第四章 結果
4.1 山茱萸水粗抽使人類骨肉瘤細胞凋亡
4.1.1 山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞生長之影響
人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞經不同濃度(250, 500, 1000, 1250, 2000, 2500 和 3000 μg/ml)山茱萸水粗抽處理後，以流式細胞儀與 PI 染色評估山茱萸水 粗抽對 U-2 OS 細胞活性抑制的作用。從加藥 48 小時開始，結果顯示，山 茱萸水粗抽毒殺細胞的效果，是隨其濃度(250, 500, 1000, 1250, 2000, 2500 和 3000 μg/ml）增加而漸強。數據以三重覆求得平均值與標準差(圖 4.1)。
圖 4.1 人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞經山茱萸水粗抽處理後之細胞活性
4.1.2 山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤(U-2 OS)細胞週期之影響
利用流式細胞儀分析細胞內 DNA 含量，藉以判斷細胞週期的分布。當 U-2 OS 細胞以不同濃度(0, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 and 4000 μg/ml)的山茱萸水粗抽誘導後，DNA 含量可由流式細胞儀圖 譜觀察到，不同濃度山茱萸水粗抽處理 48 小時後，sub-G1 期會增加，也經
山茱萸水粗抽以不同濃度(0, 500, 1000, 1500, 2500 and 4000 μg/ml)處理 U-2 OS 細胞，經 48 小時後，收集細胞，利用慧星試驗(Comet assay)及 DAPI 染色情形，觀察細胞受損的情形，在慧星試驗(Comet assay)中可以觀察到，
隨著濃度的增加，細胞拖尾的情形愈明顯(圖 4.3)；而 DAPI 染色中隨著濃 度的增加，可以觀察到細胞核有凝集的現象(圖 4.4)。
4.1.4 檢測山茱萸水粗抽對U-2 OS細胞株引起ROS產生,鈣離子釋放(Ca2+)和 降低粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential, ΔΨm)分析與檢測
山茱萸水粗抽以 2500 μg/ml濃度處理U-2 OS細胞，經不同時間之後，
收集細胞，檢測ROS、levels of ΔΨm 和Ca2+ 各以DCFH-DA, DiOC6 和 Indo 1/AM為螢光染劑染色，經過流式細胞儀檢測實驗得知，ROS、Ca2+在 細胞內的表現量經過山茱萸水粗抽處理後，在時間越久有釋放情形(圖 4.5A、C)。膜電位在分子探針在細胞內的表現量，經過不同時間測 6, 12, 24 和 48 小時後，有下降情形(圖 4.5C)。數據以三重覆求得平均值與標準差，
並以student’s t-test統計分析，*p<0.05 為有統計意義。
圖 4.2 山茱萸水粗抽對人類骨肉瘤細胞週期之影響
山茱萸水粗抽影響 U-2 OS 細胞週期分布與凋亡細胞(sub-G1 phase) 分布，0 小時處理為對照組，*p <0.05 為統計上有意義。
圖4.3 Comet assay 檢測 DNA 受損的情形
Comet assay 檢測山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株引起 DNA 受損的情形，
隨著濃度的增加，細胞拖尾的情形愈明顯，0 小時處理為對照組，*p <0.05 為統計上有意義。
圖 4.4 DAPI 染色檢測 DNA 受損的情形
DAPI 染色檢測山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株引起 DNA 受損的情 形，隨著濃度的增加，細胞核濃染的情形愈明顯，0 小時處理為對照組，*p
<0.05 為統計上有意義。
圖 4.5 ROS產生,鈣離子釋放(Ca2+)和降低粒線體膜電位
檢測山茱萸水粗抽對U-2 OS細胞株引起ROS產生,鈣離子釋放(Ca2+)和 降低粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential, ΔΨm)分析與檢測
4.1.5 檢測山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 活性 的影響
