山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤細胞株抑制轉移

4.2.1 山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性的影響

對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞用不同濃度的山茱萸水粗抽處理(0, 50, 100, 250, 500 and 750 μg/ml) 24和48 小時,再用流式細胞儀檢測人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性，結果呈現在圖4.13，發現山茱萸水粗抽在濃度500μg/ml以前，

抑制細胞活性的效果不明顯。

圖4.13 山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性的影響

山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性的影響.與對照組比較,並 以統計分析*p<0.05為有統計意義。

4.2.2 山茱萸水粗抽抑制 U-2 OS 細胞移動的實驗

本實驗以 Wound Healing assay 觀察細胞經低濃度 (0, 250 和 500 μg/ml )山茱萸水粗抽，經 24 及 48 小時處理後對人類骨肉瘤癌細胞移動能 力之影響。使用較低濃度藥物主要是為了避免濃度太高可能會導致細胞死 亡，而影響本實驗的判讀結果。實驗結果發現，在濃度250 g/ml 及 500 g/ml 時山茱萸水粗抽均有抑制 U-2 OS 細胞移動的效果，且此效果與時間、劑量 成正相關(圖 4.14)。

圖4.14 抑制U-2 OS細胞移動的實驗 (Wound Healing assay) 山茱萸水粗抽抑制U-2 OS細胞移動的實驗 (Wound Healing assay)

4.2.3山茱萸水粗抽抑制U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞移動與轉移侵入(migration and invasion)的實驗

為檢測山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤癌細胞移動與轉移侵入能力之影 響，我們將細胞經不同濃度 (0, 250 和 500 μg/ml )山茱萸水粗抽，經24及 48小時處理後，置入 Millicell chambers(如果是細胞移動的實驗用uncoated filter；轉移侵入的實驗用 matrigel-coated filters).實驗結果呈現在圖4.15、

4.16。圖4.15顯示山茱萸水粗抽明顯抑制人類骨肉瘤癌細胞移動的能力。圖 4.16 顯示山茱萸水粗抽明顯抑制人類骨肉瘤癌細胞轉移侵入的能力。而此 兩項效果與時間、劑量成正相關。

(A)

(B)

圖4.15 抑制U-2 OS細胞移動的實驗結果

山茱萸水粗抽抑制U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞移動的實驗結果。通過 filter的細胞用crystal violet染色、照相計數。用Student’s t test分析，實驗組 與對照組比較,差異有統計意義 (*p<0.05)。

(B) (A)

圖4.16 抑制U-2 OS細胞轉移侵入的實驗結果

山茱萸水粗抽抑制U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞轉移侵入的實驗結果。通 過filter的細胞用crystal violet染色、照相計數。用Student’s t test分析，實驗 組與對照組比較,差異有統計意義 (*p<0.05)。

4.2.4 山茱萸水粗抽抑制 U-2 OS 人類骨肉瘤癌細胞 MMP-2、MMP-9 的活性 的實驗 — gelatin zymography.

用 gelatin zymography 來進行山茱萸水粗抽抑制 U-2 OS 人類骨肉瘤癌 細胞 MMP-2、MMP-9 的活性的實驗，因為癌細胞轉移時需要基質金屬蛋 白酶 (Matrix metalloproteinases)來分解細胞間質 (ECM)，細胞間質分解 後，癌細胞才能轉移出去。利用 MMP-2、MMP-9 會分解 gelatin 的特性，

MMP-2、MMP-9 活性愈強所分解的 gelatin 就會較多，依 SDS-PAGE 上被

分解的白色區塊，來判斷 MMPs 的活性強弱。實驗結果發現，細胞在各種

濃度山茱萸水粗抽誘導後，可明顯看到 MMP-9 與 MMP-2 的活性均被抑制 (圖 4.17)。可見 MMP-2、MMP-9 在 U-2 OS 人類骨肉瘤癌細胞中，被山茱 萸水粗抽 down-regulated。

圖4.17 抑制U-2 OS MMP-2、MMP-9的活性的實驗結果

山茱萸水粗抽抑制U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞MMP-2、MMP-9的活性的 實驗結果。(用densitometric analysis)

4.2.5山茱萸水粗抽影響U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞移動與轉移侵入(migration and invasion)相關蛋白的實驗結果

此實驗是用Immuno-staining和Western blotting西方墨點法來研究癌細 胞移動與轉移侵入的相關蛋白，結果呈現在圖4.18、4.19。人類骨肉瘤癌細 胞用山茱萸水粗抽處理24小時後，用Immuno-staining 得知NF-κB p65, Rho A 和 ROCK-1等蛋白在細胞質中皆被山茱萸水粗抽抑制(圖4.18)。在

Western blotting西方墨點法得知，相關蛋白如FAK, PKC, SOS1, MKK7, MEKK3, GRB2 (圖4.19A), NF-κB p65, COX-2, HIF-1α, PI3K, GRB2, Rho A, ROCK-1, IRE-1α (圖4.19B), p-JNK1/2, p-ERK1/2, p-p38, Ras, p-PERK (圖 4.19C), MMP-2, MMP-9 and VEGF (圖4.19D)等，在山茱萸水粗抽處理的細 胞都比對照組低。

(A)

(B)

圖4.18 U-2 OS細胞移動與轉移侵入相關蛋白

山茱萸水粗抽影響U-2 OS人類骨肉瘤癌細胞移動與轉移侵入(migration and invasion)相關蛋白NF-κB p65, Rho A 和 ROCK-1表現的實驗結果。

(C)

圖4.18 (續)