碳源與生長速率對大腸桿菌細胞內能量之關係 - 碳源與生長速率對大腸桿菌DNA 超螺旋結構、ATP生合成基因與細胞分裂基因調控之研究

6.1.1 不同碳源與生長速率對大腸桿菌細胞內能量狀態的影響

微生物吸收並分解環境或培養基中的養分，產生能量後以 ATP 的形式存在於細胞內。我們發現不同碳源培養造成不同的細胞生長速率，並發現細胞內的 ATP 含量會隨生長速率加快而上升（Fig 1 與 Table 1）。 ATP 含量增加顯示生長速率快的細胞較生長速率慢的細胞有較高的能量，處於高生長速率下的細胞其分裂速率較快，因此消耗在細胞內溶質運送、單體與大分子合成等各種生化需能反應較多（Gottschalk, 1988）。由於高生長速率的細胞與低生長速率細胞內 ATP 的含量有明顯差異，而生長可說是生化反應的總體結果，這些生化反應所得到最終現象可以細胞質量（biomass）改變為代表，因此在加快生化反應的同時亦造成了細胞重量增加。

微生物可利用不同受質來獲取能量，在不同環境下大腸桿菌利用碳源代謝產能途徑也改變。分析實驗中使用四種不同碳源其所依循的代謝途徑，當以葡萄糖為碳源時，大腸桿菌會利用 phosphoenopyruvate phosphotransferase system

（PTS）將細胞外葡萄糖磷酸化後帶入細胞中，經由糖解作用以 acetyl-CoA 為主要分解代謝產物，進行 TCA cycle 後氧化成二氧化碳並獲得能量（Furano, 1975）。當以甘油為碳源時，大腸桿菌可利用被動運輸系統（passive diffusion）

進入細胞中，在傳遞過程中藉由 glycerol facilitator 作為運送通道以通過細胞膜，再經由甘油激酶（glycerol kinase）將甘油磷酸化轉換為甘油-3-磷酸

（fructose 1,6-bisphosphate）所調控（De Boer et al., 1986），但僅以甘油為碳源時，細胞對甘油攝入與代謝所受到的影響因子便可減少。以琥珀酸為碳源時大腸桿菌則是利用 C4-dicarboxylate transporter 將琥珀酸運送進入細胞內，可直接進入 TCA cycle 與電子傳遞鏈進行代謝利用，此時能量的產生是取決於氧化磷酸化反應（Boogerd et al., 1998）。若以醋酸為碳源供應時，醋酸可經由主動運輸傳送至細胞中，隨即藉由乙醯輔酶 A 合成酶（acetyl-CoA synthetase）將醋酸轉換成 acetyl-CoA ， acetyl-CoA 便可進入 TCA cycle 代謝產能。然而為了生化合成的需要，在以醋酸為碳源的同時，大腸桿菌亦可進行 glyoxylate cycle 來代謝 acetyl-CoA （Furano, 1975）。由於這些複雜的生理機制使得利用不同碳源生長時菌體內的能量狀態也有所差異。

由Fig 1 與 Table 1 結果可了解菌體在對數生長期時，細胞內 ATP 與 ADP 含量有明顯差異，這是由於不同碳源導致含有高能磷酸鍵的 adenylate 化合物

（ATP 與 ADP）以及 ATP/ADP 比例隨之改變，因此 ATP 與 ADP 之間的轉換成為生物能量重要指標。同時細胞所得能量狀態也對碳源的傳輸造成不同影響，由於葡萄糖的傳送系統為 ATP-dependent ，且 PTS 系統也需要高能 PEP 作用，因此處於高能量狀態下有助於細胞對葡萄糖的攝取。最近研究也發現大腸桿菌對於甘油正向趨化性（chemotaxis）為 energy-dependent（Zhulin et al., 1997）；而在大腸桿菌 atp（H⁺-ATPase）突變株中因缺乏 C4-dicarboxylate transportor ，無法在以琥珀酸為碳源的環境下生長（Boogerd et al., 1998），因 此依據所得結果可推論在批次培養下，當 ATP/ADP 比例較高時，也可能增加了菌體對葡萄糖及琥珀酸的攝取以及對甘油的趨化性反應。

