第三章 材料與方法
3.3 實驗中使用的方法
3.3.1 細胞形態(morphology)之探討
人類骨肉瘤U-2 OS細胞種植於12-well plate中，以不同濃度之山茱萸水 粗抽或沒食子酸處理後，以倒立顯微鏡觀察並照相，照相時的視野以對準
培養盤的中央孔為主，比較其形態上的改變以確認其細胞是否有受毒殺 [106, 108]。
3.3.2 細胞存活率(viability)之分析
將人類骨肉瘤U-2 OS細胞 (1×104 cells/ml) 置於12-well細胞培養皿
5% CO2、溼度95%之細胞培養箱中培養。收集細胞加入含Hypotonic PI溶 液，利用流式細胞儀(波長488 nm的argon ion laser)分析G0/G1, S, and G2/ M phase細胞週期的分布與凋亡之變化，結果以Cell Quest軟體分析計算[107, 109]。
3.3.4 彗星試驗 (Comet assay)
將人類骨肉瘤U-2 OS細胞 (1×104 cells/ml) 置於12-well細胞培養皿 中，分別以不同濃度之山茱萸水粗抽或沒食子酸處理，再以4μM of hydrogen peroxide (H2O2) 為 positive control group,離心收集人類骨肉瘤U-2 OS細胞 懸浮液至1.5 ml離心管。使細胞懸浮液終體積為300 μl，磨砂載玻片再加入 NMA (normal melting agarose) 與85 μl LMA (low melting agarose)於載玻片 上，取10 μl細胞懸浮液混合 75 μl LMA加到第一層膠上再蓋上蓋玻片。同 時配置 Lysis buffer (100 mM Na2EDTA、10 mM Tris、2.5 M NaCl與1% Triton X-100)，將蓋玻片拿掉並置於Lysis buffer中一小時。準備電泳槽並加入 Alkaline buffer (0.3 M NaOH與1 mM Na2EDTA)置於冰上。將玻片以1×PBS 洗滌後，置於alkaline buffer中 20分鐘，再進行DNA電泳30分鐘，取出玻片 並以二次水洗滌後，置於Neutral buffer (0.4 M Tris)。然後置放在甲醇中脫 水，再加入PI (4 μg/mL)染色，於螢光顯微鏡下觀察彗星尾巴拖尾程度。拖 尾程度越嚴重代表DNA損傷愈嚴重，用Comet Score software (Tritek Corp)
來定量。亦即分別比較不同濃度之山茱萸水粗抽或沒食子酸處理對細胞之 洗滌後，加入4% formal dehyde固定細胞。根據In stiu cell death detection kit (Roche Diagnostics, Fishers, IN, USA)廠商實驗步驟guidline，進行DNA雙股 末端斷裂損壞之偵測。加入4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)螢光染劑， μl的DiOC6 (1 μmol/l) 測ΔΨm,以及500 μl的Fluo-3/AM (2.5 μg/ml)測
intracellular Ca2+，染劑反應30分鐘後，離心後以流式細胞儀分析[110]。
3.3.7 西方墨點法(Western Blot)分析
3.3.7.1 測試細胞週期和細胞凋亡相關蛋白
將人類骨肉瘤U-2 OS細胞以5×105 cells/well 的密度種植在6孔培養盤 上，用2500 μg/mL 山茱萸水粗抽處理0, 6, 12, 24, and 48 小時後，加入lysis buffer(40 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA,120 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% NP-40)。緩衝液抽取全細胞蛋白質。細胞混合液用超音波震碎細胞二 次，每次持續約5秒，接著用100°C沸水煮5-10分鐘，離心(13000 rpm，10 分鐘)後收集上清液，並測量蛋白質濃度。各取30μg與SDS樣本緩衝溶液混 合，利用SDS-PAGE(10% Tris-glycine-SDS-polyacrylamide) 展開後，轉移蛋 白質到nitrocellulose membrane PVDF膜上。加入primary antibodies 如(A) caspase-3, caspase-9, Bax, cytochrome c, Bcl-2, Bcl-X, Bid, (B) GRP78, AIF,
Endo G, COX4,caspase-12, Calpain 1, XIAP, ATF-6α, (C) FasL, XBP-1, TRAIL, PARP, (D) p-p53, p21, p27, p16, Chk2, b-actin。每一個樣本染色、清 洗、再以secondary antibody 染色，再做enhanced chemiluminescence(NEN Life Science Products, Boston, MA) 。
3.3.7.2 人類骨肉瘤細胞移動和轉移侵入(migration and invasion)的相關蛋白 研究
