2.1.1 碳源對大腸桿菌細胞生長速率之影響
大腸桿菌可利用不同基質（substrate）來生長，不同的營養成份如碳源及氮 源經微生物攝取後可經由細胞內不同的代謝途徑加以利用，進而產生不同細胞生 長速率。例如大腸桿菌 K12 菌株培養在以葡萄糖（glucose）為碳源的培養基時，
其細胞細胞倍增所需的時間（doubling time）約為 0.5 小時。若培養在僅以醋酸
（acetate）為碳源之培養基時，其細胞倍增時間則增長為 2 小時。 Wolf 等人曾 利 用 不 同 養 分 培 養 液 證 明 大 腸 桿 菌 體 內 6- 磷 酸 葡 萄 酸 鹽 去 氫 酶
（ 6-phosphogluconate dehydrogenase ） 及 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 去 氫 酶
（glucose-6-phosphate dehydrogenase）等酵素活性均受到細胞生長速率所調 控，並證實此二酵素活性的改變是直接由生長速率改變所造成，而不是由於碳源 的專一性所影響造成（Rowley et al., 1991）。同樣利用不同養分培養基組成也證 明了 ompA 基因、elongation factor Tu 及 gua 操縱子的表現會受到生長速率的 調控（Furano, 1975; Cozzarelli et al., 1990; Georgellise et al., 1992），本實驗即 利用不同碳源進行批次培養以研究生長速率的變化。
2.1.2 生長速率對大腸桿菌細胞組成及其生理狀況的影響
細胞生長速率會影響細胞內的生理狀況，特別是細胞內巨分子組成，包括 DNA 、RNA 及蛋白質等均會隨著細胞生長速率不同而改變。 Dorman 等人在研
究傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium）中首先證明細胞內巨分子組成隨生 長速率上升而增加（Dorman et al., 1988）。陸續研究亦發現在大腸桿菌 B/r 菌株 中，當生長速率由 0.6 doubling/hr 增快至 2.5 doubling/hr 時，RNA 含量及核糖 體（ribosome）增加近 10 倍，而 DNA 含量增加近 2 倍（Ingraham, 1987）。
由於生長速率改變對於細胞的巨分子組成造成了重大改變，意謂著生長速率對於 細胞生理而言是複雜且重要的調控因子。
除了巨分子外，許多細胞內生理因子亦被生長速率所調控。如 RNA 聚合酶 活性也隨著生長速率增快而增加。生長速率加快同時也造成了細胞轉譯頻率
（translational frequency ） 增 加 ， 複 製 時 間 與 複 製 起 始 重 量 下 降 等 的 情 形
（Ingraham, 1987; Wold et al., 1994），由於上述各種因子均受生長速率所調控，
因此細胞生長速率與基因表現之關係一直受到重視。
2.1.3 細胞生長速率對基因表現的影響
在菌體中有許多基因會受生長速率所影響，這些基因的表現量與酵素活性高 低一般可分為兩種情形：
1. 隨著生長速率加快而上升。
2. 隨著生長速率下降而增加。
例如 zwf （glucose-6-phosphate dehydrogenase）、ompA （out membrane protein II）等基因屬於前者（Rowley et al., 1991; Georgellis et al., 1992），而 rmf
（ribosome modulation factor)、frdABCD （fumarate reductase）以及 lacZ 基 因則屬於後者（Yamagish et al., 1993; Tseng et al., 1994a; 2001b）。除此之外，
（succinate dehydrogenase, sdhCDAB）與催化蘋果酸（malate）和草醋酸
（oxaloacetate）之間轉換的蘋果酸去氫酶（malate dehydrogenase, mdh）此二 酵素，無論在有氧或無氧環境下基因表現量均受生長速率調控（Park et al., 1995a;
1995b）。本研究室亦發現於有氧環境下催化延胡索酸與蘋果酸轉換的延胡索酸酶 A（fumA）及延胡索酸酶 C（fumC）之表現量也均會隨著生長速率加快而降低。
DNA methyl-transferase（dam）是基因複製時負責甲基化 GATC 序列且為 錯誤配對（mismatch）修復時的必需酵素。目前已證實 dam 基因中的主要啟動 子 P2 在 高 生 長 速 率 下 有 較 高 的 轉 錄 頻 率 （ transcriptional frequency ）