在批次培養下以醋酸、葡萄糖、甘油與琥珀酸四種不同碳源作為大腸桿菌生長基質時，細胞生長速率以葡萄糖為碳源時最快，其次是甘油與琥珀酸，以醋酸為碳源時則最慢，碳源不同可造成細胞生長速率的變化，除了影響細胞內ATP 與 ADP 含量外，也調控了 ATP/ADP 的比例。由 Fig 1 可看出生長速率愈快時細

胞內 ATP 含量愈高，此現象為 growth rate-dependent ，因此推論在生長速率上升時，細胞內將 ADP 轉換成 ATP 的速率加快許多。

由最近研究也發現糖解作用的效率並非由 ATP/ ADP 比例所調控，而是直接受 ATP 含量所影響，當 H⁺- ATP 合成酶活性上升時，發現 ATP 含量增加且糖解作用效率提高 70%（Koebmann et al., 2002），我們也觀察到以葡萄糖為碳源時， ATP 含量最高且生長速率較其他碳源來得快速，可知 ATP 含量較高使得生化代謝途徑加速進行，有利於細胞生長所需之巨分子合成，也證實能量的確會調控生化合成途徑並影響基質的吸收，與生長速率也有密切關係。

6.1.2 貧乏培養（starvation）與 ppGpp 對大腸桿菌細胞內能量狀態之影響

在批次培養下以基礎培養基外加碳源為生長培養條件，探討 △relA △spoT 雙突變株利用不同碳源時之能量狀態與 DNA 超螺旋結構的改變，同時比較大腸桿菌野生株在碳源貧乏環境下誘發 ppGpp 合成時，探討 ppGpp 對大腸桿菌野生株能量狀態之影響。

由Table 1 與 Table 2 結果指出大腸桿菌野生株在碳源貧乏時， ATP/ADP 比例與正常碳源供應時比較並無明顯變化，顯示野生株體內 ppGpp 對其能量狀態的改變並無明顯變化，但 △relA △spoT 雙突變株無法合成 ppGpp ，發現以醋酸及葡萄糖為碳源時突變株細胞內 ATP 含量皆明顯變動，由於 ppGpp 合成需要 ATP 參與（Cashel et al., 1996），推測 △relA △spoT 雙突變株由於缺乏 RelA 與 SpoT 等蛋白質，因此無法利用 ATP 與 GDP 來合成 ppGpp 而造成細胞內 ATP 與 ADP 含量差異。此外碳源貧乏對細菌而言是極大的逆境，△relA

ATP 與 ADP 含量也因細胞內這些生合成反應無法進行而有所改變，但 ATP 與 ADP 含量之比例關係卻不受影響。

6.1.3 碳源對大腸桿菌 ATP 生合成基因之影響

在細菌生長中能量在其生理上扮演重要角色，細胞結構的維持、細胞基本功能的進行以及細胞內新物質的合成等等都是需能反應，這些能量皆由一連串生化代謝反應所生成的ATP 來供應。另一方面，各種基質在氧化分解中所形成的各種中間產物（intermediates）多為合成其他重要生化分子的原料，包括合成醣類、

蛋白質、脂肪、核酸及酚類等。因此微生物的成長與增殖都必須依賴營養供給，

當提供不同碳源作為生長基質時，碳源種類對於細胞中生化代謝反應以及生長速率之間都有著密切的關係。

以醋酸為生長基質時，醋酸進入細胞後轉變成 acetyl-Co A ，接著進入 glyoxylate shunt 與 TCA cycle 等代謝途徑（Cozzone, 1998），本實驗觀察到 sucCD 表現量在以醋酸為碳源時最高（Fig 5 與 Table 3），可知以醋酸為碳源時 是以 TCA cycle 為主要產能之代謝途徑。與醋酸代謝有關的基因通常會受葡萄糖抑制，這是因為醋酸與葡萄糖兩種碳源會進行不同的代謝路徑，使得不同代謝路徑的基因被活化，特別是與脂肪酸代謝相關的基因，這些基因大部分會被醋酸活化而受葡萄糖抑制（Cozzone, 1998; Holms, 1996）。反之與生化合成有關之基因，例如胺基酸與核酸合成相關基因表現則在醋酸培養時降低，此外與細胞結構、 DNA 複製、轉錄及轉譯之基因也以醋酸為碳源時表現量較低（Oh et al., 2002），因此醋酸培養時菌體之生長速率降低。本實驗也指出以醋酸為碳源時，

