性疾病中排名第二，在男性則高居第一，肝癌通常指原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma; HCC），也被簡稱作肝癌（Heptoma），是最為常見的肝癌種類，在成人肝癌中約佔 80-90％，肝細胞癌源自肝細胞中一個或少量的肝細胞惡性變化產生的腫瘤，通常發生在肝臟因硬化而受損的人身上，肝癌為世界上常見的惡性腫瘤之一，也為常見具致命性的癌症 [Wanebo and Vezeridis, 1993]。肝癌為一種實質性的惡性腫瘤，在初期並無特殊的徵兆，當患者摸到有硬塊時，通常已經進入病程的晚期了，. 9.

(23) 目前，臨床上對於肝癌的治療仍以手術為主，但病人復發率約有 40％，因此，侵入式的治療方式仍無法很有效的對抗此一疾病，在全球很多地區，包含東亞與南非，在肝臟實質（parenchyma）中，因為轉移、肝硬化及其他病理上的改變，經過外科手術引起的反應仍然具有相當大的挑戰以及治療上的問題，所以建立更有效的治療方法來降低因為肝癌所引發的死亡是非常重要的 [Kennedy et al., 2004]。（2）應用中草藥治療肝癌：對於肝癌的治療分為化學藥物的治療以及天然藥物的治療，在化學藥物的治療上亦面臨了瓶頸，肝癌對於現行使用的抗癌藥物其敏感性都不高，癌症用藥多是以造成細胞壞死的途徑來殺死癌細胞，結果亦會使正常的細胞大量死亡，導致病患在治療的過程中，身體面臨極大的挑戰。為了尋求一個有效且安全的治療藥物，許多研究著手於天然藥物的研究，如：可以誘發 HepG2 細胞進行細胞凋亡的木犀草素（Luteolin，為一種天然的黃酮類）[Ko et al., 2005]、去氫駱駝蓬鹼（Harmine）由駱駝蓬（Peganum harmala）萃取出來，應用在抗癌治療上 [Chen et al., 2005]。由天然植物中純化有效的抗癌化合物，並結合日前臨床上所用的抗癌藥物來治療病患，降低抗癌藥物劑量，已減少副作用，又能達到有效的抗癌作用，但部分成果仍屬初步研究，尤其在機轉的建立上，仍有許多未知。人類肝癌細胞株 HepG2 細胞常被當作酒精 [Neuman et al., 1993; Neuman et al., 1995; Harries et al., 2001] 與四氯化碳（carbon tetrachloride; CCl4）[Dai and Cederbaum, 1995; Harries et al., 2001] 誘發肝臟受損研究的良好模式，除此之外也廣被應用於細胞毒性測試 [Guillouzo, 1998; Hong, 2003]，所以被選用來作本次論文上的研究，因為 HepG2 細胞具有正常肝細胞的表型與基因特性但不帶有病毒感染性，所以常被拿來作為體外的實驗系統 [Sassa et al., 1987]。另外 HepG2 細胞可以表現很多正常人類肝臟功能，如：cytochrome P450-dependent mixed function oxidase（MFO）的反應進行 [Limbosch, 1983; Dawson et al., 1985; Darlington et al., 1987] 與 glucuronic acid 的結合反應 [Diamond et al, 1980; Neuman et al., 1995; Shear et al., 1995]，因此 HepG2 細胞時常被用來作為肝癌或是肝功能上的研究。（3）抗腫瘤與抗癌的方法之一誘發細胞死亡：細胞死亡主要的機制可分細胞壞死和細 10.

