貧乏培養（starvation）與 ppGpp 對大腸桿菌 DNA 超螺旋結構之影響… 48

本實驗將大腸桿菌野生株與 △relA △spoT 雙突變株在醋酸與葡萄糖的供應 下培養至對數生長期時，以不含任何碳源的基礎培養基置換含有碳源之培養基，

分別進行碳源貧乏培養 30 分鐘後，萃取其質體 DNA 進一步探討碳源貧乏與 ppGpp 對 DNA 超螺旋結構的影響。

由Fig 3 可知 △relA △spoT 雙突變株與大腸桿菌野生株在碳源貧乏時，兩 者之 DNA 超螺旋結構依然隨碳源不同而改變，以葡萄糖為碳源時 DNA 超螺旋 結構較為緊密，以醋酸為碳源時則較為鬆散，顯示 ppGpp 並不影響細胞內 DNA 超螺旋結構。對照Table 2 中 △relA △spoT 雙突變株在碳源貧乏時 ATP/ADP 比例關係，也以葡萄糖為碳源時較高，由這些結果得知突變株與野生株之 DNA 超螺旋結構皆隨碳源不同而改變，且受能量狀態所影響，再次證實細胞內 ATP/ADP 比例是影響 DNA 超螺旋結構的重要因子，當 ATP/ADP 比例增加，

質體 DNA 的超螺旋結構亦隨之旋緊，此現象不受碳源貧乏與 ppGpp 影響。

5.4 生長速率與碳源對不同 topoisomerase 基因表現之影響

由於 topoisomerase（gyrA、gyrB、topA）會改變 DNA 超螺旋結構，本論 文進一步探討在連續式培養下，不同生長速率與碳源對大腸桿菌 topoisomerase 基因的影響，由Fig 4A 北方墨漬結果經定量軟體分析數值化得 Fig 4B。由 Fig 4 可知在生長速率較快時，以醋酸與葡萄糖為碳源時 gyrA、gyrB 與 topA 基因的 表現都較高，證明生長速率較快會使 topoisomerase 基因表現上升，此結果也 符合在連續式培養下生長速率較快時，有較高的 ATP/ADP 比例與較緊密的 DNA 超螺旋結構（張育甄, 1998）。由這些結果可推論碳源與生長速率會影響 topoisomerase 基因的表現，因 topoisomerase 為調控 DNA 超螺旋結構所 需，使得 DNA 超螺旋結構在不同的碳源與生長速率下也有所差異。

5.5 不同碳源對 ATP 生合成基因表現之影響

微生物可利用不同的受質來獲取能量，在不同的環境下大腸桿菌利用碳源的 代謝產能途徑也會改變。本實驗以四種不同碳源（醋酸、葡萄糖、甘油與琥珀酸）

為培養基，探討大腸桿菌分別在 2.25 mM 與 40 mM 不同碳源濃度下代謝途徑 上與 ATP 生合成相關酵素之基因表現，由 Fig 5 北方墨漬結果經定量軟體分析 數值化得Fig 6，並將基因相對表現量歸納成 Table 3，其中以粗黑體字表示者為 特定基因相對表現量較其他碳源為高或低。

比較高低不同濃度為碳源時，在高濃度葡萄糖（40 mM）為碳源下，觀察到 Fig 5 中 pgk、pyk 與 ackA 等基因具有降解物阻遏（catabolic repression）現

測以醋酸為碳源時是經由 TCA cycle 與電子傳遞鏈代謝途徑而獲得 ATP ；以琥 珀酸為碳源時，低濃度培養下的 sucCD 基因表現則遠高於高濃度培養，推測高 濃度琥珀酸會抑制 TCA cycle 內相關代謝基因，使得在高濃度琥珀酸的供應下 菌體 ATP 來源以糖解作用為主，可由 Fig 5 中 pgk 與 pyk 基因表現大於低濃 度琥珀酸得知，而低濃度琥珀酸的培養環境下 sucCD 表現則不受抑制，推測此 時 ATP 的主要來源也是經由 TCA cycle 與電子傳遞鏈獲得。