將人類骨肉瘤U-2 OS細胞以1x106 cells/well 的密度種植在6孔培養盤 上，用500μg/mL 山茱萸水粗抽處理0, 6, 12, 24, and 48 小時後，若是gallic acid 則是20或40μM (對照組單純使用溶劑DMSO)，收集細胞，用pH 7.4 的ice-cold 50 mM potassium phosphate做緩衝溶液(含有 2 mM EDTA 和 0.1% Triton X-100)。離心(13,000 rpm，10分鐘) 後收集上清液，並測量蛋白 質濃度。轉移蛋白質到nitrocellulose membrane膜上。再用對各種蛋白質具 專一性的初級抗體來辨識各蛋白質，如 anti-FAK, PKC, SOS1, MKK7, MEKK3, GRB2, NF-κB p65, COX-2, HIF-1α, PI3K, GRB2, Rho A, ROCK-1, IRE-1α, p-JNK1/2, p-ERK1/2, p-p38, Ras, p-PERK, MMP-2, MMP-9 和 VEGF,再清洗，再與 secondary antibody反應後，再用 enhanced
chemiluminescence reagent (Amersham Biosciences ECLTM)偵測。成像用 NIH Image analyzer (NIH, Bethesda, MD)分析[107, 111]。
3.3.8 Caspases之活性分析
以山茱萸水粗抽或沒食子酸處理人類骨肉瘤U-2 OS細胞經不同時間 點，收集細胞後用1×PBS清洗細胞，加入50 μl of 10 μM substrate solution caspases-3、-8、-9染劑分別為PhiPhiLux-G1D2、CaspaLux -L1D2和CaspaLux -M1D2，於37°C中避光反應1小時後，再以1X PBS洗滌，以流式細胞儀分析 檢測[107, 108]。
3.3.9 免疫螢光抗體染色與共軛焦顯微鏡檢測蛋白質轉位
人類骨肉瘤U-2 OS細胞分別加入山茱萸水粗抽或沒食子酸處理後，以 甲醇固定後，加入0.1% Triton-X 100 於PBS 20分鐘後，加入2% BSA 以阻
斷non-specific binding sites。再加入檢測AIF, Endo G, cytochrome c 和 GADD153 (green fluorescence)所需一級抗體(1：100稀釋使用)隔夜後，加入 含有螢光Fluorescein isothiocyanate (FITC-conjugated goat anti-mouse IgG at 1:100 dilution)之二級抗體後，並以DNA核酸染劑或是Mitotracker(red fluorescence)進行核或是粒線體染色，並以共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP2 Confocal Spectral Microscope)觀察蛋白質轉位的現象[107, 108]。
3.3.10 即時定量PCR基因表現分析(Real-time PCR of MMP-2 and -9 mRNA expressions)
人類骨肉瘤癌細胞放在 6-well plates，且用沒食子酸處理 24 小時，收 集細胞，萃取出total RNA，RNA樣本在 42°C reverse-transcribed 30 分鐘 (用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 遵循 protocol of the supplier (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA). 本實驗所用的primers如表 3.1 所 述。使用的系統為Biosystems 7300 Real-Time PCR system。檢測基因表現量 用comparative CT (threshold cycle) method，即Real-Time PCR測產物開始合 成(cycle number, Ct值)，基因表含量越高，則產物越早被合成，cycle number 越前面，則Ct值越低。用Ct 值便可比較出何者基因的表現量高。由Ct值可 以計算出同一樣品的基因與 β-actin表現之Ct 值差異，也就是計算ΔCt。ΔCt
的數值相差 1，則兩檢體間該基因的表現量相差 2 倍，基因表現量差異為
2-(ΔΔCt) [108, 109]。
表 3.1 本實驗用於PCR analysis 的primers
Primer name Primer sequence
homo MMP2-F CCCCAGACAGGTGATCTTGAC homo MMP2-R GCTTGCGAGGGAAGAAGTTG
homo MMP7-F GGATGGTAGCAGTCTAGGGATTAACT homo MMP7-R AGGTTGGATACATCACTGCATTAGG homo MMP9-F CGCTGGGCTTAGATCATTCC
homo MMP9-R AGGTTGGATACATCACTGCATTAGG homo GAPDH-F ACACCCACTCCTCCACCTTT
homo GAPDH-R TAGCCAAATTCGTTGTCATACC