(24) 胞凋亡兩種。細胞壞死（necrosis）：主要發生於一群相鄰的細胞，通常是較嚴重的物理化學傷害所造成，主要是伴隨 ATP 耗盡，細胞通透性發生改變而使細胞膨脹或破裂，使細胞內的胞器釋出，並造成溶體（lysosome）釋放出各種分解酵素和細胞激素（cytokines）等物質，而使週遭組織受傷引起發炎反應 [Wyllie, 1980; Eguchi et al., 1997; Leist et al., 1997]。細胞凋亡（apoptosis; programmed cell death）為細胞在正常發展上必要的一個生理過程（圖 1-1），主要功效是維持組織生理的平衡與參與免疫防禦系統，在癌症的預防與治療的過程中，細胞凋亡為重要的因子，主要發生在單一細胞，通常伴隨細胞皺縮、細胞核濃縮、細胞膜翻轉、核小體連接部位上 DNA 的斷裂（internucleosomal DNA cleavage）及細胞質芽胞中含有未損壞的胞器，最後細胞分解成許多具有完整細胞膜的凋亡小體，因為凋亡小體的細胞膜仍完整，所以含有細胞分解後有毒物質並不會釋放出細胞外，因此周圍的組織可以避免發炎和傷害。[Wyllie, 1980; Radford, 1986; Wood and Youle, 1994; Fadok et al., 1992; Liu et al., 1996; Nagata, 1997]。但在細胞發生凋亡的而造成細胞形態學改變以前，粒線體即發生某些功能改變（例如活性氧產生增多與膜電位下降），所以粒線體可能參與了細胞凋亡的啟動和調節。而已有研究指出粒線體釋放的 cytochrome C 是誘導細胞凋亡的重要信號分子 [Liu et al., 1996]。Cytochrome C 從粒線體釋放而進入細胞質後，在 dATP 存在的狀況下與 Apaf-1 結合並啟動 Caspase-9，再啟動 Caspase-3 而導致細胞凋亡的發生 [Zou et al., 1997]。在細胞形態與組織病理學上比較細胞凋亡與細胞壞死的不同。細胞凋亡經常由接受器-調節訊號（receptor-regulatory signal）所引發，如：荷爾蒙、細胞激素與生長因子 [Bursch et al., 1994; Chisari, 1995; Hayashi, 1998]。雖然細胞凋亡最初認為是一種正常細胞生理上的死亡現象，但在病理上也和病毒引起的慢性肝炎與猛爆性肝炎所造成的細胞死亡有關。藉由細胞凋亡來抗腫瘤，並應用在慢性肝炎與肝癌的治療，已經在動物模式與臨床治療上被證實 [Kerr, 1965; Kerr et al., 1972]。應用於肝細胞與肝癌細胞上，細胞凋亡的誘發物質已被研究出來的有醋酸環丙孕酮（cyproterone acetate）[Bursch et. 11.

(25) al., 1984]、二甲基亞硝胺（dimethynitrosamine）[Pritchard and Butler, 1989]、轉化生長因子（transforming growth factor; TGF）[Lin and Chou, 1992]、環己烯胺（cycloheximide）[Ledda-Columbano et al, 1992] 及 7H-二苯甲（c,g）亞氨基二亞苯（7H-Dibenzol[c,g]carbazole; DBC）[O’Brien et al., 2000]。許多研究證實細胞凋亡與細胞壞死的發生和起始細胞密度與最初藥物處理的濃度有密切相關 [Bonfoco et al., 1995; Yeung et al., 1999]。肝細胞的死亡與許多肝功能障礙與肝功能退化的發病機制有關 [Kerr et al., 1972; Kerr et al., 1994; Hayashi, 1998]。細胞凋亡為一個高度調節且需依賴能量來去除組織多餘或受損的細胞。漿膜為一個明顯且容易受傷的部位，當功能或是結構改變危及到漿膜的生理機能可以導致細胞死亡。大量的文獻研究漿膜的改變與許多可能會危及細胞完整性的關鍵變化中，而導致 Ca2+流入有關 [McConkey et al., 1989; Xu et al., 2001]。因此，在 Ca2+調控的過程中，會發生染色質的核小體上 DNA 的斷裂與細胞核蛋白的片段化 [Santella and Carafoli, 1997]。細胞內的鈣增加時，導致膜的變化也許與一般對於許多種細胞的死亡所接受的假說有牽連 [Kanduc et al., 2002]。發生在淋巴細胞或是其他細胞（如：肝細胞）所導致的細胞死亡中，蛋白質的抑制或 RNA 的合成作用為不可或缺的事情。在細胞凋亡過程中，細胞核與其內的 DNA 是重要的研究領域。並非所有 DNA 結合的複合物皆會誘發細胞死亡的產生，反而是蛋白質合成的抑制物（例如 cycloheximide）或 RNA 合成抑制物（例如 actinomycin D）才會誘發大規模的細胞凋亡現象 [Martin et al., 1990]。這些 TRADD、FADD/MORT、RIP、FLICE/MACH 及 TRAFs 基因與 TNF 接受器中 p60 與 p80 結構有關，另外也和 TNF 接受器 superfamily 有關 [Darnay and Aggarwal, 1997; Heyninck and Beyaert, 2001]。TNF 接受器相關因子和死亡區同系物為兩種不同家族的蛋白質。前致死基因包含 p53、ced-3/ICE proteases 及 Bax 家族，抗致死基因包括 ced-9/Bcl-2 及腺病毒蛋白質 EIB [Bromme and Holtz, 1996; Trump et al., 1997; Strater and Moller, 2000]。. 12.