人類骨肉瘤癌細胞先用 caspase-3, -8 和 -9 的 inhibitors 先處理，再用 2500 μg/ml 的山茱萸水粗抽處理，收集細胞染色(caspase-3, caspase-8，和 caapase-9 各用 PhiPhiLux-G1D1, CaspaLux-L1D2 和 CaspaLux- M1D2)，再 用流式細胞儀檢測 caspase-3, -8 和 -9 的活性與細胞的活性。由圖 4.6，以 及圖 4.7 加入 caspase inhibitor(caspase-3 的 inhibitor 為
Z-DEVD-FMK ,caspase-8 的 inhibitor 為 Z-IETD-FMK,caspase-9 的 inhibitor 為 Z-LEHD-FMK,pan-caspase inhibitor 為 Z-VAD-FMK)的結果得知，山茱萸 水粗抽可以增加 caspase-3, caspase-8，和 caapase-9 的活性；加入 caspase inhibitor 後，山茱萸水粗抽處理細胞活性又增加。由此可知 caspase-3, caspase-8，和 caapase-9 確實參與影響山茱萸水粗抽處理人類骨肉瘤癌細胞 的凋亡。
圖 4.6 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 活性的影響
檢測山茱萸水粗抽對U-2 OS 細胞 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 活性 的影響。求平均值與標準差，並以統計分析*p<0.05 為有統計意義。
圖 4.7 加入 Caspase inhibitor
檢測山茱萸水粗抽對U-2 OS 細胞 Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 活性 的影響(加入 caspase inhibitor)。求平均值與標準差，並以統計分析*p<0.05 為有統計意義。(0 小時處理為對照組)
4.1.6 檢測山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株藉由西方點墨法分析細胞凋亡相 關蛋白活性檢測
山茱萸水粗抽以濃度2500 μg/ml處理U-2 OS細胞，經6, 12, 24和48小時 之後，收集細胞，以西方點墨法檢測得知，細胞經山茱萸水粗抽處理後，
對caspase-3, caspase-9, Bax, cytochrome c, GRP78, AIF, ATF-6α, Fas, TRAIL, p21, p27, p16等protein level 有up-regulated的作用。(圖4.8)
(C) (D) (A) (B)
圖 4.8 細胞周期停滯與細胞凋亡相關蛋白活性檢測
山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株藉由西方點墨法分析影響細胞週期停
滯與細胞凋亡相關蛋白活性檢測
4.1.7 檢測山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株以免疫螢光染色檢測 AIF、 Endo G、cytochrome c 和 GADD153 蛋白釋放轉位情形
檢測是否 AIF, Endo G, cytochrome c 和 GADD153 有參與山茱萸水粗 抽造成 U-2 OS 細胞凋亡,我們用山茱萸水粗抽以濃度 2500 μg/ml 處理 U-2 OS 細胞，經 48 小時之後，收集細胞，以免疫螢光染色檢測,發現 AIF, Endo G, cytochrome c 和 GADD153 有蛋白釋放轉位情形,與對照組比較,在細胞 質中皆有增加的情形(圖 4.9 ~12)
圖 4.9 檢測 AIF 蛋白釋放轉位情形
山茱萸水粗抽對U-2 OS 細胞株以免疫螢光染色檢測 AIF 蛋白釋放轉位情形
圖 4.10 檢測 Endo G 蛋白釋放轉位情形
山茱萸水粗抽對 U-2 OS 細胞株以免疫螢光染色檢測 Endo G 蛋白釋放轉位 情形
圖 4.11 檢測 GADD153 蛋白釋放轉位情形
山茱萸水粗抽對U-2 OS 細胞株以免疫螢光染色檢測 GADD153 蛋白釋放轉 位情形
圖 4.12 檢測 cytochrome c 蛋白釋放轉位情形
山茱萸水粗抽對U-2 OS 細胞株以免疫螢光染色檢測 cytochrome c 蛋白釋 放轉位情形