MutS 及 MutS 變異蛋白的生產與純化

1. 高溫高壓滅菌釜，宏霖儀器股份有限公司 型號 HL340 2. 恆溫振盪培養箱，Firstek Scientific 型號 S300R

3. 高速離心機，美商貝克曼儀器有限公司 型號 J2MC 4. 超音波震盪器，MSI 型號 SONIPREP 150

5. 離子交換管柱（2.6×20-cm Q-Sepharose Fast Flow anion-exchange column），Pharmacia 股份有限公司

6. 膠體過濾管柱（2.6×90-cm Sephacry S-200-HR gel fittration column），Pharmacia 股份有限公司

2-2 材料與試劑：

1.菌體（MutS、MutS mutations），由陳灝平教授提供 2. Ampicillin（amp），購自生工有限公司

3. Isopropylyphio -β-D-galactoside（IPTG），購自生工有限公司 4. 1.4-Dithiothreitol（DTT），購自生工有限公司

5. 硫酸銨，購自生工有限公司

6. 磷酸鉀緩衝液 (Potassium phosphate buffer) pH 7.0，購自默克公司 7. PM3 蛋白濃縮過濾膜，購自 Millipore 公司

2-3 實驗方法

（a）培養液（LB medium）的配製

取 50g tryptone、25g Yeast、50g NaCl與 2.5ml NaOH 加水至 5L，

攪拌均勻，分裝至 4 個體積 2L 的三角錐瓶中，使每一瓶中含有 1.2L 的培養液，將剩餘的 200ml 的培養液放置於體積 1L 的三角錐瓶中，

並將全數放入滅菌箱內，以 1.2 大氣壓、121℃滅菌 20 分鐘。

（b）菌體的培養

所有的培養液皆含 100μg/ml 的 Ampicillin，取菌液 200μl 接種 於有 5ml 培養液的試管內，放入 37℃、200 轉/min，振盪培養箱中培 養，隔夜培養後，取出試管中的菌液 2ml，接種於 200ml 的培養液內，

放回 37℃，振盪培養 4 小時，之後，再將 200ml 的菌液平均到入 4 個三角錐瓶，每瓶有 1.2L 的培養液內，培養至 OD 值達 0.6~0.8 時，

於每瓶中加入 0.6 mM IPTG 以誘導蛋白質的產生，再放回 37℃，振 盪培養 4 小時後，將已大量表現蛋白質的菌體以離心的方法（12000 xg，10 分鐘）收集。

（c）超音波震盪

將收集到的菌體以 50 mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 5mM DTT 使其重新懸浮，並用玻璃棒儘量使大塊菌體溶解。使用超音波震盪

器，打破菌體，使菌體內的蛋白質流出。因此為避免因超音波震盪器 使用時產生的高熱造成蛋白質的變性，所以於每次打 1 分鐘後停頓 1~2 分鐘，重複 6~7 次後，離心（40000 xg，20 分鐘），取上清液，此 上清液為蛋白質粗萃取液。

（d）硫酸銨沉澱

將離心後的粗萃取液使其濃度到達 40%，即量測粗萃取液之體 積，加入硫酸胺晶體，離心（40000 xg，20 分鐘），取上清液；在加 入硫酸胺晶體時，需緩慢加入並持續加以攪拌，待硫酸胺晶體完全加 入後，再攪拌 15~20 分鐘，離心。若此時晶體還未完全溶解，再繼續 攪拌至完全溶解為止。量測上清液體積再加入硫酸胺晶體使其濃度到 達 80%，離心（40000 xg，20 分鐘），去上清液，此時蛋白質已被沉 澱下來。

（e）透析

先準備透析液 2L 的 1 mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 1mM DTT 放入冰箱預冷，吸取少量透析液將經硫酸胺沉澱的粗蛋白質重新溶 解，倒入透析袋中放入 2L 的透析液內，透析一晚（overnight）。

（f）離子交換

離子交換管柱必須先以 10 mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 1mM

DTT 平衡之。將已透析一晚的粗蛋白液離心（40000 xg，20 分鐘）， 移去不溶的沉澱物後，通入管柱。先以 10 mM磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內 含 1mM DTT 沖提 100ml，再改以濃度為 50mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 1mM DTT 沖提 400ml ，以流速 2 ml/min，每 6ml 收集一管。並 以波長為 280nm 的 UV 光測量收集到的每一管溶液的 OD 值，以 MutS 為例（圖 4-3），找出主峰即為粗蛋白質所在，並以 SDS-PAGE 確定 之。

將含有粗蛋白質的溶液全數收集，以氮氣加壓的方式加以過濾濃 縮，將體積濃縮至 10~15ml，濃縮所使用的過濾膜為 PM3，可使分子 量小於 3 kDa 的物質通過。