(26) 五、DNA 微陣列於中草藥研發上的運用基因微陣列晶片於 1990 年代發明，利用 cDNA 微陣列可以同時觀察很多基因的表現或抑制程度，除了用於偵測腫瘤 DNA 測序、基因突變、藥物篩選和遺傳圖譜的研究外。2000 年代初微陣列技術發展成熟，應用 DNA 微陣列在中草藥的研發，已是新的趨勢；癌細胞在中藥物的處理下的反應機制，以及哪些癌細胞能夠發生反應，哪些不能，也都是我們都可以迅速的從微陣列結果中作大範圍基因研究。科學中草藥裡，白芍、石斛（Herba Dendrobii）、金線蓮、牡丹皮（Moutan Cortex Radicis）、養肝丸（Yan-gan-wan）及黃連（Coptidis rhizome）的研究，已經被應用在 DNA 微陣列層面（表 1-4），含有數百個凋亡基因的 DNA 微陣列，被應用在篩選經白芍處理後的 HepG2 細胞所誘發的基因表現 [Lee et al., 2002]。含有 16 種石斛屬 ITS1-5.8S-ITS2 序列的微陣列晶片，鑑別不同石斛物種 (Dendrobium species) [Zhang et al., 2003]。應用 9,600 基因的 DNA 微陣列偵測金線蓮在乳腺癌細胞 MCF-7 的基因表現，並發現金線蓮可以誘發 caspase 8 與 cytochrome c 基因高表現 [Yang et al., 2004]。牡丹皮可以減緩 PC12 細胞經過氧化氫處理後的傷害，經 DNA 微陣列偵測後，發現 HO 與 COMT 基因具有高表現量 [Rho et al., 2005]。養肝丸可以治療經 CCl4 誘發肝臟病變的小鼠，由 DNA 微陣列分析後，發現養肝丸可以抑制 CYP4A10 與 CYP4A14 基因在肝臟的表現 [Yang et al., 2005]。應用低密度的微陣列晶片，偵測以黃連處理的乳癌細胞株 MCF-7 與 MDA-MB-231，分析後發現增加 IFN-β 與 TNF-α 基因表現樣式 [Kang et al., 2005]。DNA 微陣列晶片在中草藥功能評估上，可以將體外試驗中經初步篩選具抗癌作用之中草藥萃出物用以處理癌細胞，再利用晶片檢測癌細胞中基因表現的變化，最後經由基因表現的結果來判讀中草藥療效的潛能與可能發生效能的轉機。. 13.

(27) 貳、材料與方法. 一、中草藥水萃出物製備方法由中藥房購得六種中草藥，分別為霍香（Agastaches rugosa）、紫蘇（Perilla frutescens）、防風（Saposhnikoviae divaricatae）、七層塔（Salvia Plebeia R. Brown）、刺五加葉（Acanthopanax Senticosus L.）及石蓮花（Echeveria elegans）。以上述六種中草藥個別用於萃取。個別秤取中草藥 50 公克浸泡於 1 L MQH2O 中，加熱至 100℃ 持續熬煮 1 小時，用抽氣過濾裝置過濾後，分別收集中草藥水萃出物之濾液，再經 5,000 rpm 離心 10 分鐘，取水溶液以冷凍乾燥機將其分別製成中草藥水萃出物粉末，放置保存於乾燥箱中保存備用。中草藥水萃出物的配製，秤取中草藥粉末 0.1 公克溶解於 10 mL 磷酸緩衝液（phosphate buffered saline; PBS, pH 7.4），經 0.22 m Millipore filter 過濾後，儲放於-20℃冰箱，使用前預熱至室溫。. 二、細胞培養與處理方法人類肝癌細胞株HepG2（ATCC CRL-10741; FIRDI, Hsinchu, Taiwan），以含有10% fetal bovine serum（FBS）、2 mM L-glutamine、Earle’s BSS adjusted to contain 1.5 g/L sodium bicarbonate、0.1 mM non-essential amino acids、1.0 mM sodium pyruvate、 100 units/mL of penicillin 及 100 g/mL of streptomycin 的Minimum Essential Medium（MEM）細胞培養液（pH 7.4）於37℃含有5% CO2的培養箱中培養。當細胞生長的密度約80-90%滿時，進行繼代培養，移除細胞液，以5 mL DPBS浸洗，再以0.5% trypsin–EDTA溶液使細胞游離，以1,000 rpm室溫離心5分鐘後，移除懸浮液，細胞以MEM細胞培養液重新懸浮，逢機取少量細胞液以 trypan blue 染色，使用 14.

