沒食子酸對人類骨肉瘤細胞株抑制轉移

4.3.1 沒食子酸(Gallic acid)對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性與細胞數目之影 響

人類骨肉瘤細胞用各種濃度沒食子酸(5, 10, 20 和 40μM)處理24 和 48小時.收集細胞，用PI exclusion 和流式細胞儀檢測細胞活性。將細胞用 trypan blue染色，再用Countess Automated Cell Counter (Invitrogen)來計算細 胞數目.圖4.20A 顯示用40μM 沒食子酸處理人類骨肉瘤細胞時，細胞活性 有下降 (與對照組比較在24和48小時各為86% 和78%. p< 0.05 )。圖4.20B顯 示用40μM 沒食子酸處理人類骨肉瘤細胞時，比較0-小時處理的對照組，

細胞數目有下降(p < 0.05)。

(A)

(C) (D) (B)

圖4.19 Western blotting檢測移動與轉移侵入相關蛋白

用Western blotting方法檢測山茱萸水粗抽影響U-2 OS人類骨肉瘤癌細 胞移動與轉移侵入(migration and invasion)相關蛋白表現的實驗結果。所檢 測的蛋白如下:FAK, PKC, SOS1, MKK7, MEKK3, GRB2 (A), NF-κB p65, COX-2, HIF-1α, PI3K, Rho A, ROCK-1 (B), p-JNK1/2, p-ERK1/2, p-p38, Ras, p-PERK (C), MMP-2, MMP-9 和 VEGF (D)。

圖4.20. 沒食子酸對U-2 OS細胞活性與細胞數目之影響

沒食子酸(Gallic acid)對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞活性與細胞數目之影 響。(A) 細胞活性的下降 (B)細胞數目的下降。

4.3.2 檢 測 沒 食 子 酸 (Gallic acid) 對 人 類 骨 肉 瘤 (U-2 OS) 細 胞 移 動 (Migration)及細胞轉移侵入(Invasion)的影響

本實驗以 Boyden chamber assay 觀察細胞移動的情形，以沒食子酸，經 24 及 48 小時誘導後對人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞移動及侵入能力之影響。

實驗結果發現，在濃度 20 M 及 40 M 時沒食子酸均可抑制 U-2 OS 細胞 移動及侵入的能力 (圖 4.21) 。圖 4.21 A 為 migration assay 實驗結果發現，

在濃度 20 M 及 40 M 時沒食子酸有抑制細胞移動的能地。而圖 4.21B 數 據量化為用濃度 20 M 及 40 M 的沒食子酸處理，其抑制率分別為 40–

84% 和 60–92%。圖 4.21C 為 invasion assay 實驗結果發現，對照組在沒 有沒食子酸存在時，人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞會由 upper chamber 跑到 lower chamber。再有沒食子酸存在時，此種 invasion 會被抑制。其抑制率

在濃度 20 M 及 40 M 的沒食子酸處理時，其抑制率分別為 60–90% 和 66–94%。

圖4.21 沒食子酸對U-2 OS細胞移動及轉移侵入的影響

檢測沒食子酸(Gallic acid)對人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞移動 (Migration) 及細胞轉移侵入(Invasion)的影響。A、B 為migration assay。C、D為 invasion assay 。

4.3.3 基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) 活性測定- Gelatin gel zymographic assay

癌細胞轉移時需要基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases)來分解 細胞間質 (ECM)，利用MMP-2、MMP-9會分解gelatin的特性，進行gelatin zymography試驗，活性強所分解的gelatin就會較多，依SDS-PAGE上被分解

的白色區塊，來判斷MMPs的活性強弱。實驗結果發現，細胞在濃度10、20、

30及40 M的沒食子酸誘導24和48小時後，可明顯看到MMP-9與MMP-2的 活性均被抑制(圖4.22)。

圖4.22 MMPs活性測定

基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) 活性測定。實驗結 果發現，細胞在濃度10、20、30及40 M的沒食子酸誘導24和48小時後，可 明顯看到MMP-9與MMP-2的活性均被抑制。MMP-9與MMP-2的活性由NIH ImageJ 軟體量化。實驗各做三次求其平均值與標準差。

