第二章 BIA 應用於癌細胞酵素-MAT 抑制活性之篩選
第四節 實驗結果與討論
我們從 E.coli 中大量表現並純化 MutS 與 MutS 變異蛋白-D14N、
D14A、H16G，產生足夠的產量來對於其與 AdoCb1 以及 AdoCbi 間 結合性的相關研究。
MutE、MutS 與 AdoCb1 必須在三者皆存在的情況下，才能形成 酵素複合物- Glutamate mutase，即 MutE 與 MutS 的結合需要有 AdoCb1 的幫助（
56
），缺乏其中一者則另兩者將不會結合（51
），或者結 合能力非常弱，從表 4-1 中證實了這樣的結果。MutS 與 AdoCb1 的結 合（圖 4-7）能力在缺乏 MutE 的情況下 Kd
值大於 500μM，但是當 MutS 與 AdoCbi 做結合測試時（圖 4-8），卻發現兩者的結合相對上是 較容易的，其 Kd
值 15.4 ±1.6μM（表 4-1）與先前 MutS 與 AdoCb1 的 Kd
值相比是它的 30 倍以上，所以 AdoCbi 在缺乏 corrin 環中 D 環 上側鍊尾端的 dimethybenzimidizole 的阻礙下，能順利且容易的與 MutS 鍵結，因而推測藉由 MutE 與 MutS 之間的交互作用能將 AdoCb1 的尾端移開，使得 MutS 與 AdoCb1 結合。至於 MutE 與 MutS 在結合 之 後 所 引 起 的 蛋 白 質 三 級 結 構 的 改 變 ， 即 如 何 將 AdoCb1 的 dimethybenzimidizole 尾端移開，其原因有待探討。當 MutS 與 AdoCbi 結 合 時 ， MutS 上 的 His 殘 基 會 取 代 dimethybenzimidizole 而與鈷元素鍵結（
57,59
），且與 His 鄰近的殘基-Asp會與 His 間形成氫鍵，此氫鍵的形成有助於穩定鈷元素與 His 的結合
（如圖 4-2）（
60
），這樣的結構：鈷-His-Asp 引起探討的興趣。因此本 實驗將 MutS 上的 His 替換成 Gly 即 MutS-H16G，Gly 是一個最簡單 結構的胺基酸，其側鍊只有一個氫原子，當測試 MutS-H16G 與 AdoCbi 兩者間的結合（圖 4-9）反應時從結果（表 4-2）發現測試所用之 AdoCbi 之最大濃度不足以有效測量其與 MutS-H16G 的結合能力，Kd
> 400 μM，與 MutS 及 AdoCbi 結合之 Kd
值相比有 25 倍的增加，因此這樣 的結果證明缺乏 His 的 MutS 會嚴重影響 MutS 與 AdoCbi 之結合，所 以 His 有其存在的必要性。另外，對於是否因 Asp 與 His 間的鍵結而增加穩定 His 與鈷元素 的結合之探討中將 MutS 上的 Asp 替換為 Gln、Ala 即 MutS-D14N 與 MutS-D14A；Gln 的結構與 Asp 相似而 Ala 與 Asp 的結構差異甚多，
但置換的兩者與 His 間皆不會有鍵結的產生，當測試 MutS-D14N、
MutS-D14A 與 AdoCbi 結合(圖 4-10、4-11)反應時從結果（表 4-2）中 得知兩者與 AdoCbi 的結合能力明顯下降很多，由於兩者 K
d
的誤差值 皆過大是沒辦法以數據清楚說明兩者在結構上對於 His 的影響，但是 整體看來，當 MutS 上的 Asp 因被置換，使得 His 與鈷元素間的結合 受影響進而降低 MutS 變異蛋白與 AdoCbi 的結合，因此仍然可以顯 露出 Asp 與 His 間的相互作用對於 His 與鈷元素間有穩定的效果。本實驗亦嘗試了解 pH 值的改變對 AdoCbl 結合的影響，測試結果 如表 4-2 所示，MutS 和 MutS 變異蛋白與 AdoCbi的結合能力在 pH 7.0 時比 pH 8.5 佳，根據文獻（
61