(28) 血球計數器計算細胞數量，再取適量的細胞數至培養皿繼續培養，隔夜培養讓細胞可以修復及黏貼於培養皿表面，更換MEM細胞陪養液，以進行以下實驗。. 三、細胞存活率測試（MTT cytotoxicity assay） 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5 diphenyl tetrazolium bromide（MTT）分析法為一種簡單且非放射性的快速呈色法 [Mossman, 1983]，主要應用在96-well細胞陪養盤，其原理主要依靠粒線體中琥珀酸去氫酵素（succinate dehydrogenase）的作用將MTT 的tetrazolium環還原為formazan，反應過程中，水溶性的黃色MTT會轉變為藍紫色的 formazan結晶，MTT形成formazan的結晶僅在存活細胞中進行，且formazan形成量與細胞存活的數目呈正比，所以常被用來測定細胞的存活率，利用DMSO可以將formazan 結晶溶出，並於550 nm波長下測定吸光值即可分析細胞存活率 [Hansen et. al., 1989]。以PBS溶解15 mg/mL MTT，再經0.22 m Millipore filter過濾後，儲存於-20℃冰箱備用。首先將HepG2細胞（1 x 104 cells/well）培養於96-well細胞陪養盤中（100 L MEM 細胞培養液中含有10% FBS）12小時，以100 L/well PBS浸洗細胞後，加入含有中草藥水萃出物與10% FBS的MEM細胞培養液，放入37℃培養箱處理72小時後，加入10 L/well MTT（lot 66H5033; Sigma, Saint Louis, MO）；於37℃且含有5% 的CO2培養箱培養4小時後，以PBS浸洗細胞後，加入100 L/well DMSO溶解藍紫色formazan結晶（加入DMSO後1小時內測定吸光值），於室溫震搖30分鐘後，以免疫酵素分析儀（Microplate Reader; BIO-RAD Model 3550）讀取波長550 nm下之吸光值。. 四、RNA製備 1. RNA萃取：HepG2細胞經過中草藥水萃出物處理後，為了修復其所受的損傷，會有許多基因開始轉錄、轉譯蛋白質來進行修復，要觀察基因表現可以從細胞的mRNA量來 15.

(29) 判定，要抽取細胞的mRNA首先要把細胞內的total RNA抽取出來。以不同的中草藥水萃出物處理HepG2細胞72小時後，以5 mL PBS浸洗細胞兩次，每盤細胞加入1 mL TriSoltion Reagent（Cat No.TS100-plus; Gene Mark, Taipei, Taiwan）把細胞溶解，並把溶液轉移至1.5 mL離心管，接著加入0.2 mL氯仿並充分混合，靜置室溫5分鐘，以4℃、 12,000 x g離心15分鐘，藉由氯仿與TriSoltion Reagent中的苯酚使溶液中的蛋白質、 DNA與RNA分層（依序為有機層、中間層與水層），將上清液抽取至新的離心管中，並加入等量體積的異丙醇，靜置室溫10分鐘，以4℃、12,000 x g離心10分鐘，移除上清液，加入1 mL 75％酒精進行酒精沉降法，以4℃、12,000 x g離心5分鐘，移除上清液，將沉澱物抽乾後，加入50 L DEPC H2O (diethylpyrocarbonate, RNase-free water)，保存於-80℃冰箱備用。. 2. RNA 電泳膠的製備與電泳：秤取 1 公克的洋菜膠（agarose）粉末，置入含有 72.4 mL 的 MQH2O 與 10 mL 的 10 X MAE（0.4 M MOPS、1 M CH3COONa 及 0.01 M EDTA）溶液中，混和均勻後，加熱使其完全溶解，待冷卻至約 60℃時，加入 17.6 mL 甲醛混和均勻後倒入模型中。取 10 μL RNA 樣品加入 10 μL denature buffer（含有 1 μL 10 X MAE、2μL 甲醛及 7 μL 甲醯胺）混和均勻後，置於 65℃乾浴槽 10 分鐘，加入 2 μL loading buffer（含有 50% glycerol、1 μM EDTA、0.4％ bromophenol blue 及 0.4％ xylene cyanol），再進行 80V 電泳 1.5 小時（電泳溶液為 1 X MAE）後，將膠體置於 0.02％ ethidium bromide 溶液中染色 5 分鐘，再浸置於 MQH2O 中並輕微搖擺震盪至膠體中多餘的 ethidum bromide 去除為止，並經膠體置於 UV 燈箱上照相分析。. 3. RNA Cleanup：以 RNeasy Mini Protocol for RNA Cleanup kit（cat. No.74104; Qiagen, Valencia, CA）進行 RNA Cleanup，將 Total RNA 以 DEPC H2O 稀釋體積至 100 μL，加入 350 μL Buffer RLT 與 250 μL 100% ethanol 充分混合，將混合液移至組. 16.