4.3.4 檢測沒食子酸對 U-2 OS 細胞株藉由西方點墨法分析細胞轉移相關蛋 白活性檢測

沒食子酸以濃度20及40 μM處理人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞，經24小時 之後，收集細胞，以西方點墨法檢測得知，人類骨肉瘤細胞經沒食子酸處 理後，一些轉移相關蛋白活性被抑制。如 GRB2, PI3K, AKT, PKC, NF-jB p65 (圖4.23 A), p38,ERK1/2, JNK, MMP-2, MMP-9 (圖4.23 B), p-p38,

p-ERK1/2 and p-JNK (圖4.23 C)。ERK signaling 可up-regulate MMPs的表 現；而沒食子酸可抑制ERK1/2 (圖4.23 B), p-ERK1/2 (圖4.23C) 和

AKT/PKB (圖4.23A), 可知沒食子酸可抑制人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞的 ERK 和 PI3K/AKT signaling pathways 。

p38, JNK, ERK1/2 和 PI3K/AKT 與蛋白質磷酸化有關，由圖4.23C 得 知沒食子酸可抑制人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞的p-p38, p-ERK1/2 和

p-JNK 。由圖4.23D 得知沒食子酸可抑制人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞MMP-2 和 MMP-9的mRNA表現，且與濃度成正相關。而此又由圖4.22 的gelatin zymographic 和 Western blotting analyses 確認。綜上所述我們可說沒食子 酸可抑制人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞MMP-2 和 MMP-9的蛋白質和mRNA 的level表現 。

4.3.5 . 沒食子酸(Gallic acid)影響人類骨肉瘤(U-2 OS) 細胞AKT/PKB、IKK 及PKC激酶活性下降之表現

U-2 OS細胞經不同濃度沒食子酸(0、5、10、20、40和80 μM)處理6小 時後，收集細胞，以kinase assay檢測沒食子酸對AKT/PKB、IKK及PKC激 酶活性的表現結果呈現在圖4.24。當沒食子酸在濃度為10, 20, 40 and 80μM 時會抑制AKT/PKB活性(圖4.24A). 當沒食子酸在濃度為20, 40 and 80μM 時會抑制IKK活性(圖4.24B), 當沒食子酸在濃度為5,10, 20, 40 and 80μM時 會抑制PKC活性(圖4.24C).。

圖4.23 . 沒食子酸對U-2 OS轉移相關蛋白活性和基因表現檢測 沒食子酸對U-2 OS細胞轉移相關蛋白活性和基因表現檢測。我們用 SDS–PAGE 和 Western blotting檢測(A) GRB2, PI3K, AKT, PKC, NF-jB p65, (B) p38, ERK1/2, JNK, MMP-2, MMP-9, (C) p-p38, p-ERK1/2 和

p-JNK 。 (D) 圖中我們測MMP-2, -7, -9 的基因level 表現，做三次求其平 均值 ± 標準差， p < 0.05 為統計有意義。

圖4.24 U-2 OS細胞株AKT、IKK及PKC激酶活性下降之表現

沒食子酸(Gallic acid)影響U-2 OS細胞株AKT、IKK及PKC激酶活性下 降之表現。不同濃度沒食子酸(0、5、10、20、40和80 μM)處理人類骨肉瘤 (U-2 OS) 細胞後，檢測AKT/PKB (A),IKK (B)和 PKC (C)的活性做三次實驗 求其平均值 ± 標準差， p < 0.05 為統計有意義。

綜合以上所述，我們提出沒食子酸(Gallic acid)可能抑制 U-2 OS 細胞 株細胞轉移的機轉(圖 4.25)。

圖 4.25 沒食子酸(Gallic acid)可能抑制 U-2 OS 細胞株細胞轉移的機轉