）所載：Glutamate mutase 的最適反應 pH 值為 8.5，與本實驗觀察結果並不相符，其原因可能在於 MutE 存在 與否，整個酵素複合體是由 MutS、MutE 與 AdoCb1 三者的結合，而 AdoCb1 被 MutS 與 MutE 包夾其中，因此單獨 MutS 與 AdoCb1 之間 結合受緩衝溶液 pH 值影響應遠小於三者結合時受緩衝溶液之影響。這個實驗證明了可以利用 BIA 的 SPR 技術建立分子結構與功能 性的相關研究，是一個相當實用且迅速的測試方法，不僅能監測分子 與分子間的結合，對於蛋白質中單個胺基酸的改變對蛋白質與其他分 子結合功能的影響也能做探討，因此能從以上的方法結果提供一個對 於蛋白質與蛋白質間相互作用以及蛋白質構形研究的新方向。
表 4-1 MutS 與 AdoCbl、AdoCbi 結合反應之測試結果
MutS MutS-H16G MutS-D14N MutS-D14A RU 值 RU 值 RU 值 RU 值
pH7.0 pH8.5 pH7.0 pH8.5 pH7.0 pH8.5 150 31.8 12.8 400 42.3 29.3 187.7 102.7 100 65.5
O NH
2AdoCbl (coenzyme B 12 ) AdoCbi
圖 4-1 維生素 B
12
-AdoCbl 與維生素 B12
類似物-AdoCbi 之結構圖。圖 A 為維生素 B12
輔脢-AdoCb1 之結構；圖 B 為 AooCb1 類似物 AdoCbi 之結構，缺少 corrin 環中 D 環上之側鏈尾端 dimethybenzimidizole。A B
圖 4-2 glutamate mutase 之結構圖，是由次單位 MutE、次單位 MutS 與維 生素 B
12
輔脢-AdoCb1 三者結合而成，MutS 之 His 16 殘基會與 AdoCb1 之鈷元素鍵結，且 His16 與 Asp 14 之間有氫鍵的形成。N N
O H O
N N N
N NH 2 O
OH HO
H H
His 16
N N
Asp 14
Co
+3
S subunit (14 kDa) E subunit
(53.7 kDa)
0
M.W. 1 2 3 4 5 6
( kDa )
圖 4-5 MutS 蛋白質純化。每一步純化之結果以 SDS-PAGE 顯示之：Lane 1，
蛋白質 marker，其分子量標示在左邊；經 IPTG 誘導下，可以觀察 到在經誘導的萃取物中（Lane 3）和不經誘導的控制組（Lane 2）
比較，出現一個 14800 Da 的蛋白質產物；Lane 4，硫酸胺沉澱；
Lane 5，離子交換；Lane 6，膠體過濾。
97.4 66.2 57.5 45.0 36.0
24.0 19.7/20.5
14.4
16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000 34000 36000
0 500 1000 1500 2000 2500
Time s
Response
RU
圖 4-6 MutS 固定於感應晶片 CM5 之感應圖。(a)階段活化，注入 EDC/NHS 活化晶片表面，(b)階段固定蛋白質，注入 50 mM MutS，(c)階段去 活化，注入 Ethanolamine hydrochloride
(a)
(b)
(c)
0
B12 500uM B12 400uM B12 300uM B12 200uM B12 100uM
圖 4-7 MutS 蛋白質與不同濃度 AdoCb1 之結合反應。
Ado Cbi 150uM Ado Cbi 100uM Ado Cbi 50uM Ado Cbi 25uM Ado Cbi 10uM
圖 4-8 MutS 蛋白質與不同濃度 AdoCbi 之結合反應。
0
AdoCbi 400 uM AdoCbi 300 uM AdoCbi 200 uM AdoCbi 100 uM AdoCbi 50 uM
圖 4-9 MutS-H16G 蛋白質與不同濃度 AdoCbi 之結合反應（pH=7.0）
AdoCbi 400 uM AdoCbi 300 uM AdoCbi 200 uM AdoCbi 100 uM AdoCbi 50 uM
圖 4-10 MutS-D14N 蛋白質與不同濃度 AdoCbi 之結合反應（pH=7.0）
AdoCbi 400 uM AdoCbi 300 uM AdoCbi 200 uM AdoCbi 100 uM AdoCbi 50 uM
圖 4-11 MutS-D14A 蛋白質與不同濃度 AdoCbi 之結合反應（pH=7.0）