(30) 裝好 2 mL collection tube 的 RNeasy mini column 中，以 11,000 rpm 離心 15 秒，移除下層液，加入 0.5 mL Buffer RPE 潤洗 column 中的 RNeasy silica-gel membrane，以 11,000 rpm 離心 2 分鐘，重複潤洗兩次後，將 column 移至新的 2 mL collection tube 以 11,000 rpm 離心 1 分鐘，於 column 中直接加入 30 μL DEPC H2O 於 RNeasy silica-gel membrane 上，靜置室溫 30 分鐘後，column 移至新的 1.5 mL 離心管，以 11,000 rpm 離心 2 分鐘，將收集 RNA 儲放於-80℃冰箱備用。. 五、cDNA 微陣列分析主要的實驗流程（圖 2-1）為由經中草藥與 PBS 處理後的 HepG2 細胞中萃取 RNA 後，在進行 RT-PCR 中標的上 Cy3 或 Cy5 螢光物質，再與 cDNA 微陣列作雜合作用，以 GenePix 掃描器由晶片上擷取資料後，使用 Cluster 3.0 作資料的分析。. 1. 晶片前處理：將含有 7,680 個 spots 的人類 cDNA slides（UniversoChip 8K-1; AsiaBioinnovations Co., Newark, CA）面朝下的放置在含有 1 X SSC 溶液與飽和水蒸氣的恆溼槽（humid chamber）中約 5-15 分鐘直到晶片上的 spots 飽和，迅速將 slides 放置在加熱板（70~80℃）2-3 秒使水氣蒸發，放入 Stratalinker 中，接著將 slides 上的 cDNA spots 以 65 mJ UV 光照射，slides 放入 slide rack 以 0.2% SDS 溶液慢速震盪 10 分鐘，再置於 2 L ddH2O 上下浸洗 10 次後，放入 95℃ ddH2O 中 2 分鐘，快速將 slides 拿起放入 100% ethanol 慢速震盪 5 分鐘，以 1,000 rpm 離心 5 分鐘，將 slides 快速放入保存盒中，放入乾燥箱中備用。. 2. cDNA 螢光探針製作（以 Cy3 或 Cy5 標的 cDNA targets）：HepG2 細胞經過 PBS 與不同中草藥水萃出物處理 72 小時後，抽出 total RNAs，以 Cy3 標的對照組 RNAs（HepG2 17.

(31) 細胞以 PBS 處理），而以 Cy5 標的實驗組 RNAs（HepG2 細胞以不同中草藥處理）。Cy3 與 Cy5（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）為螢光標的物，所有的反應需要在避光的環境下進行。取 30 g RNA，加入 1 L Oligo-dT（1g/L）以 DEPC H2O 補充體積至 15 L，混合液放置於 70℃處理 10 分鐘後，迅速放在冰上，再加入 1 L dNTP 混合液（含有 10 mM dATP, 10 mM dCTP,10 mM dGTP 及 8.5 mM dTTP）、6 L 5 X first-strand buffer （250 mM Tris-HCL: pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2）、3 L 0.1M DTT（0.1 M）、 2 L Superscript II（200 U/L; partNo53030; Invitrogen, Carlsbad, CA）與 3 L 的 Cy3-dUTP 或 Cy 5-dUTP（1 mM）均勻混合後，放置 42℃作用 3 小時。作用完成後置於冰上 10 分鐘，加入 15 L 0.1 N NaOH 及 2 mM EDTA 的混合液，並於 65℃作用 30 分鐘後，迅速置於冰上 5 分鐘，再加入 15 L 0.1 N HCl，將標的好的 ss-cDNA （single-stranded cDNAs）以 PCR purification kit（Qiagen, Hilden, Germany）純化，步驟包含將標的好的 ss cDNA 緩緩加入 320 L buffer PB 中，再將混合液移至組裝好 2 mL collection tube 的 RNeasy mini column 中，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘後，加入 600 L wash buffer PE，以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，直接加入 30 L Buffer EB（10mM Tris-Cl, pH 8.5）潤洗 column 中的 RNeasy silica-gel membrane，再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，收集含有標的螢光的 ss cDNA 探針濾液。測量波長 260 nm 下標的好的 ss cDNA 體積，並以波長 550 nm（Cy3）及波長 650 nm（Cy5）下檢測螢光強度。. 3. cDNA 微陣列雜合作用：將 30 L 標的螢光的 ss cDNA 探針中，依序加入 6 L 20 X SSC、0.5 L 10% SDS 及 6 L 含有 20 g Cot1 human DNA（10 g/L, Cat No.15279-011; Invitrogen）、20 g polyA RNA（10 g /L, No.P9403; Sigma）及 20 g tRNA（10 g/L; No.15401-011, Gibco-BRL）的混合液。將探針以 100℃加熱 2 分鐘後，迅速置於冰上，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，小心吸取標的螢光的 ss cDNA 探針於含有 cDNA 的微陣列玻片上，緩慢小心蓋上 24 mm × 50 mm 蓋玻片（避免氣泡產生）， 18.