（g）膠體過濾

膠體過濾管柱必須先以 50 mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 1mM DTT 平衡之。將濃縮好的粗蛋白液通入管柱內，再以 50 mM 磷酸鉀 緩衝液 pH 7.0 內含 1mM DTT 以重力的方式沖提，將沖提出來的液 體以每 100 滴收集一管，並以波長 280nm 的 UV 光測量每一管溶液的 OD 值，以 MutS 為例（圖 4-4），其中的一支主峰即為純蛋白質所在，

並以 SDS-PAGE 確定之。

將含有純蛋白質的溶液全數收集，以氮氣加壓的方式加以過濾濃

積的甘油混合均勻，即可放入-20℃冰箱內保存。

MutS 的吸光係數為 9380 cm

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MutS 以 及 MutS 的 三 種 突 變 蛋 白 ： MutS-D14N、 MutS-D14A、

MutS-H16G 皆以相同的方法純化之（如圖 4-5）。

第三節 以 BIA 的 SPR 技術偵測 MutS 及 MutS 變異蛋白與 AdoCb1 及 AdoCbi 間之結合反應之研究

3-1 儀器：

1.BIAcoreX，Pharmacia 公司

3-2 材料與試劑：

1.sensor chip CM5 2.HBS buffer

3.N-ethyl-N-(3-diethlaminopropyl) carbodimide (EDC) 4.N-hydroxy succinimide（NHS）

5.Ethanolamine hydrochloride

以上材料、試劑均構自 Pharmacia 公司

6.Adenosylcobalamin (AdoCb1) ，購自 Sigma 公司

7.Adenosylcobalamin analog (AdoCbi) ，由南京大學化學系陳慧蘭教 授合成

8.Tris 緩衝劑 pH 8.5，購自 USB 公司

3-3 實驗方法

3-3-1 將 MutS 固定於感應晶片 CM5

將 BIAcore定溫於 25℃，且維持在恆定流速 5μl/min 的 HBS buffer 中，再將比例為 1：1（volume/volume）的 0.05M NHS 和 0.2M EDC 混合液用 votex 混合均勻，注入感應晶片 7 分鐘，目的是為了使晶片 上面的 -COOH 基活化，完全活化後必須在 3 分鐘內注入 50mM 的 蛋白質（蛋白質以 50 mM 磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 內含 1mM DTT buffer 稀釋），經 10 分鐘後即可獲得表層固定有蛋白質之感應晶片，此時可 視 RU 的上升值而決定是否需在注入蛋白質，否則就必須做覆蓋的動 作，即注入 0.1M Ethanolamine hydrochloride 7 分鐘來覆蓋住為與蛋白 質結合之具有活性的-COOH 基。每一種蛋白質皆以此法固定於感應 晶片上，如此即可獲得 4 片分別固定有 MutS、MutS-D14N、

MutS-D14A、MutS-H16G 之感應晶片。以 MutS 為例，如圖 4-6 所示。

3-3-2 MutS 與 AdoCb1 之結合反應測試

將 BIAcore 定溫於 25℃，將流速設定為 5μl/min，以 50mM 磷酸 鉀緩衝液 PH 7.0 內含 1 mM DTT 沖提。此實驗必須在暗房下進行。

將 AdoCbl 以同一磷酸鉀緩衝液做連續稀釋（500, 400, 300, 200, 100 μM），從高濃度的 AdoCb1 開始注入至已固定有 MutS 之感應晶片 中，運用 BIAcore 即時監測並分析 AdoCb1 與 MutS 的結合情形。

於每次測試完畢後並不需要注入任何再生溶液，只需運用 buffer 反覆沖洗即可恢復至原來的起始狀態。

3-3-3 MutS 與 AdoCbi 之結合反應測試

方法同上，但將 AdoCb1 改成 AdoCbi，並以同一磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 做連續稀釋（150, 100, 50, 25, 10μM），從高濃度的 AdoCbi 開始 注入至已固定有 MutS 之感應晶片中；再改將 BIAcore 維持在恆定流 速 5μl/min 的 pH=8.5 Tris 緩衝液 50 mM 內含 1mM DTT 中，並將另 一系列 AdoCbi以同一 Tris 緩衝液做連續稀釋（500, 400, 300, 200, 100 μM），也是從高濃度的 AdoCbi 開始注入至已固定有 MutS 之感應晶 片中，最後運用 BIAcore 即時監測並分析 AdoCbi 在不同濃度與不同 pH 值下與 MutS 的結合情形。

3-3-4 MutS 變異蛋白與 AdoCbi 之結合反應測試

方法同上，將 AdoCbi 以同一磷酸鉀緩衝液 pH 7.0 與 Tris 緩衝液 pH 8.5 做兩組連續稀釋（400, 300, 200, 100, 50μM），從高濃度的 AdoCbi 開 始 分 別 注 入 已 固 定 有 MutS-D14N 、 MutS-D14A 、 MutS-H16G 之感應晶片中，運用 BIAcore 來監測並分析 AdoCbi 不同 濃度以及不同 pH 值下與 MutS 變異蛋白：MutS-D14N、MutS-D14A、

MutS-H16G 之間的結合情形。