經由凋亡途徑而走向死亡一途的細胞，因過程中會將細胞膜內帶負價的磷脂質翻轉 於細胞膜外，Annexin V（分子量 35~36 KD）為一種二價鈣離子依賴性磷脂質結合蛋白，
屬於近幾年發現的annexins 蛋白質家族，含有抗凝血的特質，對於帶負價的磷脂質（例 如 phosphatridylserine ） 具 有 高 結 合 力 的 鍵 結 ， 但 對 於 phosphatidylcholine 與
sphingomyeline 為低親和性，所以可以用來偵測凋亡的細胞。
Annexin V 經由 FITC 螢光的標定，再以流式細胞儀分析每顆細胞的狀態，可以對 產生細胞凋亡作用的細胞作定量與定義。以FITC-Annexin V（綠色螢光）與 propidium iodide（紅色螢光）同時染細胞可以區分出未受損的活細胞（FITC-/PI-）、細胞凋亡早期 細胞（FITC+/PI-）及細胞凋亡晚期或細胞壞死的細胞（FITC+/PI+）。而實驗中使用的 Partec CyFlow（CyFlow® SL, Peak Technology Co. Ltd., Münster, Germany）細胞流 式儀具有FL1（525nm）、FL2（575nm）與 FL3（630nm），參考使用的螢光標的物 PI 的excitation wave（342nm, 495nm）與 emisson wave（639nm）；以及 Annexin V excitation wave（490nm）與 emisson wave（519nm），因此選擇以 FL1 作為 X 軸
（Annexin V），FL3 作為 Y 軸（PI）來作細胞的 gating。
使用Annexin V 細胞凋亡測試試劑組（Cat No:FC007P; Gene Research Lab. Co.
Ltd., Taipei, Taiwan）來分析中草藥萃出物對於 HepG2 細胞的影響，先將 HepG2 細胞
（3 x 105/well）培養於 6-well 細胞培養盤中（2 mL MEM 細胞培養液中含有 10% FBS）
12 小時，以 2 mL/well PBS 浸洗細胞後，加入含有中草藥水萃出物與 10% FBS 的 MEM 細胞培養液，放入含37℃含有 5% CO2培養箱處理72 小時後，以 0.5 mL 0.5%的 trypsin–EDTA 溶液使細胞游離，再以 1,000 rpm 室溫離心 5 分鐘後，移除懸浮液，細 胞 pellets 藉由冰 HBSS 溶液重新懸浮細胞並清洗兩次，加入 1 X Solution A（1 x 106 cells/mL; annexin V binding buffer），經 200 x g 室溫下離心 5 分鐘，去除懸浮液，加 入100L 的 1 X Solution A（1 x 106cells/0.1mL）重新懸浮細胞後，再加入 2 L 的 Solution B（標定上 FITC 的 annexin V 的抗體）與 5L 的 Solution C（PI），均勻的混 和後，避光置於室溫15 分鐘，加入 1 mL 的 Solution E（running buffer），並以 Partec CyFlow 流式細胞儀分析，並以 Partec FloMax 程式分析 FL1（525 nm）與 FL3（630 nm）
的細胞資料，最後以WinMDI（Windows Multiple Document Interface for Flow
Cytometry）程式（http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Winmdi.htm）分析 2 維統計圖。
本論文中實驗的threshold 判斷是以 Kit 所附的 Solution D（apoptosis inducer）作 為positive control 來區分 Annexin V+/PI+（late apoptotic or necrotic cells）、Annexin V-/PI+（damaged cells）、Annexin V+/PI-（apoptotic cells）及 Annexin V-/PI-（live cells）
等四類細胞，調整threshold 倍數的判別，先以無加藥處理且 unstain 的 HepG2 細胞先 gating SSC 與 FSC 散射光譜圖中的 R 區域，而經 Argon（488 nm）激發後，來作 R 區域中的PI (FL3/630nm)與 Annexin V (FL1/525nm)的判別，而 FL1 與 FL3 二維圖的 R1 (PI+/Annexin V+)與 R2 (PI-/Annexin V+)區域的劃分，為 HepG2 細胞經 apoptotic inducer 處理後，以 PI stain 區分 FL3，再以 Annexin V stain 來區分 FL1，最後 gating R1 與R2 區域。FITC 所標定的 Annexin V 經激發後，呈現綠色螢光，而 PI 為紅色螢光可 標定DNA（一般用為檢測細胞週期），可與 Annexin V 搭配來區分不同狀態的細胞，作 為後續研究的細胞分類依據。