5.6 碳源與 ppGpp 對細胞分裂基因之影響

以批次培養法使用不同碳源培養大腸桿菌，使得菌體生長速率有所變化，因 生長速率即為細胞分裂之快慢，快速生長的細胞會比慢速生長的細胞較早開始聚 合 Z ring ，並在細胞中央處形成隔板，使得細胞週期與細胞分裂較快。慢速生 長的細胞有較長的細胞生長與染色體複製時間，之後再開始下一個細胞分裂。本 實驗以醋酸與葡萄糖為碳源，探討在此培養條件下細胞分裂基因( ftsZ、minC、 minD ) 的表現如何受碳源調控，Fig 8A 為其北方墨漬之結果，而 Fig 8B 為其數 值定量之結果。由此結果可知以不同碳源為生長基質時，會造成細胞分裂基因的 表現有明顯差異，其中以葡萄糖為碳源時， ftsZ 基因表現量比醋酸為碳源時來 得高， minD 基因也以葡萄糖為碳源時略高，而 minC 基因則是以醋酸為碳源 時較高，得知以不同碳源作為生長基質時影響細胞分裂基因的表現，也造成生長 速率產生變化。

將野生株與 △relA △spoT 雙突變株分別培養於 40 mM 醋酸與葡萄糖為碳 源之基礎培養基，在菌體生長至對數生長期時（OD 600 0.4~0.45），以 5 ml 不含 任何碳源之基礎培養液置換原先添加碳源之培養液，於 37℃下進行 30 分鐘碳源 貧乏培養，並以北方墨漬法分析細胞分裂基因（ftsZ、minC、minD）之表現，

Fig 9A 與 Fig 9B 分別為其北方墨漬與數值分析化之結果。由 Fig 9 可知 ppGpp 會影響大腸桿菌細胞分裂基因的表現，在野生株中由於碳源貧乏而引起 ppGpp 產生，使得 ftsZ 基因表現量上升，其中以葡萄糖為碳源時較明顯，表現量約為

△relA △spoT 雙突變株之 2 倍；而 minC 與 minD 等基因表現量在野生株中 則較低，其中 minC 基因在以醋酸與葡萄糖為碳源時皆明顯受 ppGpp 抑制（以 醋酸為碳源時 minC 基因表現量約下降 13 倍，以葡萄糖為碳源時約下降 7 倍 ）， minD 基因則是以醋酸為碳源時表現量下降約 2 倍（Fig 9B）。由於缺乏 relA 與 spoT 之雙突變株不能合成 ppGpp ，可證明在野生株中誘發 ppGpp 合 成的確會影響細胞分裂基因之表現。

5.7 碳源與 ppGpp 對大腸桿菌菌體型態之影響

將大腸桿菌野生株與△relA △spoT 雙突變株分別培養於基礎培養基，外加 醋酸與葡萄糖作為碳源（最終濃度為 40 mM），當細菌生長至快速生長期時，以 革蘭氏染色法（gram stain）來觀察菌體型態。在 Fig 10 觀察到野生株與 △relA

△spoT 雙突變株在葡萄糖培養環境下的細胞皆比醋酸培養來得大，若在同一種 碳源供應下，也發現 △relA △spoT 雙突變株細胞較大，從 Table 2 得知若在正 常培養條件下時， △relA △spoT 雙突變株的細胞倍增時間較野生株來得快些

（以醋酸與葡萄糖為碳源時倍增時間分別為 57 與 46 分鐘），此結果與先前研 究結果相似，證實生長快速的菌體其細胞體積較大，反之則較小。

此外，我們也著手進行碳源貧乏培養，探討 ppGpp 對菌體型態的影響。當 細菌生長至快速生長期時，以不加任何碳源的基礎培養基置換原本已加碳源之培

（filamentous），尤其以 △relA △spoT 雙突變株於葡萄糖為生長基質時最為明 顯（Fig 11D）。

陸、討論

6.1 碳源與生長速率對大腸桿菌細胞內能量之關係

6.1.1 不同碳源與生長速率對大腸桿菌細胞內能量狀態的影響

微生物吸收並分解環境或培養基中的養分，產生能量後以 ATP 的形式存在 於細胞內。我們發現不同碳源培養造成不同的細胞生長速率，並發現細胞內的 ATP 含量會隨生長速率加快而上升（Fig 1 與 Table 1）。 ATP 含量增加顯示生 長速率快的細胞較生長速率慢的細胞有較高的能量，處於高生長速率下的細胞其 分裂速率較快，因此消耗在細胞內溶質運送、單體與大分子合成等各種生化需能 反應較多（Gottschalk, 1988）。由於高生長速率的細胞與低生長速率細胞內 ATP 的含量有明顯差異，而生長可說是生化反應的總體結果，這些生化反應所得到最 終現象可以細胞質量 （biomass）改變為代表，因此在加快生化反應的同時亦造 成了細胞重量增加。