3.3.11 細胞移動能力試驗(Would healing assay)
細胞移動能力試驗是用傷口癒合(Would healing assay)模型來呈現。將 U-2 OS 以 5×105 cells/well 的密度種植在 6 孔培養盤上，待貼盤後，以 200 μL Tip micropipette tip筆直的在孔盤中製造傷痕，再以PBS洗三次，洗去刮 除的細胞，再將培養基換為 1% FBS 的McCoy’s培養基培養，並加入不同濃 度的山茱萸水粗抽或沒食子酸，在不同時間點以倒立顯微鏡觀察紀錄及照 像細胞生長狀態。
3.3.12 基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) 活性測定- Gelatin gel zymographic assay
將以山茱萸水粗抽或沒食子酸處理的人類骨肉瘤癌細胞(5x105
cells/well)培養基上清液取出 5μl加上 5μl追蹤染劑，re-suspended 在 non reducing loading buffer中，於 37oC下水浴 15 分鐘。將樣品注入以含有 0.1%Gelatin之 10％ SDS-PAGE膠進行電泳分析(110 volt，60 分鐘)，電泳後 以re-naturing buffer 2.5％ Triton-X 100 洗去追蹤染劑，並以developing buffer
, (50 mM Tris-HCl (pH 7.8) 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl) 37oC培養 16 小時。
再以CBR(Coomassie Brilliant Blue R 250)染色，並以退染劑 (30% methanol 10% acetic acid) 退染，再掃描膠片觀察白色區塊。
3.3.13 細胞侵襲(Invasion)及轉移(Migration)能力測定
用Matrigel Cell Migration Assay 和 Invasion System來表示、研究細胞 的轉移、移動能力[112, 113]。細胞的移動能力是用transwell (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA) cell culture chambers (8 mm pore size;
Millipore, Billerica, Massachusetts, USA).人類骨肉瘤癌細胞放在serum-free medium 24小時，再trypsinized 後再將細胞放在 serum-free McCoy’s 5A medium coating， 然後置入transwell insert (5 x104 cells/well) 的 upper chamber上。再加入山茱萸水粗抽或沒食子酸，將10% FBS 加入lower chamber 靜置24到48 hours。去除upper chamber的未移動細胞。而lower chamber的移動細胞用4% formaldehyde固定，在2% ethanol用2%crystal violet 染色，再用200倍的顯微鏡記數細胞數及照像。而Invasion assay同上，只是 filter membrane 改用BioCoat Matrigel invasion kit的Matrigel coating。
3.3.14 AKT、IκB kinase (IKK)和PKC激酶測定(AKT, IjB kinase (IKK) and PKC using in vitro kinase assay)
使用peptide substrates, 包括 KGSGS GRPRTSSFAEG測AKT1，
KKKKERLLDDRHDSGLDSMKDEE 測 IKKa/CHUK 以及 Histone H1 和 lipid activator 測 PKCa， 於 base reaction 緩衝溶液 (20 mM HEPES, pH 7.5,10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.02% Brij35, 0.02 mg/ml BSA, 0.1 mM Na3VO4, 2mM DTT 和 1% DMSO)中，所有實驗步驟依照 guidline
(Reaction Biology Corp., Malvern, PA, USA). 加入 cofactors (1.5 mM CaCl2, 16 μg/ml Calmodulin,和 2 mM MnCl2)。再加入不同濃度的沒食子酸(5, 10, 20, 40 and 80 μM in DMSO).常溫下 120 分鐘，反應物放到 P81 離子交換紙 (Whatman #3698–915, Maidstone, England,United Kingdom) ，filter 用 0.1%
phosphoric acid 洗滌並計算。
3.3.15 統計分析
結果以平均值±標準差 (mean ± SD)顯示實驗結果，使用 Student’s t-test 來比較實驗組與對照組之統計差異。以p 值小於 0.05 時認定為有統計上意
義，以＊表示；p 值小於 0.01 時，以＊＊表示；p 值小於 0.001 時，以＊＊＊表示。