第二章 BIA 應用於癌細胞酵素-MAT 抑制活性之篩選
第二節 實驗儀器與材料
1. BIACORE X ，Pharmacia 公司
2. 振動混合器（votex），BoEco Germany 公司 3. 乾浴加熱器，真興實業有限公司
2-2 材料與試劑：
1. sensor chip CM5 2. HBS buffer
3. N-hydroxy succinimide （NHS）
4. N-ethyl-N-（3-diethlaminopropyl）carbodimide（EDC）
5. Ethanolamine hydrochloride 6. Met（甲硫胺酸, Methionine）
以上材料、試劑均購自 Pharmacia 公司 7. 緩衝溶液 pH 7.0（TES, MgCl
2
, DTT, KCl）8. ATP，購自美國 Sigma 公司
9. 癌細胞 MAT 酵素，由本校郭盛助教授之實驗室製備
10. HP 類緣化合物（HP1~HP6），由本校藥化所涂源善博士所合成
第三節 MAT 抑制活性測試實驗設計一
在 BIAcore 感應晶片上並固定有任何分子的情況下，來觀察不同 分子與感應晶片上 dextran 之間的非特異性分子相互作用
3-1 實驗方法
3-1-1 感應晶片與標的化合物（HP1、HP2）間結合反應測試：
將 BIAcore 定溫於 25℃且維持在恆定流速 10 ìl/min 的緩衝溶液 中，將含有 10 ìl 100 ìM ATP，10 ìl X/2 濃度的癌細胞 MAT 酵素，
10 ìl 100 ìM Met 及 30 ìl dH
2
O 之反應混合液用 votex 混合器混合均 勻，並且放在 37℃的乾浴加熱器中培養 10 分鐘中，注入 CM5 感應 晶片的表面，作為控制組。另外再配製各種不同濃度的標的化合物（HP1 或 HP2）分別加入 上述同樣混合液中用 votex 混合器混合均勻，並且放在 37℃的乾浴加 熱器中培養 10 分鐘中，再注入 CM5 感應晶片表面。
觀察 RU 值變化，將各種濃度標的物所顯示之 RU 值除以控制組 之 RU 值所得之百分率作為評估其抑制之效應。
3-2 實驗結果與討論
兩種經設計合成之胜月太衍生物 HP1、HP2 不同濃度在感應晶片尚 未固定有任何分子的情況測試結果，由表 2-1、2-2 中，比較 RU 百分 率，發現這兩種標的物與感應晶片的表面之間的反應無劑量相關性，
沒有很強的非特異性結合，反應訊號無線性關係，因此無法用此未處 理過之晶片來偵測標的物真正抑制 MAT 之效果，所以實驗二的設計 為將 Fc1 之表面作為控制組表面，而 Fc2 之表面固定上特殊設計的鍵 合物使成為具有專一性的表面。從三個主要反應物：ATP、癌細胞 MAT 酵素、Met 中，選擇具有 –COOH 與-NH2 官能基的 Met 當作固 定於感應晶片表面之鍵合物，如此一來即能監測癌細胞 MAT 酵素複 合物與固定在感應晶片上 Met 之間相互作用，並進一步測試任何合成 的化合物對於癌細胞 MAT 酵素之抑制活性。
第四節 MAT 抑制活性測試實驗設計二
利用生物分子之間相互作用的技術（Biomolecular interaction analysis；BIA）,來觀察 MAT 酵素與固定有 Met 的感應晶片之間相互 作用。
4-1 實驗方法
4-1-1 固定有 Met 之感應晶片之製備：
將 BIAcore 定溫於 37℃且維持在恆定流速為 5 ìl/min 的 HBS 緩 衝溶液中。再將比例為 1：1（v/v）的 0.05M N-hydroxy succinimide
（NHS）和 0.2M N-ethyl-N-（3-diethlaminopropyl）carbodimide（EDC）