（Rasmussen et al., 1995）。而在磷酸五碳糖反應途徑（pentose phosphate pathway）中，將乳糖（lactose）轉換為核酮酸-5-磷酸（ribulose-5-phosphate）
之6-phosphogluconate dehydrogenase（gnd），在大腸桿菌 K12 菌株中發現以 葡萄糖為碳源時， gnd 基因表現量是以醋酸為碳源時的 3 倍，因此生長速率增加 時， gnd 基因的表現量亦增加（Wolf et al., 1979）。
2.1.4 生長速率調控機制的探討
細胞生長速率對細胞生理功能的影響深遠複雜，因此生長速率對基因的調控 一直是許多研究的著眼點，目前對於生長速率改變時對基因調控的機制仍不是十 分清楚，相關的研究亦未臻成熟。我們已了解在不同的生長速率下，影響酵素活 性及其產量高低的機制可能是在轉錄或轉錄後過程受到調控（transcription level 或 post-transcription level）。例如：產生 pentose phosphate pathway 中催化第 一個步驟酵素的 zwf 基因，在生長速率改變時，可藉由轉錄的步驟來調控（Rowley et al., 1991）；而產生大腸桿菌外膜蛋白質的 ompA 基因隨著生長速率提高而增 加表現量，則是因為生長速率的不同影響了 ompA 基因 mRNA 的穩定性（Nilsson
et al., 1984; Georgellis et al., 1992）。
由於生長速率調控基因的方式不一，亦沒有特定的啟動子需求，目前仍有不 明確的調控機制存在，因此本論文由探討不同碳源對細菌生理所造成之變化，藉 此了解是否不同碳源可經由改變細胞內能量狀態、代謝途徑與生合成反應，以及 DNA 超 螺 旋 結 構 改 變 影 響 細 胞 生 長 速 率 ， 或 是 鳥 苷 四 磷 酸 （ guanosine tetraphosphate, ppGpp）造成細胞分裂基因表現改變與菌體型態變化，進而影響 了細胞生長速率。
2.1.5 細胞內主要來源 ATP
細菌吸收並分解環境或培養基中的養分後，以 ATP 形式存在於細胞內，這些 ATP 隨即被消耗運用於溶質運送、單體（單醣、核苷酸、脂肪酸）與大分子（核 酸、脂質、蛋白質、多醣類）合成等各種需能反應上。這些反應所製造出的物質 不但造成細胞重量增加，也使得細菌能持續分裂與生長，因此微生物的生長與 ATP 有直接關係。
細菌體內合成 ATP 的機制有二（Gottschalk, 1988）：
1. 氧化磷酸化反應（oxidative phosphorylation）：利用電子從氧化還原電位較低 的供給者轉移到電位較高的接受者時，伴隨 ADP 與無機磷酸根（Pi）結合產 生 ATP。這一部份的反應多發生於呼吸鏈或光合成反應中。
2. 受質水平磷酸化反應（substrate level phosphorylation）：在有機受質被分解成 小分子中間物時，放出的高能磷酸鍵與 ADP 結合而生成 ATP。
2.1.6 碳源對代謝產生能量途徑之影響
不同環境下微生物的代謝產能途徑會隨之改變，大腸桿菌利用不同受質經呼 吸酵素產生 NADH，再經由細胞內 quinone pool 傳給電子接受者，以進行氧化 磷酸化反應來產生 ATP 供給生長所需。在有氧環境下，若以一分子葡萄糖為例，
由 Fig 7 代謝途徑可知葡萄糖經由糖解作用（glycolysis）生成兩分子丙酮酸
（pyruvate）的過程中，先後分別由磷酸甘油激酶（phosphoglycerate kinase, pgk）
與丙酮酸激酶（pyruvate kinase, pyk）催化，可經由受質水平磷酸化反應產生 2 個 ATP 。接著 pyruvate 以乙醯輔酶 A（acetyl-CoA）為主要的分解代謝產物，進 行完整的 TCA cycle 後氧化成二氧化碳，在此過程中，由琥珀醯硫激酶（succinyl thiokinase, sucCD）將琥珀醯硫 A（succinyl-CoA）催化成琥珀酸（succinate）
步驟中，可生成一個高能ATP 分子，同時經由電子傳遞鏈（electron transfer chain）
伴隨進行氧化磷酸化作用，由ATP 合成酶（ATP synthase, atp）產生 38 個 ATP 分 子 。 若 是 處 於 無 氧 的 環 境 下 ， 同 樣 是 一 分 子 的 葡 萄 糖 僅 可 藉 由 發 酵 作 用
（fermentation）或厭氧呼吸產生 ATP，在此過程中大腸桿菌是以醋酸激酶
（acetate kinase, ackA）將帶有高能磷酸根的乙醯磷酸（acetyl-phosphate）轉變 為醋酸，並伴隨一個ATP 分子產生。