微生物可利用不同受質來獲取能量，在不同環境下大腸桿菌利用碳源代謝產 能途徑也改變。分析實驗中使用四種不同碳源其所依循的代謝途徑，當以葡萄糖 為碳源時，大腸桿菌會利用 phosphoenopyruvate phosphotransferase system

（PTS）將細胞外葡萄糖磷酸化後帶入細胞中，經由糖解作用以 acetyl-CoA 為 主要分解代謝產物，進行 TCA cycle 後氧化成二氧化碳並獲得能量（Furano, 1975）。當以甘油為碳源時，大腸桿菌可利用被動運輸系統（passive diffusion）

進入細胞中，在傳遞過程中藉由 glycerol facilitator 作為運送通道以通過細胞 膜 ， 再 經 由 甘 油 激 酶 （glycerol kinase）將甘油磷酸化轉換為甘油-3-磷酸

（fructose 1,6-bisphosphate）所調控（De Boer et al., 1986），但僅以甘油為碳 源時，細胞對甘油攝入與代謝所受到的影響因子便可減少。以琥珀酸為碳源時大 腸桿菌則是利用 C4-dicarboxylate transporter 將琥珀酸運送進入細胞內，可直 接進入 TCA cycle 與電子傳遞鏈進行代謝利用，此時能量的產生是取決於氧化 磷酸化反應（Boogerd et al., 1998）。若以醋酸為碳源供應時，醋酸可經由主動 運輸傳送至細胞中，隨即藉由乙醯輔酶 A 合成酶（acetyl-CoA synthetase）將 醋酸轉換成 acetyl-CoA ， acetyl-CoA 便可進入 TCA cycle 代謝產能。然而為 了生化合成的需要，在以醋酸為碳源的同時，大腸桿菌亦可進行 glyoxylate cycle 來代謝 acetyl-CoA （Furano, 1975）。由於這些複雜的生理機制使得利用不同碳 源生長時菌體內的能量狀態也有所差異。

由Fig 1 與 Table 1 結果可了解菌體在對數生長期時，細胞內 ATP 與 ADP 含量有明顯差異，這是由於不同碳源導致含有高能磷酸鍵的 adenylate 化合物

（ATP 與 ADP）以及 ATP/ADP 比例隨之改變，因此 ATP 與 ADP 之間的轉 換成為生物能量重要指標。同時細胞所得能量狀態也對碳源的傳輸造成不同影 響，由於葡萄糖的傳送系統為 ATP-dependent ，且 PTS 系統也需要高能 PEP 作用，因此處於高能量狀態下有助於細胞對葡萄糖的攝取。最近研究也發現大腸 桿菌對於甘油正向趨化性（chemotaxis）為 energy-dependent（Zhulin et al., 1997）；而在大腸桿菌 atp（H⁺-ATPase）突變株中因缺乏 C4-dicarboxylate transportor ，無法在以琥珀酸為碳源的環境下生長（Boogerd et al., 1998），因 此依據所得結果可推論在批次培養下，當 ATP/ADP 比例較高時，也可能增加了 菌體對葡萄糖及琥珀酸的攝取以及對甘油的趨化性反應。

在批次培養下以醋酸、葡萄糖、甘油與琥珀酸四種不同碳源作為大腸桿菌生 長基質時，細胞生長速率以葡萄糖為碳源時最快，其次是甘油與琥珀酸，以醋酸

在批次培養下以醋酸、葡萄糖、甘油與琥珀酸四種不同碳源作為大腸桿菌生 長基質時，細胞生長速率以葡萄糖為碳源時最快，其次是甘油與琥珀酸，以醋酸