混合液用 votex 混合器混合均勻，注入感應晶片達 7 分鐘，以使晶片 上面的-COOH 基活化，完成活化後必須在 3 分鐘內注入 2mM 的 Met，經 13 分鐘後即可獲得表層固定有 Met 之感應晶片。此時可以視 RU 的上升值而決定是否需再注入 Met，否則就必須做覆蓋的動作，
即注入 0.1M Ethanolamine hydrochloride 7分鐘來覆蓋住未與 Met結合 之具有活性的-COOH 基，如此固定有 Met 之感應晶片即完成。（如圖 2-1 所示）
4-1-2 固定有 Met 之感應晶片與 Met、標的化合物（ HP1~HP6）結合 反應測試：
將 BIAcore 定溫於 37℃且維持在恆定流速為 5 ìl/min，pH 7.0 的 緩溶液中，為了模擬藥物在人體中的情形，所以實驗設計的條件盡量 模擬體內的環境。另外，在做每一管樣品之前都必須做固定 Met 於感 應晶片的動作，之後再將含有將含有 10μl 1mM ATP，10μl X 濃度的 癌細胞 MAT 酵素及 80 ìl buffer 之反應混合液，總體積為 100μl，用 votex 混合均勻，並且放在 37℃的乾浴加熱器中培養 10 分鐘中，注入 已經固定有 Met 的感應晶片之 Fc1，作為不含有抑制物之控制組。
另外分別取含有各種不同濃度的 Met 10μl（2mM、1mM、1/2mM、
1/4mM）、各種不同的標的化合物（ HP1~HP6）1mM 加入上述同樣混 合液中，此時 buffer 取 70 ìl，使得總體積仍維持 100 ìl，用 votex 混 合均勻，並且放在 37℃的乾浴加熱器中培養 10 分鐘中，注入感應晶 片之 Fc2，作為含有外加待測抑制物之實驗組。
每次測試完畢，為了去除殘留於晶片上的未結合試劑或一些其他 物質的非特異性結合，必須注入 1.2mM HCl清洗，再用 pH 7.0 的緩 衝溶液以 5 ìl/min 的恆定流速清洗 10 分鐘。
4-2 實驗結果與討論
（一）固定 Met 之感應晶片與 Met、ATP 及癌細胞 MAT 酵素之作用 反應
固定有 Met 之感應晶片與 ATP、癌細胞 MAT 酵素混合液且包含 有不同濃度之 Met 作用，結果如表 2-3 所示，其中 Fc1 的數據是表示 未加入 Met，單獨只有 ATP 與癌細胞 MAT 酵素及緩衝溶液的反應混 合液做為對照組，而 Fc2 數據表示反應混合液再加上不同濃度的 Met 反應的結果。以 Met 1mM 為例，如圖 2-2 所示，則 Fc2/Fc1（RU%）
百分率就代表該 Met 對癌細胞 MAT 酵素的反應作用。從表 2-3 中可 以看出隨著 Met 濃度的增加，RU%的值下降，這樣的結果說明了 ATP、癌細胞 MAT 酵素、Met 三者之間是有相互結合的反應。癌細胞 酵素中若是因有其他物質的非特異性結合而引起 RU 值之上升，則數 值應呈現出不規則之跳動，也就是並不會隨濃度的變化而有一致相關 性，相對地從結果中卻發現隨 Met 濃度的增加而 RU%下降，顯示外 加之 Met 會競爭掉感應晶片上 Met 與 ATP 和癌細胞 MAT 酵素的結合 能力。因此，如果測試其它可能有抑制效應的物質，若有著隨著抑制 物濃度的上升，RU%下降之結果，即可說明此抑制物有與癌細胞酵 素 MAT 作用抑制癌細胞 MAT 酵素之潛力。
（二）癌細胞 MAT 酵素抑制活性篩選
HP1~HP6 等受測試樣品對 MAT 之抑制活性之評估乃利用同樣實 驗流程。只是換成 HP1~HP6 等樣品加入反應混合液中以測試其抑制 活性，其結果以 HP1 為例，如圖 2-3 所示。單獨使用反應混合液即 ATP 與癌細胞 MAT 酵素及 buffer 與另外加入 HP1~HP6 等受測試樣品 的反應混合液之 RU 值變化分別以 RU1 和 RU2 表示，則 RU2/RU1 百分率就代表 HP 對癌細胞 MAT 酵素之抑制活性。全部 HP1~HP6 樣 品都以此方式評估，其結果整理於表 2-4。百分比越小表示受試的樣 品與癌細胞 MAT 酵素與 Met 之間相互作用影響越明顯，結果為：