(32) 放置玻片於可維持濕度的 slide chamber 中，放置 60℃水浴槽 16 小時，進行 cDNA 微陣列雜合作用。經過 16 小時的 cDNA 微陣列雜合作用，首先將微陣列玻片快速輕放入裝有 400 mL 60℃的 2 X SSC 與 0.03% SDS 混合液的染缸中，使蓋玻片輕輕滑落，將 slides 以 rack 固定，置入 400 mL 的 2 X SSC 與 0.03% SDS 混合液，以室溫震盪清洗 10 分鐘，400 mL 1 X SSC 溶液震盪清洗 5 分鐘，400 mL 0.2 X SSC 溶液震盪清洗 5 分鐘，400 mL 0.1 X SSC 溶液震盪清洗 5 分鐘後，以 1,000 rpm 離心 5 分鐘去除 slide 上的水分。. 4. cDNA 微陣列的掃瞄：經過雜合作用的 cDNA 微陣列以 GenePix 4,000A 掃描器（Axon Instruments Inc., Foster City, CA）掃瞄，使用的激發波長為 635 nm（Cy5）與 532 nm （Cy3）兩種波段的雷射，經由光電倍增管（photo multiplier tubes; PMT）轉換為高解析度（10 micron pixel）的影像，調整波長 635 nm 與 532 nm 的光電倍增管的強度（100 to 1,000 V），來平衡 Cy5 與 Cy3 這兩種不同螢光染劑的強度，並對於傳統灰階（tagged image file format; TIFF）的影像檔限制飽和度，從 cDNA 微陣列上擷取的影像以含有完整的自動影像處理系統 Axon GenPix Pro-4.0 軟體（Axon Instruments Inc.）分析，可以作快速的影像分析並將影像轉換成一整批的數據模式，主要的特性包含 spots 的尋找與定位、估計干擾訊號及縮小資料在操作過程中的失誤，在資料分析中，每一 spot 的原始訊號會減去背景值，軟體在訊號太弱的數值也會標上‘‘Flag’’，正規化 Cy5 與 Cy3，並將 Cy5/Cy3 的數值與全部微陣列資料作比較。. 5. 群集分析（cluster analysis）：由 Eisen 實驗室（http://www.genome.wi.mit.edu）開發的 cluster 3.0 程式為一個具有區分性、凝聚性、多重選擇性的群集（clustering）分析方法，主要應用在分析微陣列中基因的表現。此程式在每一個微陣列實驗中，提供正規化每一基因的數值，主要是使用晶片上所有基因數值平均值的比值作為正規化的標 19.

(33) 準並過濾資料。由每一實驗組中平均這些數值，並估計同樣基因的數值平均，在特定的狀況下會有些表現相關的基因具有再現性。全部基因的表現量經過與基準數值比較後，作有意義的調整，篩選後的比值再利用 log2 的轉換來量化基因的表現。平均聯結（average linkage）的系統叢集分析可以進行組織基因表現的資料。2D Cluster analysis 的方法 [Alon et al., 1999; Lee, 2002] 不只可以組織每一基因間的關連性，作基因間的重新排列，也可對於每一微陣列間的基因表現數值作分析。基因表現樣式的數值經過由 Eisen 實驗室所提供的 TreeView 軟體（http://www.genome.wi.mit.edu）分析後，可以把比較不同基因間表現量的相關性以樹狀圖表示。自組圖分析（self-organizing maps; SOMs）主要是以含有相同資料數的參考向量為主，作一個連續的分割，被分割的部分在一個預設變數的幾何學結構（geometrical configuration）中，例如二維網格（two-dimensional grid）。分配基因到被分割的部分，主要是隨機挑選基因，再放入對於基因表現趨勢最相關的參考向量中。最後，基因由最相似的基於參考來被放置到適合的分割部分 [Sherlock, 2000; Lee, 2002]。自組圖分析法為數學上 Cluster analysis 的一種，尤其適合將多方面資料分類，以及辨識具複雜獨特性的資料。逐步叢集分析（k-means clustering）與自組圖分析方法相似，主要是將參考向量（reference vectors）分為數個部分，但每一部份並不互相直接影響。使用逐步叢集分析與自組圖分析方法可以更能組織每一個叢集作系統叢集分析。Cluster 3.0 程式可以執行計算分析使資料具體化，此軟體著重在樣式的表現高於基因表現的絕對數值。. 六、Annexin V-FITC 螢光染色經由凋亡途徑而走向死亡一途的細胞，因過程中會將細胞膜內帶負價的磷脂質翻轉於細胞膜外，Annexin V（分子量 35~36 KD）為一種二價鈣離子依賴性磷脂質結合蛋白，屬於近幾年發現的 annexins 蛋白質家族，含有抗凝血的特質，對於帶負價的磷脂質（例如 phosphatridylserine ）具有高結合力的鍵結，但對於 phosphatidylcholine 與. 20.