在代謝途徑上與 ATP 合成有關酵素之基因以 pgk、 pyk、sucCD 及 atpI 等基 因表現量都比以葡萄糖為碳源時高（Fig 5 與 Table 3）。以葡萄糖作為生長基質

時，觀察到 pgk 、 pyk 與 ackA 等基因皆有降解物阻遏的現象，尤其在高濃度的葡萄糖供應培養下， pyk 與 ackA 等基因受葡萄糖抑制的程度最大。葡萄糖所引起的降解物阻遏現象是指該代謝物降低了細胞中 cAMP 含量， cAMP 透過與 CRP（cAMP receptor protein）結合形成 cAMP-CRP 複合物，進而影響 RNA 聚合酶的活性以阻止基因的轉錄（Ishizuka et al., 1994）。

甘油除了被利用為合成細胞的基本成分外，有氧環境下可進行氧化作用生成能量。當以甘油為碳源時，利用 glycerol facilitator 經由 glycerol kinase 將甘油磷酸化轉換為 glycerol-3-phosphate 進入細胞內代謝循環（Voegele et al., 1993），當甘油濃度較低時，細胞會限制甘油的被動運輸而較不利細胞生長

（Richey and Lin, 1972），若生長基質含有葡萄糖時會抑制 glycerol facilitator

（Sanno et al., 1968）。 glycerol-3-phosphate 進入細胞後，可作為磷脂類合成之前軀物，或是形成 glyceraldehyde-3-phosphate 進入糖解作用。由 Fig 6 可知 pgk 與 pyk 基因的表現在以甘油為生長基質時表現量最高，尤其當甘油濃度較 高時表現更為上升，表示以甘油為碳源進入細胞後會進行糖解作用，接著進入 TCA cycle 與電子傳遞鏈，因此觀察到在這些代謝途徑上產生 ATP 基因都明顯上升，此外也發現發酵作用中 ackA 基因表現也以甘油為碳源時表現量較高，推測是因甘油為碳源時進入糖解作用後大量生成 pyruvate ，造成 pyruvate 累積，使得 pyruvate 除了轉變成 acetyl-CoA 進入 TCA cycle 代謝外，另外會進行混合酸發酵（mixed acid fermentation ），將 acetyl-CoA 轉變成 acetyl-phosphate，接著由 acetate kinase（ackA）生成醋酸，所合成的醋酸在 有氧狀況下又再次轉變為 acetyl-CoA 進入 TCA cycle 中繼續代謝，因此 ackA 基因在甘油為碳源時表現量上升（Cashel et al., 1996）。

以琥珀酸為碳源時，大腸桿菌利用 C4-dicarboxylate transporter 將琥珀酸

acetyl-CoA 與 oxaloacetate 濃度會影響 TCA cycle 的速率（ Cozzone, 1998）。當高濃度琥珀酸為碳源時， sucCD 基因並沒有預期中表現量上升，反 而受到抑制而表現下降，推測琥珀酸進入在 TCA cycle 後，造成 oxaloacetate 累積，使得 TCA cycle 進行速率下降，而過多的 oxaloacetate 會由 PEP carboxylase 轉換成 PEP ，接著由 pyruvate kinase（pyk）轉變為 pyruvate ， 因此在此培養條件下 pyk 基因表現上升，使得在高濃度琥珀酸的供應下菌體 ATP 也以糖解作用為來源：而低濃度琥珀酸培養環境下 sucCD 表現則不受抑 制，也不會造成過多oxaloacetate 累積轉變而成 PEP，因此並沒有觀察到 pyk 基因表現上升，推測此時 ATP 的主要來源是經由 TCA cycle 與電子傳遞鏈而獲得。

由實驗結果可知以不同碳源作為生長基質時，會明顯改變代謝途徑與中間代謝產物，這些產生 ATP 分子之途徑會隨著環境中不同碳源而改變，因此碳源是

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