HP6>HP3>HP1>HP4>HP5>HP2，顯示出 HP6 有較好的抑制活性。由 於利用 BIA 的 SPR 技術做為評估 MAT 抑制活性的篩選迄今尚未有文 獻報導，但是我們成功的利用 Met 固定於感應晶片的設計，篩選出具 有抑制效應的物質，再進一步做傳統 MAT 抑制活性試驗（33）以確認其 與癌細胞酵素 MAT 之間的交互作用。
這個實驗能夠證明我們可以利用BIA之技術來輔助傳統測試藥理 的方法，減少傳統的放射線方法較費時以及潛在之危險性，快速的篩 選出有潛力的藥物。
表 2-1 HP1 不同濃度與 MAT、Met、ATP 混合後注入感應晶片表面
表 2-3 Met 不同濃度與 MAT、ATP 混合後注入 Met 之感應晶片之反
RU1(Fc1) RU2(Fc2)
RU%
圖 2-1 Met 固定於 CM5 感應晶片之感應圖。(a)階段活化，注入 EDC/NHS 活化晶片表面，(b)階段固定 Met，(c)階段去活化，注入 Ethanolamine hydrochloride。
14800 16800 18800 20800 22800 24800 26800 28800 30800
0 500 1000 1500 2000 2500
Time s
Response
RU
(a)
(b)
(c)
19000
18000
450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400
Time s
500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
Time s
第三章 BIA 應用於 Grb2 SH2 domain 抑制物之篩選
第一節 研究動機與目的
Src homology-2（SH2）domain 對於細胞訊息的傳導扮演了一個 重要的角色（34），它能夠辨識一段直線形且含有 pTyr 的蛋白質（35），因 此會與磷酸化的生長因子或磷酸化的蛋白質結合，負責調節細胞內的 訊息。生長因子接受器結合蛋白（Growth factor receptor-bound protein, Grb2）是一個 25 KDa 的細胞內連結蛋白(adaptor protein)，
包含一個 SH2 domain 以及兩個 SH3domain（36）。其中 Grb2 SH2 domain 會辨識包含有 pTyr 的連結蛋白 SHC（36）以及生長因子接受器（例如 Receptor Tyrosine Kinase, RTK）（37）。當 RTK 被活化之後，接受器上 的 Tyr 殘基會自動磷酸化（autophosphorylation）（38），而 Grb2 SH2 即能辨識此磷酸化的 RTK 進而與之結合，SH2 domain 與 RTK 的結合親 合力，約 K
D
=10~100nM（35）。SH2 domain 與 RTK 的結合後，會造成整個 蛋白質構形的改變，進而與其他的蛋白連接（39），活化下游 Ras 訊號 的傳導，造成細胞的有絲分裂（40）。RTK 之變異或是過度表現被發現和 多種癌症或細胞增生方面的疾病有關（41）。因此若能阻斷 SH2 domain 與包含 pTry 殘基的區塊之間之相互作用或許能抑制活化後即磷酸化的 RTK 接受器與 Grb2 SH2 的結合，進而阻斷 Ras 訊號的傳導。如此 將可針對因 Ras 路徑所引起之癌症並探討其反應機轉，以研發治療用 的藥物。