(34) sphingomyeline 為低親和性，所以可以用來偵測凋亡的細胞。 Annexin V 經由 FITC 螢光的標定，再以流式細胞儀分析每顆細胞的狀態，可以對產生細胞凋亡作用的細胞作定量與定義。以 FITC-Annexin V（綠色螢光）與 propidium iodide（紅色螢光）同時染細胞可以區分出未受損的活細胞（FITC-/PI-）、細胞凋亡早期細胞（FITC+/PI-）及細胞凋亡晚期或細胞壞死的細胞（FITC+/PI+）。而實驗中使用的 Partec CyFlow（CyFlow® SL, Peak Technology Co. Ltd., Münster, Germany）細胞流式儀具有 FL1（525nm）、FL2（575nm）與 FL3（630nm），參考使用的螢光標的物 PI 的 excitation wave（342nm, 495nm）與 emisson wave（639nm）；以及 Annexin V excitation wave（490nm）與 emisson wave（519nm），因此選擇以 FL1 作為 X 軸（Annexin V），FL3 作為 Y 軸（PI）來作細胞的 gating。使用 Annexin V 細胞凋亡測試試劑組（Cat No:FC007P; Gene Research Lab. Co. Ltd., Taipei, Taiwan）來分析中草藥萃出物對於 HepG2 細胞的影響，先將 HepG2 細胞（3 x 105 /well）培養於 6-well 細胞培養盤中（2 mL MEM 細胞培養液中含有 10% FBS） 12 小時，以 2 mL/well PBS 浸洗細胞後，加入含有中草藥水萃出物與 10% FBS 的 MEM 細胞培養液，放入含 37℃含有 5% CO2 培養箱處理 72 小時後，以 0.5 mL 0.5%的 trypsin–EDTA 溶液使細胞游離，再以 1,000 rpm 室溫離心 5 分鐘後，移除懸浮液，細胞 pellets 藉由冰 HBSS 溶液重新懸浮細胞並清洗兩次，加入 1 X Solution A（1 x 106 cells/mL; annexin V binding buffer），經 200 x g 室溫下離心 5 分鐘，去除懸浮液，加入 100 L 的 1 X Solution A（1 x 106 cells/0.1mL）重新懸浮細胞後，再加入 2 L 的 Solution B（標定上 FITC 的 annexin V 的抗體）與 5 L 的 Solution C（PI），均勻的混和後，避光置於室溫 15 分鐘，加入 1 mL 的 Solution E（running buffer），並以 Partec CyFlow 流式細胞儀分析，並以 Partec FloMax 程式分析 FL1（525 nm）與 FL3（630 nm）的細胞資料，最後以 WinMDI（Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry）程式（http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Winmdi.htm）分析 2 維統計圖。 21.

(35) 本論文中實驗的 threshold 判斷是以 Kit 所附的 Solution D（apoptosis inducer）作為 positive control 來區分 Annexin V+/PI+（late apoptotic or necrotic cells）、Annexin V-/PI+（damaged cells）、Annexin V+/PI-（apoptotic cells）及 Annexin V-/PI-（live cells）等四類細胞，調整 threshold 倍數的判別，先以無加藥處理且 unstain 的 HepG2 細胞先 gating SSC 與 FSC 散射光譜圖中的 R 區域，而經 Argon（488 nm）激發後，來作 R 區域中的 PI (FL3/630nm)與 Annexin V (FL1/525nm)的判別，而 FL1 與 FL3 二維圖的 R1 (PI+/Annexin V+)與 R2 (PI-/Annexin V+)區域的劃分，為 HepG2 細胞經 apoptotic inducer 處理後，以 PI stain 區分 FL3，再以 Annexin V stain 來區分 FL1，最後 gating R1 與 R2 區域。FITC 所標定的 Annexin V 經激發後，呈現綠色螢光，而 PI 為紅色螢光可標定 DNA（一般用為檢測細胞週期），可與 Annexin V 搭配來區分不同狀態的細胞，作為後續研究的細胞分類依據。. 22.

