大腸桿菌生長條件與培養方法

1. 繼代培養

第一代菌株皆以 LB 為培養液，挑單一菌落培養於培養液，在 37℃ 恆溫震 盪箱以轉速 200 rpm 培養。菌株之繼代保存則以 LB 作為繼代保存培養基, 利 用劃線法將菌株接種於平板培養基，在 37℃ 恆溫箱培養到適當大小的菌落，置 於 4℃ 保存。

2. 批次培養

為了使菌體適應生長環境，所以需先作二次繼代培養，然後再於第三代時培 養在所需條件。

第一代培養：挑取單一菌落接種至 5 ml LB 培養液，培養 6 ~ 8 小時使菌 體活化。

第二代培養：取 50µl 菌液接種到 5 ml 基礎培養基（minimal medium），

並以最終濃度 2.25 mM 或 40 mM 葡萄糖作為碳源，然後於 37℃ 隔夜培養，

此培養目的在使細菌適應新的生長環境。

第三代培養：取適量菌液至含不同碳源的基礎培養基中進行培養，培養時所 加的菌量在 OD600 上升範圍控制於 0.02~0.025 之間。本實驗所使用的碳源為 醋酸（acetate）、葡萄糖（glucose）、甘油（glycerol）與琥珀酸（succinate）。

之後於 37℃ 200 rpm 培養至 OD600 吸光值為 0.4～0.45 時，置於冰上 10 分 鐘後，以 5,000 rpm 離心 10 分鐘收取菌體，目的為取得處於對數生長期的菌 體進行 RNA 萃取與 ATP 與 ADP 含量分析。

3. 連續式培養

本實驗連續式培養是採用化學恆定的連續式培養（chemostat continuous culture），其最大的優點在於只需決定稀釋速率（D）便可以得到比生長速率（µ）

（詳見 3.2），而稀釋率由可調式幫浦便可決定，因此可控制細菌的比生長速率。

(1) 培養基的製備

化學恆定連續式培養使用之培養基與批次培養之基本培養基成分相同，唯碳 源的添加為每公升 2.25 mM，在此以 carbon limitation 來限制菌體生長。由於 連續式培養須消耗大量培養液，所以我們以 20 公升的儲水桶（Nalgene Cat. No.

2250-0050）為單位，每桶裝 17 公升基礎培養基，配製數桶後於高溫高壓下滅 菌 90 分鐘，於滅菌後待培養液溫度下降至室溫時再添加碳源

(2) 連續式培養系統之裝置

a. 槽體之組裝：

槽體為連續式發酵之主體，加入 1 公升去離子水，將上蓋裝配鎖緊後，於 冷凝管出口及進氣口接上 0.22 µm 濾菌膜，各出口及接頭均用鐵夾封閉並在管 口處包上鋁箔紙。以打氣幫浦測試槽體是否有漏氣情況，直到調整至完全封閉後 才可加以滅菌。滅菌時須打開冷凝管出口以防止滅菌時壓力的變化。

b. 流速測定管：

將滴定管頂部以棉花塞住並包上鋁箔紙。滴定管之下方接上三插管，再接 上矽膠管而分成兩個接頭，其中一個與槽體相接，另一個則與進料管相接。並在 管口處包上鋁箔紙，二接頭均用鐵夾封閉。

c. 培養液供應桶：

內裝有 17 公升培養液，桶上的蓋子有兩個接頭，一為負責進料之接頭，另 一則與過濾器相接，目的在平衡桶子內外的壓力並過濾空氣，所有出口及接頭均 用鐵夾封閉並在管口處包上鋁箔紙，以防止滅菌後污染。

d. 廢液收集桶：

以 20 公升空桶作為收集廢液用。桶上蓋子也有兩個接頭，一個與發酵槽出 料管相接以收集廢液，另一個接頭與裝有棉花之注射筒的筒身相接，以平衡桶子 內外的壓力並過濾空氣，出口及接頭均用鐵夾封閉並在管口處包上鋁箔紙，以防 止滅菌後污染。

槽體、流速測定管、廢液收集桶三者可同時置於 121℃，1 大氣壓下滅菌 60 分鐘或個別滅菌，而培養液供應桶則需 121℃，1 大氣壓下滅菌 90 分鐘。滅菌 後便可以將此四部份所有接頭相連接，所有操作過程皆需快速完成並過火滅菌以 避免污染。

(3) 接菌前的準備及接菌

連續式培養系統於每次裝置完成後，由於安裝於蠕動幫浦之矽膠管長度可能 會有些許的不同，所以每次接菌前須先利用流速測定管測定本次蠕動幫浦的流 速，以作為往後調控培養液之流動速率的依據。並且在接菌之前需先啟動連續式 培養系統，將槽體內的去離子水置換成培養液，本實驗的通氣量是利用氣體流量 計來控制，而氣體流量計在使用之前需用排水集氣法校正。另外欲進行連續式培 養的菌株需先培養在 5 ml LB 培養液，於 37℃ 恆溫振盪培養至對數期後注入 發酵槽內，再調整蠕動幫浦的流速以控制生長速率進行連續式培養。

(4) 連續式培養的生長條件

本實驗是利用 BIOFLO 發酵槽及控制器來控制生長條件（New Brunswick Scientific Co.）。槽體體積為 1.5 公升，培養體積為 1 公升，培養溫度為 37℃，

攪拌速率為 500 rpm，通氣量控制在 2 L/min，pH 值則維持在 6.9 ( 0.1。

(5) 細胞生長速率之控制與菌體收集

利用調節培養液流動的快慢以控制細胞生長速率，在每次變換培養液流動速率時，

至少須相隔 6 個反應槽的滯留時間（reactor residence time, τ），以確定菌體的生長 到達新的穩定期（steady state）。當菌體生長達穩定狀態後才可以收集樣本。