綜合以上所述，在代謝途徑上與 ATP 直接合成的相關酵素共有五種，分別是 磷酸甘油激酶（phosphoglycerate kinase, pgk）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase, pyk）、琥珀醯硫激酶（succinyl thiokinase, sucCD）、ATP 合成酶（ATP synthase, atp）與醋酸激酶（acetate kinase, ackA）。本實驗將探討不同碳源為生長基質時，
對於 pgk、pyk、ackA、sucCD 與 atp 等基因的影響與表現量改變情形。
2.1.7 ATP/ADP 比例
ATP 是生物系統能量可供利用的形式，作為自由能的直接供應者而非用來長 期儲存自由能。 ATP 轉換速率（turn over rate）在細胞中極為快速，一分子 ATP 在形成後一分鐘內即被消耗，唯有持續將 ADP 與 Pi 結合再生 ATP 才能提供細 胞所需的能量（Stryer, 1995）。因此產能與耗能的反應不斷交替進行著，使得細胞 內 ATP 與 ADP 二者間的濃度比例與細胞內生理狀態有關。例如：在肌細胞中 ATP/ADP 比例可調控肌動蛋白（actin）的作用（Carlier et al., 1993）；反之，肌 細胞內的肌酸激酶（MM creatine kinase）可調控 ATP/ADP 比例（Korge et al., 1993）。目前已知在有氧環境下，大腸桿菌細胞內 ATP/ADP 比例較生長於無氧下 為低（Hsieh et al., 1991）。許多活體外試驗均證實 ATP/ADP 比例影響 DNA 超 螺旋結構。當培養環境之含氧量降低時 ATP/ADP 比例提高， DNA 超螺旋隨之 旋緊；或將菌體由一般培養基中轉移至高鹽（NaCl）環境下，ATP/ADP 比例會立 刻增加且 DNA 超螺旋結構也變得較為緊密（Hsieh et al., 1991）。推論其作用為 ATP/ADP 比例影響了 gyrase B 的活性，進而影響細胞 DNA 超螺旋結構。再 者，也發現 ATP/ADP 比例會影響 RNA 的穩定性，磷酸酶（phosphorylate kinase, PPK）可藉由磷酸根的轉移來調控 mRNA 穩定性，當 RNA 處在分解狀態下，
PPK 會將 ATP 水解且於 RNA 的 5’ 或 3’ 端形成多磷酸鏈（polyphosphorylate chain），此作用可增加 RNA 的穩定性；但加入 ADP 時， PPK 則會催化 ATP 合 成而不進行加磷酸鏈反應。由此可知 ATP/ADP 比例高時 RNA 較穩定，反之則 較不穩定（Blum et al., 1997）。 Rohwer 等學者亦發現藉由誘導 atp 操縱子
（H+-ATPase）表現量的不同而改變 ATP/ADP 比例時，會影響大腸桿菌攝取葡 萄 糖 的 PTS （ phosphoenolpyruvate phosphotransferase system） 活 性 ， 當
ATP/ADP 比例已成為相關研究中的反應參考指標。
2.1.8 DNA 超螺旋結構（DNA supercoiling）與 topoisomerase
由電子顯微鏡觀察到 DNA 分子具有雙股雙股之間緊密纏繞的現象，此種 DNA 形式稱為超螺旋結構（supercoiling）。實驗證實菌體 DNA 以自由能最小的 negatively supercoiling 狀態存在（Worcel and Burgi, 1972; Sinden and Pettijohn, 1981），且在 negative 狀態下，有利於雙股 DNA 在複製、重組及轉錄時的分離。
為了解決 DNA 半保留複製造成的雙股解旋（untwining）與鏈結（catention）
現象，不論在原核或真核細胞中皆有某些酵素可以藉由改變 DNA linking number 來解決這些問題。而這些酵素亦可使 DNA 形成各種拓樸異構物，因此就統稱它 們為拓樸異構酶（topoisomerases）。
目前所發現的 topoisomerases 以它們的作用形式大致上可分為兩類： type I topoisomerase 利用切斷雙股 DNA 的一股使其穿過另一股，再以 ligase 將其 連接；而藉由將兩股 DNA 完全切斷，讓兩股相互繞過再結合的則屬於 type II
目前所發現的 topoisomerases 以它們的作用形式大致上可分為兩類： type I topoisomerase 利用切斷雙股 DNA 的一股使其穿過另一股，再以 ligase 將其 連接；而藉由將兩股 DNA 完全切斷，讓兩股相互繞過再結合的則屬於 type II