(36) 參、結果與討論. 一、細胞存活率測試使用紫蘇、霍香、防風、刺五加葉、石蓮花及七層塔等六種中草藥的水萃出物處理人類肝癌細胞 HepG2，來測試抑制細胞增生作用的效果影響。經過以濃度分別為 0、25、 50、100、200、400 及 800 g/mL 的中草藥水萃出物處理 HepG2 細胞 72 小時，同時以 PBS 處理的細胞為對照組，再使用 MTT 測定 HepG2 細胞的存活率。圖 3-1 所示為六種不同中草藥水萃出物的不同濃度處理，抑制 HepG2 細胞增生的結果。在濃度為 100 g/mL 處理下，抑制 HepG2 細胞生長的效率分別為霍香 39.0 ± 2.5％、紫蘇 51.4 ± 1.9 ％、防風 30.3 ± 2.4％、石蓮花 28.9 ± 2.0％、刺五加葉 31.2 ± 1.8％及七層塔 7.86 ± 1.2 ％；在濃度為 400 g/mL 下，抑制 HepG2 細胞生長的效率依序分別為霍香 57.3 ± 2.3 ％、紫蘇 78.5 ± 1.8％、防風 51.3 ± 2.2％、石蓮花 50.4 ± 2.1％、刺五加葉 50.2 ± 2.0 ％及七層塔 19.8 ± 1.3％。在六種中草藥水萃出物中，七層塔對於 HepG2 細胞生長抑制的效果比其他五種中草藥低，所以取紫蘇、霍香、防風、刺五加葉及石蓮花的抑制細胞生長 50%的濃度依序約為 100、300、400、400 及 400 g/mL 進行 cDNA 微陣列分析。在篩選抗癌中草藥的效應評估上，包含以下三項：（1）提升個體免疫力以殺死癌細胞或抑制癌細胞，提升個體免疫力的指標應為激活 B 細胞或 T 細胞增生或分化的能力 [Chen et al., 1995]；（2）抑制癌細胞生長 [Yoo, 2002]；（3）令癌細胞發生細胞凋亡作用 [Bonfoco et al., 1995; Yeung et al., 1999]。近幾年來，中草藥對於抑制肝癌細胞生長的研究，漸漸受到重視，白芍對於抑制 HepG2 與 Hep3B 細胞生長的 IC50 分別約為 4.6 與 4.4 mg/mL [Lee et al., 2002]；粉防己鹼抑制 HepG2 細胞生長的 IC50 約為 9 M [Yoo et al., 2002]，皆用於探討中草藥誘使肝癌細胞產生 DNA 片段化的情況，此外探究基因的表現，除了使用傳統的 PCR 技術之外，也可以利用接下來所使用的 cDNA 微陣列分析，並在短時間內同時檢測成千上萬個基因的表現。 23.

(37) 二、微陣列分析 1. 微陣列影像微陣列技術的發展可以同時偵測上千個或上萬個基因的表現，人類 UniversoChip 8K-1 的 cDNA 基因晶片（AsiaBioinnovations Co., Newark, CA）含有 7,680 個基因或 EST 序列，用來分析 HepG2 細胞經由中草藥水萃出物處理後的基因表現圖譜（gene expression profile）。以紫蘇、霍香、防風、刺五加葉，石蓮花及 PBS（對照組）處理 HepG2 細胞 72 小時，抽取細胞 total mRNAs，經 RT-PCR 標的上螢光 Cy3（對照組 total RNAs）或 Cy5（實驗組 total RNAs），在 cDNA 基因晶片上進行競爭性雜合作用後，以自動影像處理系統 Axon GenPix Pro-4.0 軟體掃瞄，擷取 cDNA 基因晶片上 7,680 個 spots 的 Cy3 與 Cy5 表現的數值，約 50%個基因被篩選出來作為 Cluster 程式分析，探討以不同中草藥處理肝癌細胞 72 小時後的基因表現樣式。篩選的條件主要先扣除 spots 的螢光亮度小於晶片背景值與飽和點（Cy3 與 Cy5 的數值超過儀器所能測量的範圍），並刪除晶片上有污損的 spots，自動影像處理系統 Axon GenPix Pro-4.0 軟體會在有不同污損的情況下，圈選適當 spot 的圓形範圍，當影像訊號高時，訊號範圍圈選，可以讓影像的擷取正確性提高（圖 3-2D），但是當有影像出現污損或背景值高的狀況出現時（圖 3-2E），分析軟體會圈選出訊號低 spots 的位置，且會把污損或具有雜質干擾的 spots 也作訊號擷取，而造成結果誤差的產生，在本研究中，為了避免此狀況產生，所以會先把這些區域所涵蓋的 spots 刪除，並留下訊號強度大於 Cy3（532 nm）與 Cy5 （635 nm）螢光背景值加 2 倍標準差（% > B532+2SD 或 % > B635+2SD）的 spots。圖 3-2A-C 為 cDNA 微陣列分析五種中草藥處理 HepG2 細胞中，紫蘇、霍香與刺五加葉處理後基因表現的影像結果，圖 3-2B 中，基因晶片影像的右下角具有雜質亮點造成區域的污染為 cDNA 微陣列實驗過程中的會發生的問題之一 [Martinez et al., 2003]，再進行篩選與正規化的處理前，會刪除此區域所涵蓋 spots 的 Cy3 與 Cy5 數值。在五種. 24.